Summary
We tonen een microfluïdische platform met een geïntegreerde oppervlakte-elektrode netwerk resistieve pulse sensing (RPS) met code division multiple access (CDMA) combineert, om detectie en afmeting van deeltjes in meerdere microkanalen multiplexen.
Abstract
Microfluïdische verwerking van biologische monsters meestal gaat differentiële manipulaties van zwevende deeltjes onder verschillende krachtvelden om ruimtelijk fractioneren van het monster op basis van een biologische eigenschap van belang. Voor de resulterende ruimtelijke verdeling worden gebruikt als assay uitlezing worden microfluïdische inrichtingen vaak microscopisch onderzoek vereisen complexe instrumentatie met hogere kosten en lagere draagbaarheid. Om deze beperking te pakken, hebben we een geïntegreerd elektronisch sensortechnologie ontwikkeld voor gemultiplexte detectie van deeltjes op verschillende locaties op een microfluïdische chip. Onze techniek, genaamd microfluïdische CODES combineert resistief Pulse Sensing met Code Division Multiple Access 2D ruimtelijke informatie te comprimeren tot een 1D elektrisch signaal. In deze paper presenteren we een praktische demonstratie van de microfluïdische CODES technologie op te sporen en de omvang gekweekte kankercellen verdeeld over meerdere microfluïdische kanalen. Alsgevalideerd door de snelle microscopie, het technology nauwkeurig analyseren dichte celpopulaties alle elektronisch zonder de noodzaak van een extern instrument. Als zodanig kunnen de microfluïdische CODES bijdragen dat goedkope geïntegreerde lab-on-a-chip apparaten die zijn zeer geschikt voor de point-of-care tests van biologische monsters.
Introduction
Nauwkeurige detectie en analyse van biologische deeltjes zoals cellen, bacteriën of virussen gesuspendeerd in vloeibaar is van groot belang voor diverse toepassingen 1, 2, 3. Goed overeenkwamen groot, microfluïdische apparaten bieden unieke voordelen hiervoor zoals hoge gevoeligheid, zachte monster manipulatie en goed gecontroleerde micro 4, 5, 6, 7. Bovendien kan microfluïdische inrichtingen worden ontworpen om een combinatie van vloeistofdynamica en krachtvelden gebruiken om passief fractioneren een heterogene populatie van biologische deeltjes op basis van verschillende eigenschappen 8, 9, 10, 11, 12. In deze inrichtings, kan de resulterende deeltjesverdeling als uitlezing maar ruimtelijke informatie is typisch alleen toegankelijk via microscopie, beperken de praktische bruikbaarheid van het microfluïdische apparaat door te koppelen aan een labinfrastructuur. Daarom is een geïntegreerde sensor die gemakkelijk kunnen melden tijdruimtelijk mapping deeltjes ', zoals ze worden gemanipuleerd op een microfluïdische apparaat, kan ertoe bijdragen dat low-cost, geïntegreerde lab-on-a-chip apparaten die bijzonder aantrekkelijk voor het testen van monsters in mobiel zijn , met beperkte middelen.
Dunne film elektrodes zijn gebruikt als geïntegreerde sensoren microfluïdische inrichtingen voor verschillende toepassingen 13, 14. Resistive Pulse Sensing (RPS) is met name aantrekkelijk voor geïntegreerde detectie van kleine deeltjes in microfluïdische kanalen want het biedt een robuuste, gevoelige en high-throughput detectie mechanisme rechtstreeks van elektrische metingen 15. In RPS, de modulatie impedantie tussen een paar elektroden, ondergedompeld in een elektrolyt wordt gebruikt als middel om een deeltje te detecteren. Wanneer het deeltje passeert door een opening, in de orde grootte van het deeltje, het aantal en de amplitude van kortstondige pulsen in de elektrische stroom worden gebruikt om deeltjes te tellen en grootte, respectievelijk. Bovendien kan de sensor geometrie worden ontworpen met een fotolithografische resolutie in vorm resistieve pulsgolfvormen om gevoeligheid 16, 17, 18, 19 te verbeteren of verticale positie van deeltjes schatten microkanalen 20.
We hebben onlangs een schaalbare en eenvoudige multiplex resistieve pulse sensing technologie genaamd microfluïdische Coded Orthogonal Detectie door Electrical Sensing (microfluïdische CODES) 21. Microfluïdische CODES berust op eenverbindingsnetwerk weerstandsmateriaal pulssensoren, elk bestaande uit een reeks elektroden micromechanische geleiding moduleren op een unieke, onderscheidbare wijze, zodat multiplexing mogelijk. We hebben specifiek elke sensor orthogonale elektrische signalen vergelijkbaar met de digitale codes gebruikt code division multiple access produceren 22 (CDMA) telecommunicatienetwerken, zodat afzonderlijke resistieve sensor signaal uniek kan worden teruggewonnen uit een enkelvoudige golfvorm, wanneer de signalen van verschillende sensoren bemoeien. Zo onze technologie comprimeert 2D spatiale informatie van deeltjes in een elektrisch signaal 1D, waardoor monitoring van deeltjes op verschillende locaties op een microfluïdische chip, terwijl zowel apparaat- en systeemniveau complexiteit tot een minimum.
In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor experimentele en computationele methoden noodzakelijk de microfluïdische CODES technologie, en representative resultaten afkomstig is van in gesimuleerde analyse van biologische monsters. Met de resultaten van een prototype apparaat met vier gemultiplexte sensoren als voorbeeld de techniek uit te leggen, bieden we protocollen op (1) de microfabricage proces microfluïdische inrichtingen de microfluïdische CODES technologie, (2) de beschrijving van de experimentele opstelling inclusief creëren elektronische, optische en vloeibare hardware, (3) de computer algoritme voor het decoderen van storende signalen van verschillende sensoren, en (4) de resultaten van de detectie en analyse van kankercellen in microkanalen. Wij geloven dat het gebruik van de gedetailleerde protocol beschreven, kunnen andere onderzoekers onze technologie toe te passen voor hun onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp van Coding Elektroden
Opmerking: Figuur 1a toont de 3-D structuur van het micropatterned elektroden.
- Ontwerp een set van vier 7-bit Gold codes voor het coderen van de microfluïdische kanalen 23.
- Construct twee lineaire feedback shift-registers (LFSR's), die elk een primitief polynoom.
- Gebruik de LFSR een geprefereerde paar 7-bit m -sequences genereren.
- Cyclisch verschuiven de voorkeur paar m -sequences en voeg ze in mod 2 tot en met vier verschillende Gold codes te genereren.
- Ontwerp de de coderende elektroden (Figuur 1b).
- Plaats drie elektroden terminals, die de positieve, negatieve en referentie-elektroden op drie hoeken.
- Route positieve en negatieve elektrode sporen aan tegenovergestelde zijden van elke microfluïde kanaal.
- Verleng positieve en negatieve elektroden in demicrofluïdische kanalen als elektrode vingers, naar aanleiding van de unieke toegewezen Gold code (figuur 1c).
- Plaats de referentie-elektrode tussen de positieve en negatieve elektrode vingertoppen.
- Plaats positieve en negatieve elektrode sporen ver van de buitenste vingers referentie-elektrode om elektrische geleiding buiten het coderende gebied te minimaliseren.
2. Microfabricage van oppervlakte-elektroden
Opmerking: Figuur 2b toont het fabricageproces van oppervlakte-elektroden.
- Schoon een 4-inch borosilicaatglas wafer in een Piranha-oplossing (98% zwavelzuur: 30% waterstofperoxide = 5: 1) bij 120 ° C gedurende 20 min om alle organische verontreinigingen. Plaats de wafer op een 200 ° C hete plaat gedurende 20 minuten om de resterende water te verwijderen.
- Breng de wafer naar een spinner. Verdeel 2 mL negatieve fotoresist op de wafel en de wafel draaien met een snelheid van 3, 000 rpm gedurende 40 s gelijkmatig bekleden van de wafer met een 1,5-um fotolaklaag.
- Plaats de wafer op een 150 ° C hete plaat en bak de gesponnen fotolak gedurende 1 minuut.
- Expose de fotoresist tot 365-nm UV-licht (225 mJ / cm2) door middel van een chromen masker met behulp van een masker aligner.
- Plaats de wafer op een 100 ° C hete plaat en bak de blootgestelde fotoresist gedurende 1 minuut.
- Ontwikkelen van de fotoresist door onderdompeling van de wafer in een fotolak ontwikkelaar (RD6) gedurende 15 s. Voorzichtig spuiten gedeïoniseerd (DI) water en was de wafer. Droog door te blazen gecomprimeerd stikstof.
- Plaats de wafer met gedessineerde fotolak in een e-beam metal verdamper, en een 20-nm dikke chroom film, gevolgd door een 80-nm-dikke gouden film deponeren op de wafer op een basis druk van 3 × 10 -6 Torr met een afzettingssnelheid van 1 a / s.
- Dompel het met metaal beklede wafer in aceton in een ultrasoon bad, ingesteld op een frequentie van 40 kHz met 100% amplitude gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur temperARD om de onderliggende fotoresist etsen en voltooi de lift-off proces.
- Snijd de wafer in kleinere stukken met een conventionele in blokjes snijden zaag.
3. Fabricage van de SU-8 Mold voor microkanalen
Opmerking: Figuur 2a toont het vervaardigingsproces van de matrijs voor microkanalen.
- Reinigen en bak een 4-inch silicium wafer met behulp van dezelfde procedure in 2.1 beschreven.
- Breng de wafer naar een spinner. Pour 4 ml fotoresist op de wafer. Vacht van de wafer met fotolak.
- Spin de wafer bij 500 rpm gedurende 15 s.
- Spin de wafer bij 1000 rpm gedurende 15 s.
- Spin de wafer bij 3000 rpm gedurende 60 s een uniform gecoate 15-pm dikke fotoresistlaag verkrijgen.
- Plaats de wafer open op een cleanroom veeg gedrenkt in aceton en verwijder de resterende fotolak van de achterkant en de randen van de wafer.
- Overdracht van de wafer op een hete platen voor zacht bakken. Eerst, bak de wafer bij 65 ° C gedurende 1 min. Dan snel de wafer te verplaatsen naar een 95 ° C hete plaat en bak gedurende 2 minuten.
- Expose de fotoresist tot 365-nm UV-licht (180 mJ / cm2) door middel van een chromen masker met behulp van een masker aligner.
- Bak de wafer na blootstelling bij 65 ° C gedurende 1 minuut en vervolgens bij 95 ° C gedurende 2 minuten.
- Dompel de wafer in de ontwikkelaar en zachtjes de container te schudden gedurende 3 minuten. Vervolgens, spoel de wafer met isopropanol (IPA) en drogen door blazen samengeperste stikstof. Als een wit-gekleurde residu op de wafer wordt weergegeven, ondergedompeld in de ontwikkelaar opnieuw en te ontwikkelen voor langere tijd en droog.
- Bak de wafer op een 200 ° C hete plaat gedurende 30 minuten om het te drogen.
- Meet de dikte van de gevormde fotoresist met een profilometer op verschillende locaties in de wafel uniformiteit.
- Silaniseren de mal wafer door gebruikmaking van de techniek van opdampen. Voeg 200 ul van trichlorosilane in een petrischaal en plaats in een vacuümexsiccator, samen met de SU-8 mal wafer gedurende 8 uur.
4. Montage van de microfluïdische CODES Device
- Plaats de 4-inch silicium wafer met de mal in een 150 mm diameter petrischaal, en zet het vast door het vastbinden van de randen.
- Meng de polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeer en verknopingsmiddel in een verhouding van 10: 1, en giet 50 g van het mengsel in de petrischaal. Plaats de petrischaal in een vacuümexsiccator ontgassen van het mengsel gedurende 1 uur en vervolgens genezen in een oven bij 65 ° C gedurende ten minste 4 uur (Figuur 2a).
- Knip de uitgeharde PDMS laag met behulp van een scalpel en afschilferen de mal wafer met behulp van een pincet. De grootte van het proof-of-principle inrichting ongeveer 20 mm x 7 mm. punch dan gaten met een diameter van 1,5 mm door het PDMS voor de inlaat en uitlaat van de microfluïdische kanaal met een biopsie perforator.
- Reinig de patroon van het PDMS deel door het plaatsen van it op een clean-room plakband.
- Reinig de glazen substraat met oppervlakte-elektroden door het te spoelen met aceton, IPA, DI-water en droog met samengeperste stikstof.
- Activeer de oppervlakken van PDMS en glazen substraat zuurstofplasma gedurende 30 s bij de microschaal bewerkte zijde van elk deel naar boven in een RF plasmagenerator gesteld op 100 mW.
- Lijn de PDMS microfluïdische kanalen met oppervlakte-elektroden op het glazen substraat met een optische microscoop en breng de plasma geactiveerde oppervlakken in fysiek contact.
- Bak het apparaat op een 70 ° C hete plaat gedurende 5 minuten, met de glazen kant van de hete plaat.
- Sluit de contactvlakken van de elektroden met draden gesoldeerd.
5. Bereiding van Simulated Biological Sample
- Cultuur HeyA8 humaan ovarium kankercellen in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine in 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° Ctotdat ze 80% samenvloeiing.
- Zuig het materiaal uit de kolf met een glazen pipet. Doseren en vervolgens zuig 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om de cellen te wassen.
- Incubeer cellen in 2 ml 0,05% (w / v) oplossing trypsine gedurende 2 minuten bij 37 ° C om hechtende cellen te schorten. Vervolgens wordt 4 ml van het kweekmedium om de trypsine te neutraliseren.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 100 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren in een reageerbuis. Dan, aspireren supernatant volledig.
- Resuspendeer de cellen in 1-2 ml 1x PBS door zachtjes en neer te pipetteren mechanisch dissociaat cel klonten.
- Teken een kleine hoeveelheid celsuspensie in een pipet en tel het aantal cellen met behulp hemocytometer.
- Verdun de celsuspensie met PBS om een monster te bereiden met uiteindelijke celconcentratie van 10 5 -10 6 cellen / ml.
6. Het uitvoeren van de microfluïdische CODES Device
Opmerking: Figuur 3 toont de experimentele opstelling.
- Plaats het microfluïdische apparaat CODES op het podium van een optische microscoop.
- Breng een 400 kHz sinusgolf met de referentie elektrode op de chip met behulp van elektronische functiegenerator.
- Sluit positieve en negatieve meetelektroden twee onafhankelijke trans-impedantie versterker om stroomsignalen spanning signalen omzetten van elkaar.
- Trek de positieve meetelektrode spanningssignaal van de negatieve meetelektrode spanningssignaal via een differentiële spanning versterker om een bipolair signaal te verkrijgen.
- Gebruik een high-speed camera om optisch opname werking van het apparaat voor de validatie en karakterisatie doeleinden.
- Rijd de cel suspensie door de microfluïdische CODES apparaat bij een constante stroomsnelheid (50-1000 ul / h) met behulp van een injectiepomp.
- Meet de impedantie modulatiesignaal met een invangversterker.
- Sluit de verwijzing AC signaal naar de reference ingang van de invangversterker. Sluit het differentieel bipolair signaal naar de invangversterker als ingangssignaal.
- Verkrijgen van de RMS-amplitude van het differentiële signaal van de invangversterker output.
- Proef de lock-in versterker uitgangssignaal bij 1 MHz snelheid in een computer door middel van een data-acquisitie board voor verdere analyse.
7. Verwerking van sensorsignalen
- Transfer opgenomen elektrische gegevens in MATLAB voor post-processing en decoderen.
- Filtreer het opgenomen signaal in het digitale domein met een Butterworth filter (MATLAB ingebouwde functie) om de hoogfrequente ruis (> 2,5 kHz) te verwijderen.
- Genereer een sjabloon code bibliotheek van de sensor signalen.
- Identificeer representatieve niet-overlappende codesignalen corresponderend met elke sensor in het apparaat en extraheer deze signaalblokken uit de dataset als afzonderlijke golfvorm vectoren.
- Normaliseren elk template code waveform vectordoor zijn kracht. Gebruik het MATLAB ingebouwde functie (bandpower) om het signaalvermogen gemeten.
- Gebruik MATLAB-functie (resample) om de template bibliotheek uitbreiden door digitaal te creëren versies van genormaliseerde codesignalen met verschillende looptijden op variaties in de cel stroomsnelheid over de elektroden tegemoet te komen.
- Identificeer de signaalblokken die overeenkomen met activiteitssensor (drempel: SNR> 12 dB) in het gefilterde golfvorm. Waveform met SNR onder de drempel zou worden behandeld als ruis.
- Decoderen individuele blokken sensoractiviteit in het opgenomen signaal met behulp van een iteratief algoritme, gebaseerd op de achtereenvolgende interferentieopheffing, een techniek die gewoonlijk in multi-user CDMA communicatienetwerken 24, 25.
- Bereken kruiscorrelatie van elk signaalblok van alle sjablonen in de bibliotheek met behulp van glijdende inwendig product.
- Identificeer de sjabloon dat de larg produceertest auto-correlatiepiek aan de dominante individuele sensor code signaal te bepalen. Noteer de tijd en amplitude van de autocorrelatie piek.
- Construct een schatting sensor codesignaal door het schalen van de geïdentificeerde code template op basis van de gemeten autocorrelatie piek amplitude en timing informatie (bepaald in stap 7.5.2).
- Aftrekken van de geschatte sensorcode signaal van de oorspronkelijke gegevens.
- Herhalen van het proces van 7.5.1, totdat het residusignaal geen signaal in de sjabloonbank, wiskundig gedefinieerd als de correlatiecoëfficiënt minder dan 0,5 niet lijken.
- Verfijn eerste sensorsignaal schattingen uit stap 7.5 met behulp van een optimalisatieproces.
- Reconstrueren signaal door toevoeging geraamde sensorsignalen van elke iteratie.
- Vegen de amplitude, de duur en de timing van de individuele sensor signalen rond de oorspronkelijke ramingen voor de beste pasvorm met het opgenomen elektrisch signaal te producerenop basis van de kleinste kwadraten harmonisatie 26.
- Omzetten amplitudes van de geschatte sensor signalen in cel grootte door het kalibreren van elektrische signalen tegen optische beelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een microfluïdische inrichting CODES met vier sensoren verdeeld over vier microkanalen wordt getoond in figuur 1b. In dit systeem is de doorsnede van elk microfluïde kanaal is gemaakt nabij de grootte van een cel, zodat (1) meerdere cellen kan niet via elektroden parallel en (2) cellen blijven nabij de elektroden verhogen van de gevoeligheid passeren . Elke sensor is ontworpen om een unieke 7-bit digitale code te genereren. De inrichting werd vervolgens getest met een celsuspensie. Geregistreerde elektrische signalen die overeenstemmen met vier afzonderlijke sensoren zijn getoond met bijbehorende ideale digitale codes in figuur 4. Geregistreerde signalen nauw overeen met het ideale rechthoekimpulsen, terwijl kleine afwijkingen bestaan. Dergelijke afwijkingen overeenstemt met een combinatie van verschillende factoren, waaronder de niet-uniform elektrisch veld tussen coplanaire elektroden, het koppelen tussen verschillende paren elektroden, bolvormigecellen, alsook de constante stroomsnelheid van cellen in microkanalen. We hebben een sjabloon bibliotheek op basis van het opnieuw gecodeerd sensor signalen. Door het correleren van de geregistreerde signalen met alle templates in de bibliotheek bepaalden we een sjabloon dat de maximale autocorrelatie piek (figuur 4). De digitale codes microkanalen zijn ontworpen loodrecht op elkaar te zijn, kan een overheersende auto-correlatiepiek krachtiger worden geïdentificeerd in dit proces. Met deze aanpak konden we computationeel de microfluïdische kanaal de cel gepasseerd via de duur van het sensorsignaal, en dus de stroomsnelheid van de cel te bepalen.
De microfluïdische CODES technologie kan situaties op te lossen wanneer meerdere cellen tegelijk interageren met codering elektroden. Wanneer dergelijke overlappingen voordoen, de signalen van individuele sensoren bemoeien en de resulterende golfvorm gemakkelijk kan niet worden geassocieerd met eenéén sjabloon overeenstemt met een bepaalde sensor. Nauwkeurig decoderen van dergelijke signalen overlapping is met name belangrijk voor een betrouwbare verwerking van high-density samples, waar de storingen zijn vaker optreden. Los dit overlappende gebeurtenissen, ontwikkelden we een iteratief algoritme gebaseerd op een opeenvolgende storingsonderdrukking (SIC) regeling 24, 25 die gewoonlijk wordt gebruikt voor multi-user detectie in CDMA communicatienetwerken. Figuur 5 laat zien hoe de SIC algoritme bij het oplossen van een golfvorm die voortvloeide uit vier overlappende cellen in vier verschillende microfluïdische kanalen wordt uitgevoerd. In elke iteratie we eerst bepaald de dominante auto-correlatie piek (figuur 5a, 2e kolom), overeenkomend met de sterkste interferentiesignaal, door het correleren van de ingangsgolfvorm (figuur 5a, Kolom 1) met de sjabloonbibliotheek. Op basis van de geselecteerde template en tde daaruit voortkomende auto-correlatie amplitude, we vervolgens naar schatting de sterkste storende signalen (Figuur 5a, 3e kolom) en afgetrokken uit de input golfvorm. De resterende golfvorm werd doorgegeven aan de volgende iteratie als ingang. Deze werkwijze voortgezet totdat de correlatie van het residusignaal met sjabloonbibliotheek veroorzaakte geen duidelijke autocorrelatie piek (figuur 5a, 5 ste rij, 2e grondstuk). Na beëindiging van de storingsonderdrukking proces gereconstrueerd we een schatting van de golfvorm door het combineren benaderende signalen van elke iteratie (figuur 6a). Middels een optimalisatieproces basis van een kleinste kwadraten om de gemiddelde kwadratische fout tussen het oorspronkelijke golfvorm en het gereconstrueerde signaal te minimaliseren, we bijgewerkt onze schattingen voor de amplitude, duur en relatieve timing van afzonderlijke sensor codesignalen (figuur 6b). Ook de grootte van geschattede cellen gedetecteerd op basis van de amplitude van de geraamde sensorsignalen. Hiervoor we geijkte het elektrische signaal amplituden met optisch gemeten celgroottes behulp van lineaire regressie (figuur 6b). Een vergelijking van de resultaten van de microfluïdische CODES met de resultaten van de simultaan opgenomen snelle microscoopbeelden informatie blijkt dat de grootte en snelheid cel nauwkeurig kan worden gemeten, waarbij de resultaten (Tabel 1) valideert. Figuur 6c toont het gelijktijdig opgenomen beeld high-speed microscopie gebruikt voor het valideren van het decoderen resultaat.
Om de reproduceerbaarheid van de resultaten en ook de prestaties van de microfluïdische CODES technologie voor een high-throughput monster verwerking tonen, analyseerden we elektrische signalen overeenstemmend met> 1000 cellen. De signalen werden automatisch in MATLAB gedecodeerd door het uitvoeren van het algoritme uitgelegdboven en de nauwkeurigheid van onze resultaten werd beoordeeld door onze resultaten direct te vergelijken met optische gegevens van simultaan opgenomen high-speed video. Onze analyse toont dat elektrische signalen van 96,15% van de cellen (973/1012) correct gedecodeerd. Slagingspercentage voor het decoderen van niet-overlappende en overlappende cel signalen 98,71% (688/697) en 90,48% (285/315) resp.
Figuur 1. Ontwerp van de vier-kanaals microfluïdische CODES apparaat. (A) elektroden in elk microfluïdische kanaal micropatterned om een unieke digitale code te genereren. De impedantie modulatie door sequentiële interacties van stromende cellen met elektrodeparen leidt tot elektrische pulsen. (B) Een microscoop beeld van de microfluïdische CODES apparaat. Tijdens het fabricageproces wordt glassubstraat met coderende oppervlakte-elektroden uitgelijnd met PDMS microfluïdische kanalen onder een microscoop. (C) Een close-up beeld van gecodeerde oppervlakte-elektroden produceren van 7-bit Gold sequenties: '1010110', '0111111', '0100010', '0011000'. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Microfabricage proces. (A) De PDMS microfluïdische kanalen worden vervaardigd met behulp van zachte lithografie 27. (B) Het oppervlak elektroden worden vervaardigd met behulp van een lift-off proces. (C) een schematisch dwarsdoorsnede van de uiteindelijke inrichting. PDMS microfluïdische kanalen zijn uitgelijnd en verbonden met het glassubstraat met oppervlakte-elektroden. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Experimentele setup. Met behulp van een injectiespuit pomp, wordt de celsuspensie lopen door de microfluïdische CODES apparaat bij een constante stroomsnelheid. Een 400 kHz AC signaal op de referentie-elektrode met een functiegenerator. Stroomsignalen van positieve en negatieve meetelektroden worden eerst omgezet in spanningssignalen met twee transimpedantieversterkers en afgetrokken van elkaar met behulp van een differentiële versterker. Het verschil bipolair signaal wordt geëxtraheerd met een invangversterker en bemonsterd in een computer voor de signaalverwerking en decoderen. Snelle optische microscopie gebruikt om optisch opname werking van de inrichting voor validatie en karakterisatie doeleinden.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Opgenomen elektrische signalen van individuele sensoren en hun correlaties. Opgenomen signalen en hun correlatie met elkaar worden gegeven voor vier code-multiplex resistieve pulse sensoren. Respectievelijk sensor 1 (a), sensor 2 (b), sensor 3 (c) en sensor 4 (d) werden ontworpen om 7-bits digitale golfvormen "1.010.110", "0.111.111", "0.100.010" en "0011000" . Voor elke sensor, de bovenste figuur blijkt dat genormaliseerde geregistreerde signaal van elke sensor nauw overeenkomt met het ideale blokgolf sequentie dat de sensor is ontworpen om te produceren. Voor elke sensor, toont het onderste paneel opgenomen sensorsignaal9; s autocorrelatie en kruiscorrelatie met corresponderen met drie code-gemultiplexte sensoren in het netwerk. In alle gevallen kan een autocorrelatie piek krachtiger worden geïdentificeerd omdat de digitale codes van afzonderlijke sensoren zijn ontworpen loodrecht op elkaar zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Het decoderen van een overlappende golfvorm met opeenvolgende interferentie annulering. In elke iteratie wordt de ingangsgolfvorm (Kolom 1) gecorreleerd met de voorgemonteerde sjabloonbibliotheek de specifieke template die resulteert in de maximale correlatie amplitude (2e kolom) te identificeren. Met deze specifieke sjabloon, wordt de sterkste interferentiesignaal geschat op basis van de amplitudeen tijdinformatie van de correlatiepiek (3e kolom). Het geschatte signaal wordt dan afgetrokken van de oorspronkelijke golfvorm effectief annuleren van de sterkste interferentie vanwege de grootste cel. Het proces wordt herhaald totdat er geen correlatiepiek kan worden bepaald (bijv correlatiecoëfficiënt <0,5) in het residusignaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. decodeerresultaat analyse. (A) Vermoedelijke signalen worden verfijnd op basis van een optimalisatie algoritme dat streeft naar de beste fit tussen de gereconstrueerde en de oorspronkelijke opgenomen golfvorm met behulp van de kleinste kwadraten benadering te verkrijgen. (B) Na afloop van het optimalisatieproces,de timing en amplitude van geijkte signalen nauwkeurig de cel parameters gemeten door middel van high-speed microscopie. (C) het gelijktijdig opgenomen high-speed microscopie valideert onze resultaten van elektrische metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Meettype | r ch1 (pm) | r ch2 (pm) | r CH3 (pm) | r CH4 (pm) | At 1 (ms) | At 2 (ms) | At 3 (ms) |
| Elektrisch | 8.010 | 6.490 | 5.300 | 6.550 | 0,465 | 1.705 | 0,744 |
| Optisch | 8.320 | 6,770 | 5,680 | 7,040 | 0,375 | 1.625 | 0.750 |
Tabel 1. Vergelijking van elektrisch en optisch gemeten celparameters van figuur 6b. Om onze schattingen te valideren, we optisch gemeten de cel maten imago van de high-speed microscopie uit. Relatieve tijd tussen cellen wordt optisch gemeten van het aantal frames tussen de cellen in de high-speed video opgenomen met 8000 frames per seconde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meervoudige puls resistieve sensoren eerder zijn opgenomen in microfluïdische chips 28, 29, 30, 31, 32. In deze systemen werden resistieve pulssensoren ofwel niet gemultiplext 28, 29, 30, 31 of ze verplicht individuele sensoren op verschillende frequenties 32 aan te drijven. In beide gevallen werden specifieke externe aansluitingen van elke resistieve sensor op de chip en dus een groot aantal sensoren kunnen niet worden opgenomen zonder grotere complexiteit hardware. Het belangrijkste voordeel van microfluïdische CODES is dat het gelijktijdig lezen van meerdere resistieve puls sensors uit een uitgang in een eenvoudige inrichting mogelijk maakt. Wij bereiken dit door gebruik te maken multiplexing technieken vaak gebruikt in telecommunicatie micromachined resistieve puls sensoren geïntegreerd in microfluïdische apparaten te ontwerpen. In wezen onze technologie voert code multiplexing een netwerk van on-chip Coulter tellers door het ontwerpen elk een onderscheiden signaal produceren wanneer een deeltje wordt gedetecteerd. Elke micromachine sensoren in het netwerk uit meerdere coplanaire oppervlakte-elektroden gerangschikt in verschillende configuraties zodat de sequentiële interactie van stromende deeltjes met deze elektroden levert orthogonale modulaties impedantie golfvormen. Asynchrone deeltje-interactie sensor geschikt, we specifiek elke sensor naar Gold codes 33, pseudo-orthogonale digitale codes die doorgaans worden gebruikt bij de uplink van het CDMA telecommunicatienetwerken produceren. Gold codes handhaven van een bepaald niveau loodrechte zelfs wanneer ze worden uitgelijnd met willekeurige faseverschillen 34.
Microfluidic CODES is eenvoudig schaalbaar. Hoewel we de resultaten van een prototype CODES microfluïdische apparaat gepresenteerd met vier sensoren in dit document, kan meer sensors in de inrichting worden opgenomen indien ontworpen om uitgangssignalen te onderscheiden van de rest te produceren. Een manier om de sensor netwerk uit te breiden is om sensoren te ontwerpen op basis van grotere orthogonale code sets met langere digitale codes. Langere orthogonale codes met meer bits bieden een hogere verwerkingsversterking het decoderen en te onderscheiden van elkaar wanneer er interferentie. Anderzijds, meer Gold codes in de inrichting betekent ook grotere aftastvolume, waarbij het verwachte aantal interfererende sensoren toeneemt. Ook het verhogen van het aantal sensoren voor een gegeven monster dichtheid leidt tot meer deeltjes overlappende gevolg van een verhoging van de totale aftastvolume. Als zodanig, de dichtheid van de deeltjes in het monster is een kritische parameter die moet het gebruik van de microfluïdische CODES techniek beschouwd. De maximale partikel dichtheid die kunnen worden opgelost (naar analogie met de kanaalcapaciteit van een CDMA telecommunicatienetwerk) afhankelijk van verschillende factoren zoals de afzonderlijke sensorsignalen en de relatie, de decodeerschema, plaats van de microfluïdische apparaat en het elektronische geluidsniveau. Afhankelijk van de toepassing, kan het monster worden verdund tot een deeltjesdichtheid die een acceptabele foutmarge produceert bereiken.
Vanuit signaalverwerking oogpunt decoderen van tijdgolfvormen van een microfluïdische inrichting niet CODES berekeningsintensief met de huidige systemen, zoals blijkt uit het feit dat mobiele telefoon communicatie op een CDMA netwerk demultiplexeren in real-time. Bovendien is de fysieke gebeurtenissen te decoderen in microfluïdische inrichtingen gebeurt veel langzamer dan bit transmissiesnelheid in GSM communicatie waardoor we meer geavanceerde en tijdrovende algoritmen zoals SIC en een optimalisatie werkwijzen, waarmee we iteratief oplossen overlappende si gebruikengnals van sensoren.
Samengevat microfluïdische CODES is een veelzijdige, schaalbare elektronische sensing technologie die gemakkelijk kan worden geïntegreerd in verscheidene microfluïdische inrichtingen voor kwantitatieve bepalingen realiseren door het volgen van deeltjes van bewerking op de chip. De technologie is zeer eenvoudig te implementeren, omdat (1) het is zeer eenvoudig uit hardware perspectief (2) het rechtstreeks compatibel met de zachte lithografie (3) biedt een directe elektronische uitlezing zonder actieve on-chip componenten, en (4) het berust op eenvoudige algoritmes voor de signaalverwerking en interpretatie van de gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
