Summary
Vi visar ett mikrofluid plattform med en integrerad ytelektrod nätverk som kombinerar resistiv puls avkänning (RPS) med koddelad multipelaccess (CDMA), för att multiplexera detektering och storleksbestämning av partiklar i multipla mikrofluidikkanaler.
Abstract
Mikroflödes behandling av biologiska prover innebär normalt differential manipulationer av svävande partiklar under olika kraftfält för att rumsligt fraktionera provet bygger på en biologisk egenskap av intresse. För den erhållna rumsliga fördelningen som skall användas som analysavläsningen, är mikrofluidikanordningar ofta utsattes för mikroskopisk analys som kräver komplex instrumentering med högre kostnad och reducerad bärbarhet. Att ta itu med denna begränsning, har vi utvecklat en integrerad elektronisk avkänning teknik för multiplex detektion av partiklar på olika platser på en mikroflödessystem chip. Vår teknik, som kallas Mikroflödes koder kombinerar resistiv Pulse Sensing med Code Division Multiple Access att komprimera 2D rumslig information i en 1D elektrisk signal. I detta papper presenterar vi en praktisk demonstration av mikroflödes KODER teknik för att upptäcka och storlek odlade cancerceller fördelade över flera mikroflödessystem kanaler. Somvaliderats av höghastighets mikroskopi, kan vår teknik noggrant analysera täta cellpopulationer allt elektroniskt utan behov av en extern instrument. Som sådan, kan mikroflödes KODER potentiellt möjliggör låga integrerade lab-on-a-chip enheter som är väl lämpade för point-of-care testning av biologiska prover.
Introduction
Noggrann detektering och analys av biologiska partiklar, såsom celler, bakterier eller virus som är suspenderade i vätskan är av stort intresse för en rad tillämpningar 1, 2, 3. Väl matchade i storlek, mikrofluidikanordningar erbjuder unika fördelar för detta ändamål, såsom hög känslighet, mild provmanipulation och välkontrollerad mikro 4, 5, 6, 7. Dessutom kan mikrofluidikanordningar utformas för att använda en kombination av fluiddynamik och kraftfält att passivt fraktionera en heterogen population av biologiska partiklar baserade på olika egenskaper 8, 9, 10, 11, 12. I de anordnings, kan den resulterande partikel användas som utläsning men geografisk information är vanligtvis endast tillgängliga via mikroskopi, vilket begränsar den praktiska nyttan av mikroflödessystem enheten genom att knyta den till ett labb infrastruktur. Därför en integrerad sensor som lätt kan rapportera partiklarnas Spatiotemporal kartläggning, eftersom de är manipulerade på en mikroflödessystem enhet, potentiellt kan aktivera låg kostnad, integrerade lab-on-a-chip enheter som är särskilt attraktiv för testning av prover inom mobil , resursbegränsade inställningar.
Tunnfilmselektroder har använts som integrerade sensorer i mikrofluidanordningar för olika tillämpningar 13, 14. Resistiv Pulse Sensing (RPS) är särskilt attraktiv för integrerad avkänning av små partiklar i mikroflödessystem kanaler, eftersom det ger en robust, känslig, och upptäckt mekanism hög genomströmning direkt från elektriska mätningar 15. I RPS, impedansen modulation mellan ett par elektroder, nedsänkt i en elektrolyt, används som ett medel för att detektera en partikel. När partikel passerar genom en öppning, dimensionerad i storleksordningen av partikeln, är antalet och amplituden för övergående pulserna i den elektriska ström som används för att räkna och storlek partiklar, respektive. Vidare kan sensorgeometrin utformas med en fotolitografisk upplösning att forma resistiva pulsvågformer i syfte att öka känsligheten 16, 17, 18, 19 eller för att uppskatta vertikala läget av partiklar i mikrofluidiska kanaler 20.
Vi har nyligen infört en skalbar och enkel multiplex resistiv puls sensing teknik som kallas mikroflödes Coded Orthogonal Detection av elektriska Sensing (Mikroflödes koder) 21. Mikroflödes KODER förlitar sig på ensammankopplade nätverk av resistiva pulssensorer, var och en bestående av en matris av elektroder mikrobearbetade för att modulera överledning på ett unikt, urskiljbart sätt, för att möjliggöra multiplexering. Vi har särskilt utformade varje sensor för att producera ortogonala elektriska signaler som liknar de digitala koder som används i koddelad multipelaccess 22 (CDMA) telekommunikationsnät, så att individuella resistiva pulssensorsignalen unikt kan återvinnas från en enda utgångs vågform, även om signaler från olika sensorer stör. På detta sätt, komprimerar vår teknik 2D rumslig information av partiklar in i en 1D elektrisk signal, som medger övervakning av partiklar vid olika platser på ett mikrofluidchip, och samtidigt hålla både enhets- och systemnivå komplexitet till ett minimum.
I detta papper presenterar vi ett detaljerat protokoll för experimentella och beräkningsmetoder som krävs för att använda mikroflödes KODER teknik, samt representative resultat från dess användning i analys av simulerade biologiska prover. Med hjälp av resultaten från en prototyp enhet med fyra multiplexerade sensorer som ett exempel för att förklara tekniken ger vi protokoll om (1) den mikro process för att skapa mikroflödes enheter med mikroflödessystem KODER teknik, (2) beskrivning av experimentuppställning inklusive elektroniska, optiska, och fluidisk hårdvara, (3) datoralgoritmen för avkodning interfererande signaler från olika sensorer, och (4) resultaten från detektion och analys av cancerceller i mikrofluidiska kanaler. Vi tror att med hjälp av den detaljerade protokoll som beskrivs här, kan andra forskare använda vår teknik för sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utformning av Coding elektroder
Notera: Figur 1a visar den tre-dimensionella struktur av de micropatterned elektroder.
- Utforma en uppsättning av fyra 7-bit Gold-koder för kodning av mikroflödessystem kanaler 23.
- Konstruera två linjära återkopplingsskift-register (LFSR), var och en representerar ett primitivt polynom.
- Använd LFSR att generera en föredragen par 7-bitars m -sequences.
- Cykliskt skifta den föredragna par av m -sequences och lägg dem i mod 2 för att generera fyra distinkta Gold-koder.
- Designa layouten av de kodande elektroder (Figur 1B).
- Placera tre elektrodterminaler, som representerar de positiva, negativa och referenselektroder på tre hörn.
- Rutt positiva och negativa elektroden spår på motsatta sidor av varje mikroflödeskanal.
- Sträcker sig positiva och negativa elektroder i denmikroflödessystem kanaler som elektrodfingrar, efter unikt tilldelat Gold kod (figur 1c).
- Placera referenselektroden i mellan de positiva och negativa elektrodfingrar.
- Placera positiva och negativa elektrod spår långt från de yttersta referenselektrodfingrar för att minimera elektrisk ledning utanför den kodande regionen.
2. Mikro av ytelektroder
Notera: Figur 2b visar tillverkningsprocessen av ytelektroder.
- Rengöra en 4-tums borosilikatglas wafer i en Piranha-lösning (98% svavelsyra: 30% väteperoxid = 5: 1) vid 120 ° C under 20 minuter för avlägsnande av alla organiska kontaminanter. Placera sedan wafer på en 200 ° C varm platta under 20 min för att avlägsna kvarvarande vatten.
- Överföra skivan till en spinner. Dispensera 2 mL negativ fotoresist på skivan och snurra skivan med en hastighet av 3, 000 rpm under 40 s för att likformigt belägga wafer med en 1,5-um fotoresistskikt.
- Placera brickan på en 150 ° C varm platta och grädda den spunna fotoresist under 1 min.
- Exponera fotoresisten till 365 nm UV-ljus (225 mJ / cm 2) genom en krommask med hjälp av en mask Aligner.
- Placera brickan på en 100 ° C varm platta och grädda den exponerade fotoresisten under 1 min.
- Utveckla fotoresisten genom nedsänkning av skivan i en fotoresist utvecklare (RD6) under 15 s. Spraya försiktigt avjoniserat (DI) vatten och tvätta skivan. Torr genom att blåsa komprimerad kväve.
- Placera skivan med mönstrade fotoresist i ett e-beam metall förångare, och sätta en 20-nm-tjock kromfilm, följt av en 80-nm-tjock guldfilm på skivan vid ett bastryck av 3 x 10 -6 Torr med en förångningshastighet på 1 Å / s.
- Sänka ned metallbelagda skivan i aceton i ett ultraljudsbad uppsättning vid en frekvens av 40 kHz med 100% amplitud under 30 min vid rums-temperratur för att etsa det underliggande fotoresist och slutföra lift-off process.
- Tärna skivan i mindre bitar med hjälp av en konventionell tärningssågen.
3. Tillverkning av SU-8 Form för mikroflödessystem kanaler
Notera: Figur 2a visar tillverkningsprocessen av formen för mikroflödeskanaler.
- Rengör och baka en 4-tums kiselskiva med användning av samma förfarande som beskrivs i 2.1.
- Överföra skivan till en spinner. Häll 4 mL fotoresist på skivan. Coat skivan med fotoresist.
- Snurra rånet vid 500 rpm under 15 s.
- Snurra skivan vid 1000 rpm under 15 s.
- Snurra skivan vid 3000 rpm under 60 s för att erhålla ett likformigt belagt 15-pm tjockt fotoresistskikt.
- Placera skivan med framsidan upp på ett renrum torka indränkt i aceton och avlägsna kvarvarande fotoresist från baksidan och kanterna på den tunna skivan.
- Överför skivan på en varm plåt för mjuk bakning. Först, baka rånet vid 65 ° C under 1 min. Sedan snabbt flytta skivan till en 95 ° C varm platta och grädda i 2 min.
- Exponera fotoresisten till 365 nm UV-ljus (180 mJ / cm 2) genom en krommask med hjälp av en mask Aligner.
- Baka skivan efter exponering vid 65 ° C under 1 min och därefter vid 95 ° C under 2 min.
- Sänk skivan i utvecklare och försiktigt skaka behållaren för 3 minuter. Sedan, skölj skivan med isopropanol alkohol (IPA) och torka den genom att blåsa komprimerad kväve. Om en vitfärgad rest visas på skivan, doppa den in i utvecklaren igen och utvecklas under längre tid och torr.
- Baka skivan på en 200 ° C het platta under 30 minuter för att torka den fullständigt.
- Mäta tjockleken på det mönstrade fotoresisten med hjälp av en profilometer på olika platser över hela skivan för att säkerställa enhetlighet.
- Silaniseras formskiva genom användning av tekniken för ångavsättning. Tillsätt 200 | il av trichlorosilane i en petriskål och placera i en vakuumexsickator tillsammans med SU-8 mögel wafer under 8 timmar.
4. Montering av mikroflödes KODER Device
- Placera fyra-tums kiselskiva med formen i en 150 mm diameter petriskål, och fixa det genom att tejpa från dess kanter.
- Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) pre-polymer och tvärbindare i ett förhållande av 10: 1, och häll 50 g av blandningen in i petriskål. Placera petriskålen i en vakuumexsickator för att avgasa blandningen under 1 h, och sedan härda den i en ugn vid 65 ° C under åtminstone 4 h (figur 2A).
- Klipp ut den härdade PDMS lagret med hjälp av en skalpell och pilla bort formskiva med hjälp av en pincett. Storleken på proof-of-principle enheten är cirka 20 mm x 7 mm. stansa sedan hål med en diameter av 1,5 mm genom de PDMS för inlopp och utlopp av mikroflödeskanalen med användning av en biopsistans.
- Rengör mönstrade sidan av PDMS del genom att placera it på en renrums tejp.
- Rengör glassubstrat med ytelektroder genom att skölja den med aceton, IPA, DI vatten och torka med hjälp av komprimerad kväve.
- Aktivera ytor PDMS och glassubstrat i syrgasplasma under 30 s med mikrobearbetade sidan av varje del uppåt i en RF-plasmagenerator inställd på 100 mW.
- Rikta in PDMS mikroflödessystem kanal med ytelektroder på glassubstrat med användning av ett optiskt mikroskop och sedan föra de två plasmaaktiverade ytor i fysisk kontakt.
- Baka enheten i ett 70 ° C värmeplatta i 5 min, med glassidan är vänd mot värmeplatta.
- Ansluta kontaktkuddarna för de elektroder med ledningar genom lödning.
5. Framställning av den simulerade biologiska provet
- Kultur de HeyA8 humana ovariala cancerceller i RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin i 5% CO2 atmosfär vid 37 ° Ctills de når 80% konfluens.
- Aspirera media från odlingskolven med hjälp av en glaspipett. Dispensera och sedan aspirera 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att tvätta cellerna.
- Inkubera cellerna i 2 ml 0,05% (vikt / volym) trypsinlösning under 2 minuter vid 37 ° C för att suspendera fastsittande celler. Sedan, tillsätt 4 ml av odlingsmedier för att neutralisera trypsin.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 100 x g under 5 min för att pelletera cellerna i ett provrör. Därefter aspirera supernatanten fullständigt.
- Återsuspendera cellerna i 1-2 ml 1x PBS genom att försiktigt pipettera upp och ner för att mekaniskt dissociera cellklumpar.
- Dra en liten mängd cellsuspension i en pipett och räkna antalet celler med användning av hemocytometer.
- Späd cellsuspensionen med PBS för att framställa ett prov med slutlig cellkoncentration av 10 5 -10 6 celler / ml.
6. Köra mikroflödes KODER Device
Obs: Figur 3 visar experimentuppställning.
- Placera mikroflödes KODER enheten på scenen av ett optiskt mikroskop.
- Tillämpa en 400 kHz sinuskurva till referenselektroden på chipet med användning av en elektronisk funktion generator.
- Anslut positiva och negativa avkänningselektroder till två oberoende trans-impedans förstärkare för att omvandla strömsignaler från vardera till spänningssignaler.
- Subtrahera den positiva avkänningselektroden spänningssignalen från den negativa avkänningselektroden spänningssignal med användning av en differentialspänningsförstärkare i syfte att erhålla en bipolär signal.
- Använd en höghastighetskamera för att optiskt register driften av anordning för validering och karakteriseringsändamål.
- Driva cellsuspensionen genom Mikroflödes KODER anordningen vid en konstant flödeshastighet (50-1000 | il / h) med användning av en sprutpump.
- Mäta impedansen modulationssignalen med användning av en synkroniseringsförstärkare.
- Ansluta referensväxelspänningssignalen till refrens ingången på lock-in-förstärkare. Anslut differential bipolära signalen till lock-in-förstärkare som insignal.
- Erhålla RMS amplituden hos differentialsignalen från lock-in-förstärkarens utgång.
- Sampla synkroniseringsförstärkare utsignal vid en MHz hastighet in i en dator genom en dataupptagningskortet för ytterligare analys.
7. Behandling av sensorsignaler
- Överföra inspelade elektriska data i MATLAB för efterbearbetning och avkodning.
- Filtrera den inspelade signalen i den digitala domänen med hjälp av ett Butterworth-filter (MATLAB inbyggd funktion) för att avlägsna högfrekventa ljud (> 2,5 kHz).
- Skapa en mall kodbibliotek från sensorsignaler.
- Identifiera representativa icke-överlappande kodsignaler som motsvarar varje sensor i anordningen och extrahera dessa signal kvarter från dataset som separata vektorer vågform.
- Normalisera varje mallkoden vågform vektorav sin makt. Använda MATLAB inbyggd funktion (bandpower) för att mäta signaleffekten.
- Använd MATLAB funktion (sampla) för att expandera mallen bibliotek genom digitalt att skapa versioner av normaliserade kodsignaler med varierande löptider för att klara variationer i cellströmningshastigheten över elektroderna.
- Identifiera signalblock som motsvarar sensor aktivitet (tröskel: SNR> 12 dB) i den filtrerade vågformen. Vågform med SNR under tröskeln skulle behandlas som brus.
- Avkoda enskilda block av sensorverksamhet i den inspelade signalen genom att använda en iterativ algoritm baserad på successiv interferenseliminerings, en teknik som vanligen används i flera användare CDMA kommunikationsnät 24, 25.
- Beräkna korskorrelationen för varje signalblock med alla mallarna i biblioteket med hjälp av glidande skalärprodukten.
- Identifiera den mall som producerar largest autokorrelationstoppen för att bestämma den dominerande individuell sensor kodsignalen. Registrera den både tid och amplitud av autokorrelationstoppen.
- Konstruera en uppskattning sensor kodsignal genom att skala den identifierade koden mall baserad på den uppmätta autokorrelationstoppen amplitud och tidsinformation (bestämd i steg 7.5.2).
- Subtrahera den beräknade sensorkoden signal från originaldata.
- Iterera processen från 7.5.1, tills restsignalen inte liknar någon signal i mallen bibliotek, matematiskt definieras som korrelationskoefficienten är mindre än 0,5.
- Förfina första sensorsignalen uppskattningar från steg 7,5 med hjälp av en optimeringsprocess.
- Rekonstruera signalen genom att addera beräknade individuella sensorsignaler från varje iteration.
- Sopa amplitud, varaktighet och tidpunkten för enskilda sensorsignaler runt de ursprungliga beräkningarna för att producera den bästa passform med den inspelade elektriska signalenbaserat på minsta kvadrat-approximation 26.
- Konvertera amplituderna hos uppskattade sensorsignaler in i cellstorlek genom att kalibrera elektriska signaler mot optiska bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mikroflödes KODER anordning som består av fyra sensorer fördelade över fyra mikroflödessystem kanaler visas i figur 1b. I detta system, var tvärsnittet av varje mikroflödeskanal utformad för att vara nära till storleken på en cell så att (1) flera celler inte kan passera över elektroderna i parallella och (2) celler förblir nära elektroderna öka känsligheten . Varje sensor är utformad för att generera ett unikt 7-bitars digital kod. Anordningen testades sedan med användning av en cellsuspension. Inspelade elektriska signaler, som motsvarar fyra individuella sensorer är visade med associerade ideala digitala koder i figur 4. Inspelade signaler nära matcha med den ideala fyrkantpulser, medan existerar små avvikelser. Sådana avvikelser beror på en kombination av flera faktorer, bland annat den olikformiga elektriska fält mellan samma plan elektroder koppling mellan olika elektrodpar, sfärisk formceller, såväl som den konstanta flödeshastigheten hos celler i mikroflödessystem kanaler. Vi skapade en mall bibliotek baserat på den omkodade sensorsignalerna. Genom att korrelera de registrerade signalerna med alla mallarna i biblioteket, bestämde vi en mall som produceras den maximala autokorrelationstopp (figur 4). Som de digitala koderna för mikroflödeskanaler är utformade för att vara ortogonala mot varandra, kan en dominant autokorrelationstoppen robust identifieras i denna process. Användning av detta tillvägagångssätt kunde vi beräkningsmässigt bestämma den mikroflödeskanalen cellen att passera genom, varaktigheten av sensorsignalen, och därmed flödeshastigheten hos cellen.
Den mikroflödesKODER tekniken kan lösa situationer när flera celler interagerar samtidigt med kodnings elektroder. När sådana överlappningar förekommer, signalerna från enskilda givare ingripa och den resulterande vågformen kan inte lätt att förknippas med någonenda mall som motsvarar en specifik sensor. Noggrant avkoda sådana överlappande signaler är särskilt viktigt för tillförlitlig bearbetning med hög densitet prover, där störningar är mer sannolikt att inträffa. Lös överlappande händelser, utvecklade vi en iterativ algoritm baserad på en successiv interferenskancellering (SIC) schema 24, 25, som normalt används för fleranvändardetektering i CDMA kommunikationsnät. Figur 5 visar hur SIC-algoritmen implementeras för att lösa en vågform som resulterade från fyra överlappande celler i fyra olika mikroflödessystem kanaler. I varje iteration, bestäms först vi den dominerande autokorrelationstoppen (figur 5a, 2 nd kolonn), vilket motsvarar den starkaste interfererande signalen, genom att korrelera den ingående vågformen (fig 5a, 1 st-kolonn) med mallbibliotek. Baserat på den valda mallen och than resulteautokorrelations amplitud, vi sedan uppskattade starkaste störsignalen (figur 5a, 3: e kolumnen) och subtraheras den från ingångs vågformen. Den återstående vågformen leddes över till nästa iteration som ingång. Denna process fortsatte tills korrelationen av restsignalen med mallen biblioteket producerade inte en tydlig autokorrelationstoppen (figur 5a, 5: e raden, 2 nd plot). Efter avslutningen av interferenselimineringsprocessen, rekonstruerade vi en uppskattning av vågformen genom att kombinera alla de beräknade signaler från varje iteration (figur 6a). Använda en optimeringsprocess baserad på en minsta kvadrat approximation för att minimera medelkvadratfelet mellan den ursprungliga vågformen och den rekonstruerade signalen, vi uppdaterat våra uppskattningar för amplitud, varaktighet och relativa timingen för enskilda sensor kodsignaler (figur 6b). Vi uppskattade också storleken påcellerna detekteras baserat på amplituden hos de beräknade individuella sensorsignaler. För att uppnå detta, kalibrerad vi de elektriska signalamplituder med optiskt uppmätta cellstorlekar med användning av linjär regression (figur 6b). En jämförelse av våra resultat från mikroflödes koder med den information som erhållits från de samtidigt inspelade mikroskopbilder höghastighets visar att cellstorleken och hastigheten kan mätas exakt, som validerar våra resultat (tabell 1). Figur 6c visar samtidigt registreras höghastighetsmikroskopbild som används för att validera avkodningsresultatet.
För att visa reproducerbarhet våra resultat och även utförandet av mikroflödessystem KODER teknik för hög genomströmning urval bearbetning, analyserade vi elektriska signaler som motsvarar> 1000 celler. Signalerna automatiskt avkodas i MATLAB genom att köra algoritmen förklaradeovan och riktigheten i våra resultat utvärderades genom direkt jämföra våra resultat med optiska data från samtidigt registreras höghastighetsvideo. Vår analys visar att elektriska signaler från 96,15% av celler (973/1012) var noggrant avkodas. Framgång för avkodning icke-överlappande och överlappande cellsignalerna är 98,71% (688/697) och 90,48% (285/315), respektive.
Figur 1. Design av de fyra-kanalen Mikroflödes KODER enhet. (A) Elektroder i varje mikroflödeskanal är Micropatterned för att generera en unik digital kod. Impedansen modulering till följd av sekventiella interaktioner av strömmande celler med elektrodparen leder till elektriska pulser. (B) En mikroskopbild av det mikroflödes KODER anordningen. Under tillverkningsprocessen, är glassubstrat med kodnings ytelektroder linje med PDMS mikroflödessystem kanaler under ett mikroskop. (C) En närbild bild av kodade ytelektroder producerar 7-bitars guld sekvenser: "1.010.110", "0.111.111", "0.100.010", "0.011.000". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mikro process. (A) De PDMS mikroflödessystem kanaler tillverkas med hjälp av mjuk litografi 27. (B) De ytelektroder är tillverkade med hjälp av en lift-off process. (C) Ett schematiskt tvärsnitt av den slutliga anordningen. PDMS mikroflödessystem kanaler är inriktade och bundna till glassubstratet med ytelektroder. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Experimentuppställning. Med en sprutpump, är cellsuspensionen löpa genom Mikroflödes KODER anordningen vid en konstant flödeshastighet. En 400 kHz växelströmssignal appliceras på referenselektroden med användning av en funktionsgenerator. Strömsignaler från positiva och negativa avkänningselektroder först omvandlas till spänningssignaler med användning av två transimpedansförstärkare och subtraheras från varandra med hjälp av en differentialförstärkare. Differential bipolär signal extraheras genom en lock-in förstärkare och sedan samlas upp i en dator för signalbehandling och avkodning. Höghastighets optisk mikroskopi används för att optiskt register driften av anordning för validering och karakteriseringsändamål.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Inspelade elektriska signaler från enskilda givare och deras samband. Inspelade signaler och deras korrelation med varandra ges för fyra kod-multiplexerade resistiv pulsgivare. Sensor 1 (a), var sensorn 2 (b), sensor 3 (c) och sensorn 4 (d) utformad för att producera 7-bitars digitala vågformer "1010110", "0111111", "0100010", och "0011000", respektive . För varje sensor, visar topp siffra som normaliserade signalen spelats in från varje sensor överensstämmer nära med den ideala fyrkantspuls-sekvensen att sensorn var utformad för att producera. För varje sensor, visar den nedre panelen inspelad sensorsignal9; s autokorrelation och korskorrelation med signaler som motsvarar tre andra kod-multiplexerad sensorer i nätet. I samtliga fall kan en autokorrelationstopp robust identifieras eftersom de digitala koder från enskilda sensorer är utformade för att vara vinkelräta mot varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Avkodning ett överlappande vågform med successiv interferensSpärr. I varje iteration, är den ingående vågformen (1 st-kolonn) korrelerad med den förmonterade mallbibliotek för att identifiera den specifika mall som resulterar i det maximala korrelations amplitud (2 nd kolumnen). Med hjälp av denna specifika mall, är den starkaste störsignalen uppskattas baserat på amplitudenoch tidsinformation från korrelationstoppen (3: e kolumnen). Den uppskattade signalen subtraheras sedan från den ursprungliga vågformen, på ett effektivt sätt avbryta den starkaste interferens på grund av den största cellen. Processen upprepas tills ingen korrelationstopp kan bestämmas (dvs korrelationskoefficient <0,5) i restsignalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Avkodning resultatanalys. (A) Beräknade signaler förfinas baserat på ett optimeringsalgoritm som syftar till att få den bästa passformen mellan den rekonstruerade och den ursprungliga inspelade vågform med hjälp av approximation minsta kvadrat. (B) Vid slutet av optimeringsprocessen,tidpunkten och amplitud kalibrerade signalerna spegla cell parametrar som mäts av höghastighets mikroskopi. (C) Samtidigt registreras höghastighetsmikroskopbild bekräftar våra resultat från elektriska mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| mätning typ | r ch1 (| im) | r ch2 (| im) | r ch3 (| im) | r CH4 (| im) | At 1 (ms) | At 2 (ms) | At 3 (ms) |
| Elektrisk | 8,010 | 6,490 | 5,300 | 6,550 | 0,465 | 1,705 | 0,744 |
| Optisk | 8,320 | 6,770 | 5,680 | 7,040 | 0,375 | 1,625 | 0,750 |
Tabell 1. Jämförelse av elektriskt och optiskt mätta cellparametrar av figur 6b. För att validera våra uppskattningar, vi optiskt mätt cellstorlekar från höghastighetsmikroskopbild. Relativa timingen mellan olika celler optiskt mätt från antalet bildrutor mellan cellerna i hög hastighet video inspelad på 8000 bildrutor per sekund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multipla resistiva pulssensorer har tidigare införlivats i mikroflödeschip 28, 29, 30, 31, 32. I dessa system har resistiva pulssensorer antingen inte multiplexeras 28, 29, 30, 31 eller de som krävs för enskilda sensorer att drivas vid olika frekvenser 32. I båda fallen var dedikerade externa anslutningar behövs för varje resistiv pulsgivare på chipet och därmed ett stort antal sensorer inte kan integreras utan större hårdvarukomplexiteten. Den viktiga fördelen att Mikroflödes KODER är att den tillåter samtidig läsning av flera resistiva pulssensorer från en enda utgång i en enkel anordning. Vi uppnår detta genom att använda multiplexing tekniker som vanligen används inom telekommunikation för att utforma mikrobearbetade resistiv sensorer integrerade i mikroflödessystem enheter. I huvudsak bygger vår teknik på kod-multiplexering ett nätverk av on-chip Coulter räknare genom att utforma varje för att producera en urskiljbar signal när en partikel detekteras. Varje mikrobearbetade givare i nätverket består av flera i samma plan ytelektroder ordnade i olika konfigurationer så att den sekventiella samverkan mellan flödande partiklar med dessa elektroder ger ortogonala impedans module vågformer. Att rymma asynkron interaktion partikel-sensor, vi särskilt utformade varje sensor för att producera Gold-koder 33, pseudo-ortogonala digitala koder som vanligtvis används i upplänken av CDMA-telekommunikationsnät. Gold-koder upprätthålla en viss nivå ortogonalitet även om de kommit på sned med slumpmässig fasskillnader 34.
Microfluidic KODER är skalbar. Även om vi presenterade resultat från en prototyp mikroflödes KODER enhet med fyra sensorer i detta dokument, kan flera sensorer ingå i enheten när utformad för att producera utsignaler skiljas från resten. Ett sätt att utöka sensornätverket är att utforma sensorer baserade på större ortogonala koduppsättningar med längre digitala koder. Längre ortogonala koder med fler bitar ger högre behandlingsförstärkning i avkodning och kan skiljas från varandra när det finns störningar. Å andra sidan, längre Gold-koder i anordningen innebär också större mätutrymmet, vilket ökar den förväntade antalet interfererande sensorer. På samma sätt kommer en ökning av antalet sensorer för en given provdensitet leda till att fler partiklar överlappande på grund av en ökning av den totala mätutrymmet. Som sådan, är densiteten hos partiklarna i provet en kritisk parameter som måste beaktas vid användning av mikroflödes KODER teknik. Den maximala partikeln densitet som kan lösas (i analogi med kanalkapaciteten i ett CDMA telekommunikationsnät) beror på flera faktorer, såsom de individuella sensorsignaler och deras relation, avkodningsschema, layout av mikroflödessystem enhet, och den elektroniska ljudnivån. Beroende på tillämpningen, kan provet spädas för att nå en partikeldensitet som producerar en acceptabel felfrekvens.
Från signalbehandlings perspektiv, är avkodning av tids vågformer från en mikroflödessystem KODER enhet inte beräkningsintensiv med dagens system vilket bevisas av det faktum att mobilen kommunikation på ett CDMA-nätverk kan demultiplexeras i realtid. Dessutom är de fysiska händelser avkodas i mikrofluidikanordningar hända mycket långsammare än bit överföringshastighet i mobiltelefon kommunikation gör det möjligt att använda mer avancerade och tidskrävande algoritmer såsom SIC och en optimering processer, som vi använder för att iterativt lösa överlappande signals från sensorer.
Sammantaget är Mikroflödes KODER en mångsidig, skalbar elektronisk avkänning teknik som lätt kan integreras i olika mikroflödessystem enheter att realisera kvantitativa analyser genom att spåra partiklar när de behandlas på chipet. Tekniken är mycket lätt att genomföra, eftersom (1) det är mycket enkelt från ett hårdvaruperspektiv (2) den är direkt kompatibel med mjuk litografi (3) den tillhandahåller en direkt elektronisk avläsning utan någon aktiv on-chip-komponent, och (4) det bygger på enkla beräkningsalgoritmer för signalbehandling och tolkning av data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
