Summary
אנו מדגימים פלטפורמת microfluidic עם רשת האלקטרודה משטח משולבת המשלב חישת דופק התנגדות (RPS) עם הגישה מרובה חלוקת קוד (CDMA), לבצע ריבוב איתור אומדת חלקיקי ערוצי microfluidic מרובים.
Abstract
עיבוד microfluidic של דגימות ביולוגיות בדרך כלל כרוך מניפולציות הפרש של חלקיקים מרחפים תחת שדות כוח שונים כדי fractionate מדגם מרחבית על בסיס תכונה ביולוגית של עניין. עבור פריסת המרחבית כתוצאה לשמש את הודעת assay, מכשירי microfluidic לעתים קרובות נאלצים לעבור ניתוח מיקרוסקופי מחייב מכשור מורכב עם עלות גבוהה וניידות מופחתת. כדי לתת מענה על מגבלה זו, פתחנו טכנולוגיית חישה אלקטרונית משולבת לגילוי מרובב של חלקיקים במקומות שונים על שבב microfluidic. הטכנולוגיה שלנו, שנקראה קודי Microfluidic, המשלב חישה דופקת התנגדותי עם מרובי גישת חטיבת הקוד לדחוס מידע 2D מרחבית לתוך אות חשמלי 1D. במאמר זה, אנו מציגים הדגמה מעשית של טכנולוגית קודי Microfluidic כדי לזהות תאים סרטניים בתרבית גודל מפוזרת על פני ערוצי microfluidic מרובים. כפי שמאומת על ידי מיקרוסקופית במהירות גבוהה, הטכנולוגיה שלנו יכולה לנתח אוכלוסיות תאים צפופים במדויק כל אלקטרונית ללא צורך במכשיר חיצוני. ככזה, קודי Microfluidic פוטנציאליים יכולים לאפשר משולבים בעלות הנמוכה מעבדה על שבב התקנים מתאימים גם עבור הבדיקות של טיפול נקודת דגימות ביולוגיות.
Introduction
זיהוי וניתוח מדויק של חלקיקים ביולוגיים כגון תאים, חיידקים או וירוסים מושעים בנוזל הוא עניין רב עבור מגוון רחב של יישומים 1, 2, 3. ובכן, שבמסע גודל, מכשירים microfluidic מציעים יתרונות ייחודיים למטרה זו כגון רגישות גבוהה, מניפולציה מדגם עדין מבוקר היטב microenvironment 4, 5, 6, 7. בנוסף, מכשירי microfluidic יכולים להיות מתוכננים להעסיק שילוב של דינמיקה של נוזלים ושדות כוח כדי fractionate אוכלוסייה הטרוגנית באופן פסיבי של חלקיקים ביולוגיים המבוססים על מאפיינים שונים 8, 9, 10, 11, 12. באותם מכשירהים, חלוקת החלקיקים כתוצאה יכולה לשמש הודעה אך מידע מרחבים זמין בדרך כלל רק באמצעות מיקרוסקופיה, הגבלת השימוש המעשי של מכשיר microfluidic על ידי קשירה אותו לתשתית במעבדה. לכן, חיישן משולב שיכול לדווח מיפוי spatiotemporal 'חלקיקים בקלות, כפי שהם הם מניפולציה במכשיר microfluidic, עלול לאפשר בעלות נמוכה, משולבים מעבדה על שבב התקנים הם אטרקטיביים במיוחד עבור הבדיקות של דגימות ניידות , הגדרות-משאב מוגבל.
אלקטרודות סרט דקות שמשו חיישנים משולבים מכשירי microfluidic עבור יישומים שונים 13, 14. התנגדותי דופק חישה (RPS) הוא אטרקטיבי במיוחד עבור חישה משולבת של חלקיקים קטנים בערוצי microfluidic כפי שהוא מציע מנגנון זיהוי חזק, רגיש, תפוקה גבוהה ישירות מדידות חשמליות 15. ב RPS, אפנון העכבה בין זוג אלקטרודות, שקוע בתוך אלקטרוליט, משמש כאמצעי לגילוי חלקיק. כאשר החלקיק עובר דרך צמצם, בגודל בסדר גודל של החלקיקים, המספר משרעת של פולסים חולפים הזרם החשמלי משמשים לספור חלקיקים בגודל, בהתאמה. יתר על כן, את הגיאומטריה החיישן יכול להיות מתוכנן עם רזולוציה photolithographic לעצב צורות גל הדופק resistive כדי לשפר את הרגישות 16, 17, 18, 19 או להעריך במצב אנכי של חלקיקים ערוצי microfluidic 20.
יש לנו הציג לאחרונה טכנולוגיית חישה הדופק resistive מרובב מדרגי פשוט שנקרא Microfluidic מקודד אורתוגונלית זיהוי על ידי חשמל חישה (קודי Microfluidic) 21. קודי Microfluidic מסתמך עלרשת מקושרת ביניהם של חיישנים דופקים התנגדות, כל אחת בהיקף של מערך של אלקטרודות micromachined לווסת הולכה באופן ייחודי, הבחנה, כדי לאפשר ריבוב. עצבנו כל חיישן במיוחד כדי לייצר אותות חשמליים מאונכים דומים הקודים הדיגיטליים המשמשים גישה מרובה חלוקת קוד 22 (CDMA) רשתות תקשורת, כך אות חיישן דופק התנגדות פרט ניתן לשחזר באופן ייחודי בין צורת גל פלט יחידה, גם אם אותות חיישנים שונים להתערב. בדרך זו, הטכנולוגיה שלנו דוחס מידע מרחבי 2D של חלקיקים לתוך אות 1D חשמל, המתיר ניטור של חלקיקים במקומות שונים על שבב microfluidic, תוך שמירה הן מורכבות התקן, על מערכת ברמה למינימום.
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור שיטות ניסיוניות חישובית צורך להשתמש בטכנולוגית קודי Microfluidic, כמו גם rתוצאות epresentative מהשימוש בנכס בניתוח של דגימות ביולוגיות מדומה. באמצעות התוצאות מהתקן אבטיפוס עם ארבעה חיישנים מרובבים כדוגמא להסביר את הטכניקה, אנו מספקים פרוטוקולים על (1) תהליך microfabrication כדי ליצור התקני microfluidic עם טכנולוגית קודי Microfluidic, (2) התיאור של הגדרת הניסוי כולל חומרה אלקטרונית, אופטית, fluidic, (3) אלגוריתם המחשב עבור פענוח אותות מפריעים מחיישנים שונים, ו- (4) את התוצאות של זיהוי וניתוח של תאים סרטניים ערוצי microfluidic. אנו מאמינים כי באמצעות הפרוטוקול המפורט המתואר כאן, חוקרים אחרים יכולים ליישם את הטכנולוגיה שלנו למחקר שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עיצוב 1. של אלקטרודות Coding
הערה: איור 1 א מציג את מבנה 3-D של אלקטרודות micropatterned.
- לעצב סט של ארבעה קודי זהב 7 סיביים לקידוד ערוצי microfluidic 23.
- לבנות שתי משמרת-אוגרים משוב ליניארי (LFSRs), שכל אחד מהם מייצג פולינום פרימיטיבי.
- השתמש LFSRs כדי לייצר זוג עדיף של -sequences 7 הסיבי מ '.
- מחזור להעביר את הזוג העדיף של -sequences מ ולהוסיף אותם mod 2 ליצור ארבעה קודי זהב ברורים.
- לעצב את הפריסה של אלקטרודות קידוד (איור 1b).
- מניחים בשלושה טרמינלים אלקטרודה, המייצג את אלקטרודות חיוביות, שליליות, והתייחסות בשלוש פינות.
- אלקטרודה חיובית ושלילית כביש עקבות משני צדי המתרס של כל ערוץ microfluidic.
- הרחב אלקטרודות חיוביות ושליליות לתוךערוצי microfluidic כאצבעות אלקטרודה, בעקבות קוד זהב באופן ייחודי (איור 1 ג ').
- מניחים את האלקטרודה התייחסות בין האצבעות אלקטרודה חיובית ושלילית.
- מניח עקבות אלקטרודה חיוביות ושליליות הרחק אצבעות אלקטרודה השוואתית החיצוניות על מנת למזער הולכה חשמלית מחוץ לאזור הקידוד.
Microfabrication 2. של אלקטרודות Surface
הערה: איור 2b מציג את תהליך הייצור של אלקטרודות משטח.
- נקה רקיק זכוכית בורוסיליקט 4 אינץ 'פתרון פיראניה (חומצה גופרתית 98%: מי חמצן 30% = 5: 1) ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להסיר כל המזהמים האורגניים. ואז מניחים את פרוסות על פלטה חשמלית 200 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להסיר שאריות מים.
- מעבירים את רקיק הצנטריפוגה. לוותר על 2 photoresist מ"ל שלילית על גבי פרוסות סיליקון ספין רקיק במהירות של 3סל"ד, 000 עבור 40 שניות כדי מעיל באופן אחיד את פרוסות עם שכבת photoresist 1.5 מיקרומטר.
- מניח את הפרוסות על צלחת 150 ° C חמה ואופי photoresist הסתחרר דקות 1.
- לחשוף את photoresist לאור UV 365 ננומטר (225 mJ / 2 ס"מ) באמצעות מסכה כרום באמצעות aligner מסכה.
- מניח את הפרוסות על צלחת 100 ° C חמה ואופי photoresist נחשף דקות 1.
- לפתח את photoresist על ידי טבילת רקיק מפתח photoresist (RD6) במשך 15 שניות. בעדינות לרסס ללא יונים (DI) מים לשטוף את פרוסות סיליקון. ניקוי על ידי נושב חנקן דחוס.
- מניחים את פרוסות עם photoresist בדוגמת לתוך המאייד מתכת הקורה אלקטרוני, וכן להפקיד סרט כרום 20 ננומטר בעובי, ואחריו סרט זהב 80 ננומטר בעובי על גבי פרוסות סיליקון בלחץ בסיס של 3 × 10 -6 Torr עם שיעור בתצהיר של 1 A / s.
- לטבול את פרוסות סיליקון מצופה מתכת לתוך אצטון ב סט באמבטיה קולי בתדר של 40 kHz עם משרעת 100% למשך 30 דקות ב המזג בחדרature כדי לחרוט את photoresist הבסיסית ולהשלים את תהליך ההמראה.
- חותכים את פרוסות לחתיכות קטנות בעזרת מסור חיתוך קונבנציונאלי.
ייצור 3. של עובש SU-8 עבור ערוצי microfluidic
הערה: איור 2 א מראה את תהליך הייצור של העובש עבור ערוצי microfluidic.
- נקי לאפות פרוסות סיליקון 4 אינץ 'תוך שימוש באותו ההליך המתואר 2.1.
- מעבירים את רקיק הצנטריפוגה. יוצקים photoresist מ"ל 4 על גבי פרוסות סיליקון. מעיל רקיק עם photoresist.
- ספין את פרוסות סיליקון ב 500 סל"ד במשך 15 שניות.
- ספין רקיק ב 1000 סל"ד במשך 15 שניות.
- ספין רקיק ב 3000 סל"ד במשך 60 שניות כדי לקבל שכבת photoresist עבה 15 מיקרומטר מצופה באופן אחיד.
- הנח את הפרוסות על חדר נקי, לנגב טבול אצטון להסיר את photoresist שיורית מהישבן והקצוות של הפרוסות סיליקון.
- מעביר את הפרוסות על גבי pl חםאכול לאפייה רכה. ראשית, לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. ואז להעביר במהירות את הפרוסות על פלטה חשמלית 95 מעלות צלזיוס ואופים 2 דקות.
- לחשוף את photoresist לאור UV 365 ננומטר (180 mJ / 2 ס"מ) באמצעות מסכה כרום באמצעות aligner מסכה.
- אופים את החשיפה הבאה פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- לטבול את פרוסות סיליקון ב מפתח ובעדינות לנער את המיכל במשך 3 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את פרוסות עם אלכוהול isopropanol (IPA) ולייבשו ידי נושבת חנקן דחוס. אם משקע לבן בצבע שמופיע על פרוסות סיליקון, לטבול אותו לתוך היזם שוב ולפתח במשך זמן ארוך יותר ויבש.
- אופה את הפרוסות על צלחת 200 ° C חם למשך 30 דקות כדי לייבש אותו לחלוטין.
- מדוד את עובי של photoresist בדוגמת באמצעות profilometer במקומות שונים ברחבי רקיק על מנת להבטיח אחידות.
- Silanize רקיק עובש על ידי ניצול הטכניקה של שיקוע. הוספת 200 μL של TRichlorosilane בצלחת ומניחים פטרי בחלל ריק ייבוש יחד עם פרוסות עובש SU-8 עבור 8 שעות.
4. הרכבה של מכשיר קודי Microfluidic
- מניחים את פרוסות סיליקון 4 אינץ 'עם עובש בצלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ, ולתקן אותה על ידי מקליטה מהשוליים.
- מערבבים את polydimethylsiloxane (PDMS) מראש פולימר מקשר צלב לפי יחס של 10: 1, ויוצקים 50 גרם של תערובת לתוך צלחת פטרי. מניחים את צלחת פטרי בחלל ריק ייבוש דגה את התערובת במשך שעה 1, ולאחר מכן לרפא אותו בתנור על 65 מעלות צלזיוס לפחות 4 שעות (איור 2 א).
- חותכים את שכבת PDMS לריפוי באמצעות אזמל לקלף אותו רקיק מהתבנית בעזרת פינצטה. גודלו של המכשיר הוכחה של העיקרון הוא כ 20 מ"מ × 7 מ"מ. ואז מחוררים בקוטר של 1.5 מ"מ דרך PDMS עבור הכניסה והיציאה של ערוץ microfluidic באמצעות אגרופן ביופסיה.
- נקו את הצד בדוגמת של החלק PDMS ידי הצבת it על קלטת דבק נקי חדרים.
- נקו את מצע זכוכית עם אלקטרודות משטח ידי שטיפה זה עם אצטון, IPA, מים די ולייבש באמצעות חנקן דחוס.
- הפעל את פני השטח של המצע PDMS וזכוכית פלזמה חמצן למשך 30 שניות עם הצד micromachined של כל חלק כלפי מעלה גנרטור פלזמה RF נקבע על 100 mW.
- יישר את ערוץ microfluidic PDMS עם אלקטרודות משטח על מצע זכוכית באמצעות מיקרוסקופ אופטי ולאחר מכן להביא את שני משטחים המופעל פלזמה במגע פיזי.
- אופה את המכשיר על פלטה חשמלית 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, עם צד הזכוכית מול הצלחת החמה.
- חבר את רפידות קשר של אלקטרודות עם חוטים על ידי הלחמה.
5. הכנה של הדגימה הביולוגית הסימולציה
- תרבות תאי סרטן שחלות אדם HeyA8 ב RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין ב 5% CO 2 אווירה על 37 מעלות צלזיוסעד שהם מגיעים למפגש 80%.
- לשאוב התקשורת מבקבוק התרבות באמצעות פיפטה מזכוכית. לוותר ואז פוספט 1x לשאוב בופר (PBS) כדי לשטוף את התאים.
- דגירת תאים 2 מיליליטר 0.05% (w / v) פתרון טריפסין במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס להשעות תאים חסידים. לאחר מכן, להוסיף 4 מ"ל של התקשורת והתרבות על מנת לנטרל את טריפסין.
- צנטריפוגה השעית התא גרם 100 × 5 דקות עד גלולת התאים במבחנה. ואז, לשאוב supernatant לחלוטין.
- Re- להשעות את התאים 1-2 מ"ל 1x PBS על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי גושי תאים לנתק באופן מכני.
- צייר כמות קטנה של השעיה התא לתוך פיפטה ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer.
- לדלל את ההשעיה תא עם PBS להכין מדגם עם ריכוז התא הסופי של 10 5 -10 6 תאים / מ"ל.
6. הפעלת התקן קודי Microfluidic
הערה: אלחוטיאיור 3 מציג את הגדרת הניסוי.
- מניחים את המכשיר קודי Microfluidic על הבמה של מיקרוסקופ אופטי.
- החל גל 400 kHz סינוס אל האלקטרודה ההפניה על השבב באמצעות מחולל אותות אלקטרוני.
- חבר אלקטרודות חישה חיובית ושלילית לשני מגברים טרנס-עכבה עצמאיות להמיר אותות נוכחיים מכל לאותות מתח.
- הפחת את אות מתח האלקטרודה חישה החיובית מן אות מתח האלקטרודה חישה השלילית באמצעות מגבר מתח הפרש כדי לקבל אות דו קוטבית.
- השתמש מצלמה במהירות גבוהה לפעולת שיא האופטית של המכשיר לצורכי אימות ואפיון.
- להסיע את השעית התא דרך מכשיר קודי Microfluidic בקצב זרימה קבוע (50-1,000 μL / h) באמצעות משאבת מזרק.
- מדוד את אות אפנון עכבה באמצעות מגבר נעילה.
- חברו את אות AC התייחסות נ"צerence הכניסה של מגבר נעילה. חבור את האות דו קוטבי הפרש למגבר הנעילה כאות קלט.
- השג את משרעת RMS של אות ההפרש מפלט מגבר הנעילה.
- תוכלו לדגום את אות המוצא של מגבר נעילה ב- 1 מגה-הרץ קצב לתוך המחשב דרך בכרטיס איסוף נתונים לניתוח נוסף.
עיבוד 7. של אותות חיישן
- עבר נתוני חשמל רשמו לתוך MATLAB עבור שלאחר עיבוד ופענוח.
- סנן את האות נרשם התחום הדיגיטלי באמצעות מסנן Butterworth (MATLAB מובנית פונקציית) להסיר את הרעש בתדר גבוה (> 2.5 kHz).
- צור ספריית קוד תבנית מתוך אותות החיישן.
- לזהות אותות קוד שאינו חופף נציג המתאים לכל אחד חיישן במכשיר ולחלץ בלוקי אות אלה מן הנתונים כמו וקטורי צורת גל נפרדים.
- נרמל כל וקטור גל קוד תבניתעל ידי כוחה. השתמש MATLAB מובנית פונקציית (bandpower) כדי למדוד את עוצמת האות.
- השתמש בפונקצית MATLAB (דגימה מחדש) כדי להרחיב את ספריית התבנית על ידי יצירת הגירסות הדיגיטלית של אותות קוד מנורמלים עם משתנה משך כדי להכיל וריאציות המהירות זרימת תא מעל האלקטרודות.
- זהה את אובניים האות מתאים פעילות חיישן (סף: SNR> 12 dB) בצורת הגל המסונן. צורת גל עם SNR מתחת לסף לכך יטופל רעש.
- לפענח בלוקים בודדים של פעילות חיישן האות רשמה באמצעות אלגוריתם איטרטיבי המבוסס על ביטול ההפרעה הרצוף, טכניקה המועסקת בדרך כלל ברשתות תקשורת CDMA מרובות משתמש 24, 25.
- חישוב חוצה קשר של כל בלוק אות עם כל התבניות בספרייה באמצעות זזת מוצר נקוד.
- זהה את התבנית שמייצרת את largest שיא אוטומטי מתאם כדי לקבוע את אות קוד חיישן היחידה הדומיננטית. רשום את שניכם הזמן משרעת שיא autocorrelation.
- לבנות אות קוד חיישן האומדן לפי קנה המידה של תבנית קוד לזהות המבוססת על המשרעת שיא autocorrelation מדודה מידע תזמון (נקבע בשלב 7.5.2).
- תפחית את אות קוד חיישן המוערכת מהנתונים המקוריים.
- לחזר את התהליך 7.5.1, עד האות שיורית לא דומה לאף אות בספריית תבנית, מוגדר מתמטית בתור מקדם המתאם להיות פחות מ -0.5.
- מקד את הערכות אות חיישן ראשוניות משלב 7.5 באמצעות תהליך של אופטימיזציה.
- משחזר את האות על ידי הוספת אותות חיישן יחידים מוערכים מכל איטרציה.
- טאטא את המשרעת, משך ותזמון של אותות חיישן בודדים ברחבי לאומדנים המקוריים לייצר את ההתאמה הטובה ביותר עם האות החשמלי נרשםמבוסס על מינימום ריבועים קירוב 26.
- המרת אמפליטודות של אותות חיישן מוערכים לתוך גודל תא על ידי כיול אותות חשמליים נגד תמונות אופטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכשיר קודי Microfluidic מורכב מארבעה חיישנים מפוזרים על פני ארבעה ערוצי microfluidic מוצג באיור 1b. במערכת זו, בחתך של כל ערוץ microfluidic נועד להיות קרוב בגודל של תאים כך (1) מספר תאים לא יכול לעבור על האלקטרודות במקביל (2) התאים נשארים קרוב אלקטרודות הגדלת הרגישות . כל חיישן נועד ליצור קוד מספרים 7 סיבי ייחודי. המכשיר נבדק ולאחר מכן באמצעות השעית תא. אותות חשמליים קלטות מתאימות ארבעה חיישנים בודדים מוצגים עם קודים דיגיטליים אידיאליים הקשורים באיור 4. אותות הקלטות מתאימים במדויק עם פולסים מרובעים האידיאליים, תוך סטיות קטנות אכן קיימות. חריגה כזו לנבוע משילוב של מספר גורמים כוללים את השדה החשמלי לא אחיד בין האלקטרודות coplanar, צימוד בין זוגות אלקטרודה שונים, צורה כדורית שלתאים, כמו גם את מהירות זרימה מתמדת של תאים ערוצי microfluidic. יצרנו תבנית הספרייה מבוסס על אותות חיישן recoded. באמצעות התאמת האותות רשמו עם כל התבניות בספרייה, קבענו תבנית שהפיקה את השיא אוטומטי מתאם המרבי (איור 4). כמו הקודים הדיגיטליים עבור ערוצי microfluidic נועדו להיות מאונך זה לזה, לשיא אוטומטי קורלציה דומיננטי ניתן היה לזהות וחסונה בתהליך זה. בגישה זו, נוכל מחשוב לקבוע את ערוץ microfluidic התא עבר, את משך הזמן של אות החיישן, ולכן מהירות הזרימה של התא.
טכנולוגית קודי Microfluidic יכולה לפתור מצבים שבהם מספר תאי אינטראקציה בו זמנית עם אלקטרודות קידוד. כאשר חפיפות כאלה מתרחשים, אותות מחיישנים הפרט להתערב וצורת הגל שנוצר לא ניתן לשייך בקלות עם כלתבנית אחת המתאימה חיישן ספציפי. במדויק פענוח אותות חופפים כאלה חשובים במיוחד עבור דגימות צפיפות גבוהה עיבוד אמין, שבו הפרעות נוטות יותר להתרחש. כדי לפתור מאירועים חופפים, פתחנו אלגוריתם איטרטיבי המבוסס על ביטול הפרעה רצוף (SIC) ערכה 24, 25, שלרוב משמשת לגילוי מרובה משתמשים ברשתות תקשורת CDMA. איור 5 מדגים כיצד אלגוריתם SIC מיושם בפתרון צורת גל נובע ארבעה תאים חופפים בארבעה ערוצים microfluidic שונים. בכל איטרציה, אנחנו ראשונים קבענו את השיא אוטומטי מתאם הדומיננטי (איור 5 א, טור nd 2), המקביל ל האות להתערב החזקה, באמצעות התאמת צורת גל הקלט (איור 5 א, 1 טור st) עם תבנית הספרייה. בהתבסס על התבנית הנבחרת ושנאיםהוא כתוצאה משרעת אוטומטי מתאם, אנחנו ואז הערכנו את האות להתערב החזק (איור 5 א, 3 טור rd) ונוכינו אותו מן גלי הקלט. צורת גל הנותרים הועבר איטרציה הבאה כקלט. תהליך זה נמשך עד קורלציה של האות השיורי עם ספריית התבנית לא לייצר שיא אוטומטי מתאם ברור (איור 5 א, 5 שורת ה, 2 עלילת nd). בעקבות סיום תהליך ביטול ההפרעה, אנחנו משוחזרים אומדן של צורת הגל ידי שילוב של כל האותות המוערכים מכל איטרציה (איור 6 א). מפעיל תהליך אופטימיזציה שמבוסס על קירוב ריבועים לפחות כדי למזער את השגיאה המרובעת הממוצעת בין צורת הגל המקורית ואת האות המשוחזרת, עדכנו את הערכותינו עבור משרעת, המשך, ועיתוי יחסי של אותות קוד חיישן יחידים (איור 6 ב). כמו כן, אנו מעריכים את הגודלהתאים מאובחנים מבוססים על משרעת של אותות חיישן היחידים המוערכים. כדי להשיג זאת, אנו מכוילים אמפליטודות האות החשמליות עם בגדלי תא נמדדים אופטי באמצעות רגרסיה ליניארית (6b איור). השוואת התוצאות שלנו מן הקודים Microfluidic עם המידע המתקבל תמונות מיקרוסקופ במהירות גבוהה נרשמה בו זמנית מראה כי גודל התא ומהירות ניתן למדוד באופן מדויק, אשר מאמת את התוצאות שלנו (טבלה 1). איור 6 ג מציג את תמונת מיקרוסקופ במהירות גבוהה נרשמה בו זמנית בשימוש על תיקוף תוצאת הפענוח.
כדי להדגים את השחזור של התוצאות שלנו וגם את הביצועים של טכנולוגית קודי Microfluidic עבור עיבוד מדגם תפוקה גבוהה, נתחנו אותות חשמליים המתאימים> 1,000 תאים. האותות פוענחו אוטומטית MATLAB ידי הפעלת האלגוריתם הסבירמעל ואת הדיוק של התוצאות שלנו הוערך על ידי השוואת התוצאות שלנו ישירות עם נתונים אופטיים מוידאו במהירות גבוהה שנרשם בו זמנית. הבדיקות שלנו מראות כי אותות חשמליים מ 96.15% של תאים (973 / 1,012) פוענחו במדויק. דירוג הצלחה עבור פענוח אותות סלולריים שאינם חופפים וחופפים הוא 98.71% (688/697) ו 90.48% (285/315), בהתאמה.
איור 1. עיצוב של מכשיר ארבעת ערוצי קודי Microfluidic. (א) אלקטרודות בכל ערוץ microfluidic הן micropatterned כדי ליצור קוד מספרים ייחודי. אפנון העכבה בשל אינטראקציות רציפות של זורם תאים עם זוגות אלקטרודה מוביל פולסים חשמליים. (ב) תמונת מיקרוסקופ של מכשיר קודי Microfluidic. במהלך תהליך הייצור, מצע זכוכית עם אלקטרודות משטח קידוד מיושר עם ערוצי microfluidic PDMS תחת מיקרוסקופ. (ג) תקריב תמונה של אלקטרודות משטח מקודד לייצור רצפים זהב 7 סיביות: "1,010,110", "0,111,111", "0,100,010", "0,011,000". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תהליך microfabrication איור 2.. (א) ערוצי microfluidic PDMS מיוצרים באמצעות ליתוגרפיה רך 27. (ב) אלקטרודות המשטח מיוצרת באמצעות תהליך המראה. (ג) סכימטי חתך של המכשיר הסופי. ערוצי microfluidic PDMS מיושרים מלוכדות אל מצע זכוכית עם אלקטרודות משטח. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. התקנה ניסיונית. באמצעות משאבת מזרק, השעית התא מנוהלת באמצעות מכשיר קודי Microfluidic בקצב זרימה מתמיד. אות 400 kHz AC מוחל על האלקטרודה התייחסות באמצעות מחולל פונקציה. אותות שוטפים אלקטרודות חישה חיוביות ושליליות המומרים ראשונים לאותות מתח באמצעות שני מגברי transimpedance ונוכו זה לזה באמצעות מגבר הפרש. האות דו קוטבית ההפרש מופק על ידי מגבר נעילה ולאחר מכן שנדגמו לתוך מחשב לעיבוד אותות ופענוח. מיקרוסקופיה מהיר אופטי משמש פעולת שיא אופטית של המכשיר לצורכי אימות ואפיון.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. אותות חשמליים הקלטות מחיישני פרט והמתאמים שלהם. אותות הקלטות ואת המתאם שלהם עם כל האחרים מקבלים במשך ארבעה חיישנים דופקים resistive קוד-מרובב. חיישן 1 (א), חיישן 2 (ב), חיישן 3 (ג) וחיישן 4 (ד) נועד לייצר גל דיגיטלי 7 סיבי "1,010,110", "0,111,111", "0,100,010", ו "0,011,000", בהתאמה . עבור כל חיישן, הדמות העליונה מראה כי אות מנורמל רשם כל חיישן תואם הדוק עם רצף הדופק המרובע האידיאלי כי החיישן נועד לייצר. עבור כל חיישן, בלוח התחתון מציג אות חיישן מוקלטת9; s autocorrelation ו חוצה קשר עם אותות בהתאמה לשלושת חיישני קוד מסוג ריבוב אחרים ברשת. בכל המקרים, שיא autocorrelation ניתן לזהות וחסון כי הקודים הדיגיטליים מחיישני פרט נועדו להיות מאונך זה לזה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. פענוח צורה-גל חופף עם ביטול הפרעה רצוף. בכל איטרציה, גלי הקלט (1 טור st) מתואמים עם ספריית תבנית preassembled לזהות את התבנית ספציפית שתוצאתו משרעת קורלציה מקסימלית (עמודת nd 2). באמצעות תבנית ספציפית זו, האות להתערב החזק נאמד בהתבסס על משרעתותזמון מידע מהפסגה קורלציה (3 טור rd). האות המוערך אז ינוכה צורת הגל המקורית, ביעילות מבטל את ההפרעה החזקה בשל התא הגדול ביותר. התהליך חוזר על עצמו עד אין שיא מתאם ניתן לקבוע (כלומר, מקדם מתאם <0.5) האות שיורית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. ניתוח תוצאת פענוח. (א) אותות משוערים הם מעודנים מבוססים על אלגוריתם אופטימיזציה שמטרתו להשיג את ההתאמה הטובה ביותר בין המשוחזר וצורת גל רשמה המקורי באמצעות קירוב מינימום ריבועים. (ב) בתום תהליך האופטימיזציה,העיתוי משרעת של אותות מכוילים לשקף במדויק את פרמטרי התא נמדדו על ידי מיקרוסקופ במהירות גבוהה. (ג) נרשמה במקביל תמונת מיקרוסקופ מהירה מאמתת התוצאות שלנו ממדידות חשמל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| סוג מדידה | r ch1 (מיקרומטר) | r CH2 (מיקרומטר) | r CH3 (מיקרומטר) | r CH4 (מיקרומטר) | Δt 1 (ms) | Δt 2 (ms) | Δt 3 (ms) |
| חַשׁמַלִי | 8.010 | 6.490 | 5.300 | 6.550 | .465 | 1.705 | .744 |
| אוֹפּטִי | 8.320 | 6.770 | 5.680 | 7.040 | 0.375 | 1.625 | 0.750 |
השוואת טבלת 1. פרמטרי תא נמדדו חשמלי אופטי של 6b איור. כדי לאמת הערכות שלנו, אנו אופטיים נמדדנו בגדלי התא מתמונת מיקרוסקופיה במהירות גבוהה. עיתוי יחסית בין תאים שונים נמדד אופטי ממספר מסגרות בין תאי הווידאו במהירות גבוהה שנרשם ב 8000 פריימים לשניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיישני דופק resistive מרובים שולבו בעבר לתוך שבבי microfluidic 28, 29, 30, 31, 32. במערכות אלה, חיישני דופק resistive היו גם לא מרובבים 28, 29, 30, 31 או שהם נדרשים חיישנים בודדים שיסייעו בתדרים שונים 32. בשני המקרים, חיבורים חיצוניים ייעודיים היו נחוצים עבור כל חיישן דופק resistive על השבב ולכן מספר רב של חיישנים לא יכול להיות משולב ללא מורכבות חומרה יותר. היתרון החשוב של קודי Microfluidic הוא שהיא מאפשרת קריאה בו זמנית של חיישנים דופקים resistive מרובים מתוך פלט יחיד מכשיר פשוט. אנו משיגים זאת על ידי ניצול מטכניקות ultiplexing נפוצים בתחום התקשורת לעצב חיישני דופק resistive micromachined משולבים מכשירים microfluidic. בעיקרו של דבר, הטכנולוגיה שלנו מסתמכת על ריבוב קוד רשת של מונים על שבב קולטר על ידי עיצוב כל לייצר אות להבחין כאשר מזוהה חלקיק. כל חיישן micromachined ברשת מורכב אלקטרודות משטח coplanar המרובה להזמין שוני תצורות כגון שהאינטראקציה הרציפה של זורם חלקיקים עם אלקטרודות אלה מייצרת גל מודולציות עכבה מאונכת. כדי להכיל אינטראקצית חלקיק-חיישן אסינכרוני, אנו שתוכננו במיוחד כל חיישן להפיק קודי זהב 33, קודים דיגיטליים אורתוגונלי פסאודו שבדרך כלל משמשים uplink של רשתות תקשורת CDMA. קודי זהב לשמור על orthogonality רמה מסוים גם כאשר אינם מיושרים עם הפרשי מופע אקראי 34.
מִיקודי crofluidic הוא ניתן להרחבה בקלות. למרות שהצגנו בפניהם תוצאות מהתקן קודי אבטיפוס Microfluidic עם ארבעה חיישנים במאמר זה, חיישנים יותר ניתן לשלב את המכשיר כאשר נועדו לייצר אותות פלט להבחין ביניהם לבין השאר. דרך אחת להרחיב את רשת החיישן היא לעצב מבוססות חיישנים על קבוצות קוד מאונכות גדולות עם קודים דיגיטליים יותר. כבר קודים מאונכים עם יותר ביטים לספק רווח עיבוד גבוה פענוח ניתן להבחין בין זה לזה כאשר יש הפרעה. מצד השני, קודי זהב כבר במכשיר גם אומרים נפח חישה גדול, דבר המגדיל את המספר הצפוי של חיישנים להתערב. כמו כן, הגדלת מספר החיישנים עבור צפיפות מדגם נתונה תוביל חלקיקים יותר חופפים כתוצאה מגידול בהיקף החישה הכולל. ככזה, צפיפות החלקיקים במדגם היא פרמטר קריטי כי צריך להיחשב באמצעות טכנולוגית קודי Microfluidic. את p המרביצפיפות מאמר שיכול להיפתר (באנלוגיה עם קיבולת הערוץ של רשת בזק CDMA) תלוי במספר גורמים כגון אותות חיישן פרט ביחס שלהם, את ערכת הפענוח, הפריסה של מכשיר microfluidic, ורמת הרעש האלקטרונית. בהתאם ליישום, יכול להיות מדולל המדגם כדי להגיע צפיפות חלקיקים שמייצרת שיעור טעות מקובל.
מנקודת המבט של עיבוד אותות, פענוח של גל זמן מהתקן קודי Microfluidic אינו מחשוב אינטנסיבי באמצעות מערכות קיימות כפי שמעיד עובדת תקשורת טלפון סלולארי ברשת CDMA ניתן demultiplexed בזמן אמת. יתר על כן, אירועים פיזיים להיות מפוענח במכשירים microfluidic לקרות הרבה יותר לאט מאשר שיעור התמסורת קצת בתקשורת הטלפון הנייד מאפשר לנו להשתמש יותר מתקדמים ונדרש זמן רב אלגוריתמים כגון SIC וכן אופטימיזציה של תהליכים, אשר אנו משתמשים כדי לפתור חופפים איטרטיבית סיgnals מחיישנים.
יחדיו, קודי Microfluidic הוא טכנולוגיית חישה אלקטרונית צדדית, מדרגים שניתן לשלב בקלות לתוך מכשירי microfluidic שונים לממש מבחנים כמוני על ידי מעקב אחר חלקיקים כאשר הם מעובדים על השבב. הטכנולוגיה היא מאוד קלה ליישם, כי (1) הוא פשוט מאוד מנקודת מבט חומרה (2) שהוא תואם ישירות עם ליתוגרפיה הרך (3) הוא מספק לקריאה מתוך אלקטרוני ישירה ללא כל מרכיב על-שבב פעיל, ו (4) הוא מסתמך על אלגוריתמים חישוביים פשוטים עבור עיבוד אותות נתונים לפרשנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
