Summary
우리는 다수의 미세 채널에서 입자의 검출 및 사이징 다중화, 코드 분할 다중 접속 (CDMA)과 저항 펄스 센서 (RPS)를 결합하는 집적 표면 전극 네트워크와 미세 유체 플랫폼을 보여준다.
Abstract
생물학적 시료의 미세 가공은 일반적으로 공간적으로 관심의 생물학적 특성에 기초하여 샘플을 분별하기 위해 다양한 역장 하에서 현탁 입자의 차등 조작을 포함한다. 얻어진 공간적 분포 분석 판독으로 사용되기 위해서는, 마이크로 유체 장치는 종종 높은 비용 및 감소 된 휴대 복잡한 장비를 요구 현미경 분석을 실시한다. 이러한 한계를 해결하기 위해 마이크로 유체 칩상의 다른 위치에서의 입자의 다중 검출을위한 집적 형 전자 감지 기술을 개발했다. 미세 유체 CODES라는 우리의 기술은 1 차원 전기 신호로 2 차원 공간 정보를 압축하는 코드 분할 다중 접속과 저항 펄스 감지를 결합합니다. 본 논문에서는 미세 유동 CODES 기술의 실제 데모 검출 크기 배양 암세포 여러 미세 유체 채널을 통해 분배 제시한다. 같이고속 현미경에 의해 확인, 우리의 기술은 정확한 외부 장비의 필요없이 모든 전자 밀집 세포 집단을 분석 할 수있다. 이와 같이, 미세 유체 CODES 잠재적으로 생물학적 시료의 시점 관리 테스트에 적합 저비용 집적 랩 온어 칩 장치를 활성화 할 수있다.
Introduction
이러한 액체 현탁 세포, 박테리아 또는 바이러스와 같은 생물학적 입자의 정확한 검출 및 분석 애플리케이션 (1, 2), (3)의 범위의 큰 관심사이다. 크기가 잘 일치, 마이크로 유체 장치는 고감도, 부드러운 시료 조작하고 잘 제어 된 미세 4, 5, 6, 7 등이 목적에 독특한 이점을 제공한다. 또한, 마이크로 유체 장치는 수동적으로 다양한 특성 8, 9, 10, 11, 12에 기초하여 생물학적 입자의 이종 집단을 분별 유체 역학 및 포스 필드의 조합을 사용하도록 설계 될 수있다. 그 장치에S는, 생성 된 입자 분포를 판독로서 사용될 수 있지만, 공간 정보는 랩 기반으로 묶어서 미세 유동 장치의 실용성을 제한 만 현미경을 통해 일반적으로 접근 할 수있다. 따라서, 그들은 마이크로 유체 장치를 조작하는 것처럼 쉽게, 입자 '시공간 매핑을보고 할 수있는 통합 된 센서는 잠재적으로 저가의 모바일 샘플의 테스트에 특히 매력적이다 통합 된 랩 온어 칩 장치를 활성화 할 수 있습니다 자원 제한 설정.
박막 전극은 다양한 어플리케이션 (13), (14) 마이크로 유체 장치에 통합 센서로서 사용되어왔다. 저항 펄스 감지 (RPS)는이 전기 측정 (15)에서 직접, 강력한 민감하고 높은 처리량 감지 메커니즘을 제공으로 미세 유체 채널 작은 입자의 통합 감지에 특히 매력적이다. RPS에서는 전해액에 침지 한 쌍의 전극 간의 임피던스 변조는, 입자를 검출하기위한 수단으로 사용된다. 입자가 개구를 통과 할 때, 입자 정도의 크기, 개수 및 전류의 과도 펄스의 진폭은 각각 셀 크기 입자에 사용된다. 또한, 센서 감도 형상은 16, 17, 18, 19을 향상 시키거나 미세 유체 채널 (20)에 입자의 수직 위치를 추정하기 위해 저항 펄스 파형을 형성하기 위해 포토 리소 그래픽 해상도로 설계 될 수있다.
우리는 최근 전기 감지 (미세 유체 CODES) (21)에 의해 미세 유체 부호화 직교 검출라는 확장 가능하고 간단한 멀티 플렉스 저항 펄스 감지 기술을 도입했습니다. 미세 유체 CODES는에 의존저항 펄스 센서 네트워크 상호 다중화 가능하도록 각각 고유하게 구별 도통 변조 미세 가공 전극의 배열로 이루어진. 우리는 특히 코드 분할 다중 접속에 사용 된 디지털 코드와 유사 직교하는 전기 신호를 생성하도록 각각의 센서를 디자인했다 (22) (CDMA) 통신 네트워크, 개별 저항 펄스 센서 신호는 유일하게 하나의 출력 파형으로부터 복구 될 수 있도록 짝수 신호로부터하다면 다른 센서를 방해합니다. 이러한 방식으로, 우리의 기술은 최소한의 장치 - 시스템 레벨 복잡성을 유지하면서, 미세 유체 칩상의 다른 위치에서의 입자의 모니터링을 허용하는, 1 차원 전기 신호로 입자의 2 차원 공간 정보를 압축한다.
본 논문에서는 실험 및 전산 미세 유체 CODES 기술을 사용하는 데 필요한 방법뿐만 아니라 연구에 대한 자세한 프로토콜을 제시시뮬레이션 된 생체 시료 분석에서의 사용에서 epresentative 결과. 기술을 설명하기 위해 예로서 네 개의 다중 센서 시제품 장치로부터의 결과를 사용하여, 우리는 (2) 실험 구성의 설명을 포함하는 미세 유체 CODES 기술 마이크로 유체 장치를 생성하는 (1)에 미세 가공에 프로토콜들을 제공 할 전자 광학 및 유체 하드웨어, (3) 다른 센서로부터의 간섭 신호를 디코딩하기위한 컴퓨터 알고리즘, (4) 검출 및 미세 유체 채널의 암세포의 분석 결과. 우리는 상세한 프로토콜을 사용하여 여기에 설명 된 것을, 다른 연구자가 자신의 연구에 우리의 기술을 적용 할 수 있습니다 생각합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
코딩 전극 1. 디자인
참고 :도 1a는 미세 패턴 전극의 3 차원 구조를 나타낸다.
- 미세 유체 채널 (23)을 인코딩하기위한 네 개의 7 비트 골드 코드 세트를 설계한다.
- 이 선형 피드백 시프트 레지스터 (의 LFSR), 원시 다항식을 나타내는 각을 구축합니다.
- 7 비트 m의 -sequences의 바람직한 쌍을 생성하기 위해 상기의 LFSR을 사용한다.
- 주기적 m의 -sequences의 바람직한 쌍을 이동하고 네 가지 골드 코드를 생성하는 모드 2에 추가합니다.
- 부호화 전극 (도 1b)의 레이아웃을 설계한다.
- 세 개의 코너에 양극, 음극, 및 참조 전극을 나타내는 세 개의 전극 단자를 배치합니다.
- 루트 양극과 음극은 각각의 미세 채널의 양측에 추적.
- 에 양극과 음극을 확장유일하게 할당 된 골드 코드 (그림 1C) 다음 전극 손가락으로 미세 유체 채널.
- 양 및 음의 전극 핑거 사이에 기준 전극을 배치했다.
- 코딩 영역 외부의 도통을 최소화하기 위해 먼 최 기준 전극 핑거로부터의 양 및 음의 전극 흔적을 놓는다.
표면 전극 2. 마이크로
참고 :도 2b는 표면에 전극의 제조 프로세스를 나타낸다.
- 피라냐 용액 4 인치 붕규산 유리 웨이퍼 청소 (98 % 황산을 30 % 과산화수소 = 5 : 1)을 20 분 동안 모든 유기 오염물을 제거하기 위해 120 ℃에서. 20 분 잔류 물을 제거하기 위해 다음 200 ° C 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
- 회 전자에 웨이퍼를 전송합니다. 웨이퍼에 2ml의 네가티브 포토 레지스트를 분배 및도 3의 속도로 웨이퍼를 스핀균일하게 코팅하는 40 S 1.5 ㎛의 포토 레지스트 층이 웨이퍼 000 RPM.
- 150 °의 C 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓고 1 분 동안 회전 포토 레지스트를 굽는다.
- 마스크 얼 라이너를 사용하는 크롬 마스크를 통해 365 nm의 자외선 (225 mJ의 / cm 2)에 포토 레지스트를 노출.
- 100 ℃로 핫 플레이트상에서 상기 웨이퍼를 놓고 1 분 동안 노출 된 포토 레지스트를 굽는다.
- 15 초 동안 포토 레지스트 개발 (RD6)에서 웨이퍼를 침지하여 포토 레지스트를 개발한다. 조심스럽게 탈 (DI) 물을 뿌리지 웨이퍼를 세척한다. 압축 질소를 불어 건조.
- 전자 빔 금속 증발기에 패터닝 된 포토 레지스트로 상기 웨이퍼를 배치하고, 3 × 10-6 Torr의베이스 압력에서 웨이퍼 상에 80 nm 두께의 금막 다음 20 nm 두께의 크롬 막을 증착 1 Å / s의 증착 속도.
- 실내 기질에서 30 분 동안 100 %의 진폭을 가진 40 kHz의 주파수로 초음파 조 세트 아세톤으로 금속 코팅 된 웨이퍼를 담가기본이되는 포토 레지스트를 에칭 및 리프트 오프 과정을 완료 ature.
- 기존의 다이 싱 톱을 사용하여 작은 조각으로 웨이퍼를 주사위입니다.
미세 유체 채널의 SU-8 몰드 3. 제작
참고 :도 2a는 미세 유체 채널 용 금형의 제조 공정을 도시한다.
- 청소 및 2.1에 기재된 방법과 동일한 방법을 이용하여 4 인치 실리콘 웨이퍼를 굽는다.
- 회 전자에 웨이퍼를 전송합니다. 웨이퍼 상에 4 mL의 포토 레지스트를 따르십시오. 코트 포토 레지스트와 웨이퍼.
- 15 초 동안 500 rpm으로 상기 웨이퍼를 스핀.
- 15 초 동안 1000 rpm으로 상기 웨이퍼를 스핀.
- 60 (S)에 균일하게 도포 한 후, 15 ㎛의 두께의 포토 레지스트 층을 얻기 위해 3,000 rpm으로 상기 웨이퍼를 스핀.
- 클린 룸 닦아 아세톤에 배어에 웨이퍼 얼굴을 배치하고 뒷면과 웨이퍼의 가장자리에서 잔류 포토 레지스트를 제거합니다.
- 뜨거운 PL에 웨이퍼를 이동소프트 베이킹에 대한 먹었다. 우선, 1 분 동안 65 ° C에서 웨이퍼 굽는다. 그런 다음 신속하게 95 ° C를 핫 플레이트에 웨이퍼를 이동하고 2 분 동안 굽는다.
- 마스크 얼 라이너를 사용하여 크롬 마스크를 통해 365 nm의 자외선 (180 mJ의 / cm 2)에 포토 레지스트를 노출.
- 1 분 동안 65 ° C에서 웨이퍼 다음 노출을 구워 2 분 후 95 ° C.
- 개발자의 웨이퍼를 담가 부드럽게 3 분의 컨테이너를 흔들어. 그런 다음, 이소프로판올 알코올 (IPA)와 웨이퍼를 씻어 압축 질소를 불어를 건조. 흰 색의 잔류 물이 웨이퍼에 나타나면 다시 개발자로 젖어 긴 시간과 건조를 위해 개발.
- 완전히 건조 30 분 동안 200 ° C 뜨거운 접시에 웨이퍼를 굽는다.
- 균일 성을 보장하기 위해 웨이퍼를 가로 질러 여러 위치에서 프로파일로를 이용하여 패터닝 된 포토 레지스트의 두께를 측정한다.
- 증착 기법을 이용하여 주형 웨이퍼 silanization합니다. TR 200 μL를 추가8 시간에 대한 SU-8 형 웨이퍼와 함께 진공 데시 케이 터에서 페트리 접시 대신 ichlorosilane.
미세 유체 장치의 CODES 4. 어셈블리
- 150 mm 직경의 배양 접시에있는 금형으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 배치하고, 모서리에서 테이핑하여 고정한다.
- 10의 비율로 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 예비 중합체 및 가교 결합제를 혼합 : 1이며, 페트리 접시에 50 g의 혼합물을 붓는다. 1 시간 동안 탈기 혼합물을 진공 데시 케이 터에서 페트리 접시를 놓은 다음, 적어도 4 시간 (도 2a)에 대해 65 ° C의 오븐에서 경화.
- 메스를 사용하여 경화 된 PDMS 층을 잘라내어 집게를 사용하여 주형 웨이퍼를 떼어. 증명의 원리 장치의 크기는 대략 20mm × 7mm이다. 그 후, 생검 펀치를 사용하여 미세 유체 채널의 입구 및 출구에 대한 PDMS 내지 1.5 mm의 직경으로 펀치 구멍.
- I 배치하여 PDMS 부분의 패턴면을 청소클린 룸 접착 테이프에 t.
- 아세톤, IPA, 탈 이온수로 세척하여 표면 전극 부착 유리 기판을 세척하고 압축 질소를 사용하여 건조.
- 100 mW에 설정되는 RF 플라즈마 발생기에 대향 각 부품의 미세 가공면을 30 초간 산소 플라즈마에 PDMS 표면과 유리 기판을 활성화.
- 유리 기판 상에 표면 전극이 물리적으로 접촉 두 플라즈마 활성화 된 표면을 가지고 한 후, 광학 현미경을 이용하여 함께 PDMS 미세 유체 채널을 맞추고.
- 핫 플레이트에 대향하는 유리 측에 5 분 동안 70 ℃ 핫 플레이트상에서 장치 굽는다.
- 납땜 와이어와 전극의 접촉 패드를 연결한다.
시뮬레이션 된 생물학적 샘플 5. 준비
- RPMI 1640에서 배양 HeyA8 인간 난소 암 세포는 37 ° C에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 CO 2 분위기에서 5 %로 보충그들은 80 %의 합류에 도달 할 때까지.
- 유리 피펫을 사용하여 문화 플라스크에서 미디어를 대기음. 분배 후 흡인 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)는 세포를 씻어.
- 37 ° C에서 2 분간 트립신 용액 (/ V W) 부착 세포를 일시 중단 mL의 2에서 0.05 %로 세포를 품어. 그 후, 트립신을 중화하기 위해 배지 4 mL를 첨가.
- 원심 분리기에서 5 분 동안 100 × g에서 세포 현탁액은 시험관에서 세포 펠렛. 그런 다음, 기음 뜨는 완전히.
- 부드럽게 피펫 팅에 의해 기계적 해리 세포 덩어리까지 1 ~ 2 ㎖의 1X PBS의 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 피펫으로 세포 현탁액의 작은 금액을 그리기 및 혈구를 사용하여 세포의 수를 계산합니다.
- 105 -10 106 세포 / ㎖의 최종 세포 농도로 시료를 준비하는 PBS로 세포 현탁액을 희석.
6. 미세 유체 CODES 장치를 실행
참고 : 인터넷을gure 3은 실험 구성도이다.
- 광학 현미경의 무대에 미세 유체 CODES 장치를 놓습니다.
- 전자 함수 발생기를 사용하여 칩상의 상기 기준 전극에 400 kHz의 사인파를 적용한다.
- 전압 신호를 각에서 전류 신호를 변환하는 두 개의 독립적 인 트랜스 임피던스 증폭기에 양극과 음극 감지 전극을 연결합니다.
- 바이폴라 신호를 획득하기 위해 차동 전압 증폭기를 사용하여 음의 감지 전극 전압 신호와 양의 감지 전극 전압 신호를 뺀다.
- 유효성 및 특성을 위해 상기 장치의 광학 기록 동작으로 고속 카메라를 사용한다.
- 주사기 펌프를 이용하여 일정 유량 (50 ~ 1,000 μL / H)로 미세 유동 장치를 통해 CODES 세포 현탁액을 구동한다.
- 로크 인 증폭기를 사용하여 임피던스 변조 신호를 측정한다.
- 심판에 대한 참조 AC 신호를 연결합니다잠금 기능 증폭기의 퍼런 입력. 입력 신호 잠금 기능 증폭기 차동 바이폴라 신호를 연결합니다.
- 락 - 인 앰프 출력에서 차동 신호의 RMS 진폭을 얻습니다.
- 추가 분석을 위해 데이터 수집 보드를 통해 컴퓨터에 1 MHz의 속도로 로크 인 증폭기 출력 신호를 샘플링.
센서 신호 7. 처리
- 후 처리 및 디코딩을위한 MATLAB에 기록 된 전기 데이터를 전송합니다.
- 고주파 잡음 (> 2.5 kHz로)를 제거하는 버터 워스 필터 (MATLAB 내장 함수)를 이용하여 디지털 영역에서 기록 신호 필터.
- 센서 신호에서 템플릿 코드 라이브러리를 생성합니다.
- 장치의 각 센서에 대응하는 대표 겹치지 코드 신호를 확인하고 별도의 파형 벡터와 같은 데이터 세트에서 이러한 신호 블록의 압축을 풉니 다.
- 각 템플릿 코드 파형 벡터를 정규화그 힘에 의해. 신호 전력을 측정 MATLAB 내장 함수 (bandpower)를 사용한다.
- 디지털 전극 위에 셀 흐름 속도의 변화를 수용하기 위해 다양한 기간 정규화 코드 신호의 버전을 생성하여 템플릿 라이브러리 확장 MATLAB 함수 (리샘플링)를 사용한다.
- 필터링 된 파형 (SNR> 12dB 임계 값) 활동을 센서에 대응하는 신호 블록을 확인합니다. 임계 값에 따라 SNR과 파형은 잡음으로 처리 될 것이다.
- 연속 간섭 제거에 기초한 반복적 알고리즘이 일반적으로 다중 사용자 CDMA 통신 네트워크 (24) (25)에 사용되는 기술을 이용하여 녹음 된 신호에서의 센서 활동 개별 블록을 디코딩.
- 내적 슬라이딩 사용하여 라이브러리에있는 모든 템플릿과 각 신호 블록의 상호 상관을 계산합니다.
- larg의 생산 템플릿을 확인EST 자기 상관 피크가 지배적 개별 센서 코드 신호를 결정한다. 자기 상관 피크의 시간 및 진폭 모두를 기록한다.
- 측정 된 자기 상관 피크 진폭에 기초하여 상기 식별 된 템플릿 코드를 스케일링한다 (단계 7.5.2로 결정됨) 타이밍 정보에 의해 추정 센서 코드 신호를 구축.
- 원래의 데이터로부터 추정 된 센서 코드 신호를 뺀다.
- 잔차 신호 수학적 0.5 이하가되는 상관 계수로 정의 템플릿 라이브러리에서 신호를 유사하지 않을 때까지, 7.5.1의 절차를 반복.
- 최적화 프로세스를 이용하여 단계 7.5로부터의 센서 신호의 초기 추정을 지금.
- 각 반복에서 추정 된 각각의 센서 신호를 가산함으로써 상기 신호를 재구성.
- 기록 된 전기 신호에 가장 적합을 생산하는 최초 추정치 주위 개별 센서 신호의 진폭, 지속 시간과 타이밍을 스윕에 기초하여 최소 제곱 근사 26.
- 광학 이미지에 전기 신호를 보정하여 셀 크기에 추정 된 센서 신호의 진폭을 변환합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
네 개의 미세 유체 채널을 통해 분산 센서 4 이루어지는 미세 유체 CODES 장치는도 1b에 도시된다. (1) 복수의 셀을 병렬 및 (2) 세포를 전극에 가까이 유지 감도를 증가시키는 전극을 통해 통과 할 수 있도록이 시스템에서, 각 미세 유체 채널의 단면은 셀의 크기에 가깝도록 설계된 . 각각의 센서는 독특한 7 비트의 디지털 코드를 생성하도록 설계된다. 이 장치는 다음 세포 현탁액을 사용하여 시험 하였다. 네 개의 개별 센서에 대응하는 기록 된 전기 신호는 그림 4에 관련 이상적인 디지털 코드로 표시됩니다. 작은 편차가 존재하는 동안 기록 된 신호는 밀접하게, 이상적인 사각 펄스와 일치합니다. 이러한 편차는 서로 다른 전극 쌍의 구형 간의 결합, 공면 전극 사이의 불균일 한 전기장을 포함한 여러 가지 요소의 조합에 기인세포뿐만 아니라, 미세 유체 채널의 셀의 일정한 유속. 우리는 코딩 센서 신호를 기반으로 템플릿 라이브러리를 만들었습니다. 라이브러리의 모든 템플릿에 기록 된 신호를 상관으로, 우리는 최대 자기 상관 피크를 생성 템플릿 (그림 4) 결정. 미세 유체 채널의 디지털 코드들은 서로 직교하도록 설계되기 때문에, 지배적 인 자기 상관 피크 견고이 과정에서 확인 될 수있다. 이 방법을 사용하여, 우리는 계산적 셀을 통과 한 미세 유체 채널, 센서 신호의 지속 시간, 및 셀 따라서 흐름 속도를 결정할 수있다.
여러 셀을 동시에 코딩 전극과 상호 작용할 때 미세 유체 CODES 기술은 상황을 해결할 수 있습니다. 이러한 중복이 발생할 때, 각각의 센서로부터의 신호가 방해 생성 된 파형은 용이 하나와 관련 될 수 없다특정 센서에 대응하는 하나의 템플릿입니다. 정확하게 이러한 중첩 신호를 디코딩하는 간섭이 발생할 가능성이 안정적인 처리 고밀도 샘플에 특히 중요하다. 이벤트 겹치는 해결하기 위해, 우리는 일반적으로 CDMA 통신 네트워크에서 멀티 유저 검출을 위해 사용되는 연속 간섭 제거 (SIC) 기법 24, 25에 기초하여 반복 알고리즘을 개발했다. 도 5는 SIC 알고리즘 네 가지 미세 유체 채널에 네 개의 셀 중첩으로 인한 파형 해결을 구현하는 방법을 보여준다. 각 반복에서, 먼저 템플릿 라이브러리 입력 파형 (도 5a, 1 번째 열)를 상관시킴으로써, 강한 간섭 신호에 대응하는 (도 5a, 2 번째 열) 지배적 인 자기 상관의 피크를 결정 하였다. 선택한 템플릿 및 t을 바탕으로그 후, 우리는 가장 강한 간섭 신호 (도 5a, 3 번째 열)을 추정하고, 입력 파형으로부터이를 감산 자기 상관 진폭을 생성. 잔류 파형을 입력으로 다음 반복에 전달 하였다. 이 공정은 투명한 자기 상관 피크 (도 5a, 5 번째 행, 2 차 플롯)를 제조하지 않았 템플릿 라이브러리 잔차 신호의 상관 될 때까지 계속했다. 간섭 제거 공정의 종료 후, 우리는 각각의 반복 (도 6a)에서 모든 추정 된 신호를 합성하여 파형의 추정치를 재구성. 원래의 파형과 재구성 된 신호 사이의 평균 제곱 오차를 최소화하기 위해 최소 제곱 근사를 기반 최적화 프로세스를 사용하여, 우리는 (도 6b)을 진폭, 지속 기간에 대한 추정치를 업데이트하고, 각각의 센서 코드 신호들의 상대적 타이밍. 또한 크기를 추정셀은 추정 된 개별 센서 신호의 크기에 기초하여 검출. 이를 달성하기 위해 선형 회귀 (도 6b)를 이용하여 광학적으로 측정 된 셀 크기를 갖는 전기 신호의 진폭을 보정. 동시 기록 고속 현미경 화상으로부터 얻어진 정보에 미세 유체 CODES에서 검색 결과의 비교는 세포 크기와 속도를 정확하게 연구 결과 (표 1)의 유효성을 검사하는 측정 할 수 있음을 보여준다. 도 6c는 복호 결과를 검증에 이용되는 동시에 기록 고속 현미경 이미지를 나타낸다.
검색 결과의 재현성도 높은 처리량 샘플 처리를위한 미세 유체 CODES 기술의 성능을 입증하기 위해, 우리는> 1000 셀에 대응하는 전기 신호를 분석 하였다. 신호는 자동으로 설명 된 알고리즘을 실행하여 디코딩 된 MATLAB이상과 검색 결과의 정확도가 직접 녹화를 동시에 고속 비디오로부터 광 데이터 우리의 결과를 비교함으로써 평가 하였다. 우리의 분석은 세포의 96.15 % (973 / 1,012)에서 전기 신호가 정확하게 디코딩 된 것을 나타냅니다. 비 - 중첩하고 중첩 셀 신호를 디코딩 성공률은 98.71 % (697분의 688)은 각각 90.48 % (315분의 285)이다.
네 개의 채널 미세 유체 CODES 장치 1. 디자인 그림. (a) 각각의 미세 채널 전극은 고유 한 디지털 코드를 생성하는 마이크로 패턴된다. 인해 전극 쌍 세포 흐르는 순차적 상호 작용 임피던스 변조 전기 펄스로 이끈다. (b) 미세 유체 CODES 장치의 현미경 이미지. 제조 프로세스 동안, 부호화 표면 전극과 유리 기판 정렬 현미경 PDMS 미세 유체 채널. 7 비트 골드 시퀀스를 생성하는 코드 표면 전극 (c)에 근접 이미지 : "1010110", "0111111", "0100010", "0011000". 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2의 미세 가공 방법. (a)는 PDMS 미세 유체 채널은 소프트 리소그래피 (27)를 사용하여 제조된다. (b) 상기 표면 전극은 리프트 오프 (lift-off) 공정을 이용하여 제조된다. (c) 최종 장치의 개략적 인 단면도. PDMS 마이크로 유체 채널을 정렬 및 표면 전극 부착 유리 기판에 접합된다. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 실험 설정 그림. 주사기 펌프를 사용하여 세포 현탁액을 일정한 유량으로 미세 유체 CODES 장치를 통해 실행된다. 400 kHz의 AC 신호는 함수 발생기를 이용하여 상기 기준 전극에인가된다. 양 및 음의 감지 전극으로부터 전류 신호가 제 개의 트랜스 임피던스 증폭기를 이용하여 전압 신호로 변환하고, 차동 증폭기를 이용하여 서로 감산된다. 차동 신호는 바이폴라 로크 인 증폭기에 의해 추출하고, 신호 처리 및 디코딩하기위한 컴퓨터로 샘플링된다. 고속 광학 현미경은 검증 및 특성화를 위해 장치의 광학적 기록 작업에 사용됩니다.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
각각의 센서와 그들의 상관 관계 4. 녹음 된 전기 신호를 그림. 기록 신호가 서로 상관 관계가 네 코드 다중화 저항 펄스 센서 주어진다. 센서 (1) (a)는, 센서 (2) (b), 센서 (3) (c) 및 센서 (4) (D)는 7 비트의 디지털 파형을 생성하도록 설계되었다 "1010110", "0111111", "0100010"및 "0011000"각각 . 각 센서의 경우, 상단 그림은 각 센서에서 기록 된 정규화 된 신호가 센서를 생산하기 위해 디자인 된 이상적인 사각 펄스 시퀀스와 밀접하게 일치하는 것을 알 수있다. 각 센서, 상기 하부 패널은 기록 된 센서 신호를 나타낸다9]의 자동 상관 및 네트워크 내의 세 개의 다른 코드 다중화 센서에 대응하는 신호와 상호 상관. 각각의 센서들로부터의 디지털 코드들은 서로 직교하도록 설계되어 있기 때문에 모든 경우 자기 상관 피크는 견고하게 식별 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
연속 간섭 취소와 중첩 된 파형을 디코딩도 5. 각 반복에서, 입력 파형 (1 번째 열)는 최대 상관 진폭 (2 번째 컬럼)을 초래하는 특정 템플릿을 식별하기 위해 미리 조립 템플릿 라이브러리와 관련된다. 이러한 특정 템플릿을 사용하여, 강한 간섭 신호 진폭에 기초하여 추정되는및 상기 상관 피크 (제 3 열)로부터 타이밍 정보. 추정 된 신호는 인해 가장 큰 셀에 효과적으로 강한 간섭을 제거, 원래의 파형에서 차감됩니다. 상관 피크는 판별 할 수있을 때까지이 프로세스는 반복된다 (즉, 상관 계수 <0.5) 잔차 신호이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 디코딩 결과 분석. (a) 기준 신호는 정제, 재구성 및 최소 제곱 근사를 사용하여 원래의 기록 파형의 최적 획득을 목표로하는 최적화 알고리즘에 기초한다. 최적화 프로세스의 끝에서, (b)타이밍 및 보정 신호의 진폭은 정확한 고속 현미경에 의해 측정 된 셀 파라미터를 반영한다. (c)에 동시에 기록 고속 현미경 이미지는 전기 측정에서 우리의 결과를 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 측정 유형 | r에 CH1 (μm의) | r에 CH2 (μm의) | r에 CH3 (μm의) | r에 CH4 (μm의) | ΔT 1 (MS) | ΔT 2 (MS) | ΔT 3 (밀리 초) |
| 전기 같은 | 8.010 | 6.490 | 5.300 | 6.550 | 0.465 | 1.705 | 0.744 |
| 광학 | 8.320 | 6.770 | 5.680 | 7.040 | 0.375 | 1.625 | 0.750 |
도 6b의 전기적 및 광학적 측정 셀의 파라미터를 표 1의 비교. 우리의 추정치를 검증하기 위해 광학 고속 현미경 이미지에서 셀 크기를 측정 하였다. 상이한 셀들 간의 상대적 타이밍은 광학적으로 초당 8000 프레임으로 기록 된 고속 비디오의 셀 사이의 프레임 번호에서 측정된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
다중 펄스 저항 센서는 이전에 미세 유체 칩 28, 29, 30, 31, 32에 포함되었다. 이러한 시스템에서, 저항 펄스 센서 중 28, 29, 30, 31 멀티플렉싱되지 않은 또는 개별 센서 (32) 상이한 주파수로 구동 될 필요. 두 경우에 전용의 외부 접속은 칩의 각 저항 펄스 센서가 필요하고, 따라서 많은 수의 센서가 큰 하드웨어 복잡도없이 통합 될 수 없었다. 미세 유체 코드의 중요한 장점은 간단한 장치에서 하나의 출력 펄스에서 여러 저항 센서의 동시 판독을 허용한다는 것이다. 우리는 m을 이용하여이를 달성일반적으로 이동 통신에 사용 ultiplexing 기술은 마이크로 유체 장치에 통합 된 마이크로 머시닝 저항 펄스 센서를 설계한다. 본질적으로, 우리의 기술은 입자가 검출 될 때 구별 신호를 생성하도록 각각 설계하여 코드 다중화에 온칩 콜터 카운터의 네트워크에 의존한다. 네트워크의 각각의 미세 가공 된 센서는 이들 전극에 흐르는 입자의 순차적 상호 직교 임피던스 변조 파형을 생성하도록 구성 상이한 주문할 여러 공면 표면 전극 구성된다. 비동기 파티클 센서의 상호 작용을 수용하기 위해 구체적으로 골드 코드 (33), 일반적으로 CDMA 통신 네트워크의 업 링크에서 사용되는 의사 - 직교 디지털 코드를 생성하기 위해 각각의 센서를 설계 하였다. 이들은 임의의 위상차 34 오정렬되면 골드 코드도 일정 수준 직교성을 유지한다.
미crofluidic 코드는 쉽게 확장 가능합니다. 우리가이 문서에서 네 개의 센서 시제품 미세 유체 코드 장치로부터 결과를 제시했지만 나머지 구별 출력 신호를 생성하도록 설계 될 때, 더 많은 센서가 장치 내에 포함될 수있다. 센서 네트워크를 확장하는 한가지 방법은 긴 디지털 코드와 큰 직교 코드 세트에 기초하여 센서를 설계하는 것이다. 더 긴 비트 직교 코드 디코딩 처리에서보다 높은 이득을 제공하고, 간섭이 존재하는 경우는 서로 구별 될 수있다. 한편, 디바이스의 긴 골드 코드는 간섭 센서의 예상 된 수를 증가 큰 센싱 체적을 의미한다. 마찬가지로, 주어진 샘플 밀도 센서의 수를 증가시키는 것은 전체적인 센싱 체적의 증가로 인해 더 많은 중복 된 입자로 이어질 것이다. 이와 같이, 샘플에서의 입자의 밀도는 미세 유체 CODES 기술을 사용하여 고려되어야하는 중요한 파라미터이다. 최대 페이지(a CDMA 통신 네트워크의 채널 용량)와 유사하게 해석 될 수 문서 밀도는 개별 센서 신호와 그 관계의 디코딩 방식의 미세 유체 소자의 레이아웃 및 전자 잡음 레벨 등 여러 가지 요인에 따라 달라진다. 애플리케이션에 따라, 샘플은 수용 가능한 에러 레이트를 발생시키는 입자 밀도에 도달하기 위해 희석 될 수있다.
신호 처리 관점에서 보면, 미세 유동 CODES 장치로부터의 시간 파형의 복호화는 CDMA 네트워크에서의 휴대 전화 통신을 실시간으로 역 다중화 할 수 있다는 사실에 의해 입증되는 바와 같이 현재의 시스템을 이용하여 계산 집약적 아니다. 또한, 물리적 인 이벤트는 미세 유체 장치에서 디코딩 될 우리가 고급 시간 소모적 우리 반복적 SI 겹치는 해결하는 데 사용할 이러한 SIC 같은 알고리즘 최적화 프로세스를 사용할 수 있도록 휴대 전화 통신의 비트 전송 속도보다 훨씬 느리게 일어날센서 gnals.
이와 함께, 마이크로 유체 CODES 용이 그들이 칩 처리로 입자를 추적하여 정량 분석을 구현하는 다양한 미세 유동 장치에 통합 될 수있는 다목적 확장 전자 센싱 기술이다. 이 기술은, (1) (2) 그것이 활성 온 - 칩 구성 요소없이 직접 전자 판독을 제공한다 (3) 소프트 리소그래피와 직접 호환 하드웨어 관점에서 매우 단순하기 때문에 구현하기가 아주 쉽다 및 (4)는 신호 처리 및 데이터 해석에 대한 단순 계산 알고리즘에 의존한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
