Summary
Birden mikroakışkan kanallarda parçacıkların algılama ve boyutlandırma multipleks için, kod bölmeli çoklu erişim (CDMA) ile rezistif darbe algılama (RPS) birleştiren entegre bir yüzey elektrot ağı ile mikroakışkan platformu göstermektedir.
Abstract
Biyolojik numunelerin mikroakışkan işlem tipik olarak, uzaysal ilgi biyolojik bir özelliğine göre örnek damıtmak için çeşitli güç alanı altında asılı parçacıkların ayırıcı işlemlerini içerir. Elde edilen alansal dağılımı deney, okuma çıkışı olarak kullanılabilir için, mikro-akışkan cihazlar genellikle daha yüksek maliyeti ve indirgenmiş taşınabilirlik karmaşık aletleri gerektiren mikroskopik analizine tabi tutulurlar. Bu sınırlama gidermek için, biz bir mikroakışkan çip üzerinde farklı yerlerde parçacıkların çoklanmış tespiti için entegre bir elektronik algılama teknolojisini geliştirdik. Mikroakışkan KODLARI denilen Bizim teknoloji, bir 1D elektrik sinyaline içine 2D uzamsal bilgiyi sıkıştırmak için Kod Bölmeli Çoklu Erişim ile Dirençli Darbe Algılama birleştirir. Bu yazıda, mikroakışkan KODLARI teknolojinin pratik bir gösteri tespit etmek ve boyut kültürlü kanser hücreleri birden mikroakışkan kanallar üzerinden dağıtılan sunuyoruz. Gibiyüksek hızlı mikroskopi tarafından doğrulandığı, teknoloji doğru harici cihaz için gerek kalmadan tüm elektronik yoğun hücre popülasyonlarının analiz edebilirsiniz. Bu nedenle, mikroakışkan KODLARI potansiyel biyolojik örneklerin noktası bakım testleri için uygundur düşük maliyetli entegre lab-on-a-chip cihazlar etkinleştirebilirsiniz.
Introduction
Bu sıvı içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler, bakteri ya da virüsler gibi biyolojik parçacıkların doğru algılama ve analiz uygulamaları, 1, 2, 3, bir dizi büyük ilgi görmektedir. Boyutunda çok iyi bir uyum, mikroakışkan cihazlar, yüksek hassasiyet, yumuşak örnek manipülasyon ve iyi kontrollü mikroçevresinin 4, 5, 6, 7 gibi bu amaç için benzersiz avantajlar sunuyor. Buna ek olarak, mikro-akışkan cihazlar pasif çeşitli özellikleri 8, 9, 10, 11, 12, biyolojik partiküllerin heterojen bir popülasyonu fraksiyonlanması akışkan dinamiği ve kuvvet alanları bir arada kullanılması için tasarlanmış olabilir. Bu cihazdas, sonuçta çıkan partikül dağılımını, okuma çıktısı olarak kullanılabilir, ancak konumsal bilgi bir laboratuar alt için bağlayarak mikroakışkan cihazın pratik yarar sınırlama sadece mikroskobu ile tipik olarak erişilebilir. Bu nedenle, bir mikroakışkan cihaz üzerinde manipüle gibi kolayca, parçacığın zamanmekansal eşleme bildirebilirim entegre sensör, potansiyel olarak düşük maliyetli, mobil numunelerin test edilmesi için özellikle çekici olan entegre lab-on-a-chip cihazlar etkinleştirebilirsiniz , kaynakları sınırlı ayarlar.
İnce film elektrotların çeşitli uygulamalar 13, 14 için mikroakışkan cihazlar entegre sensör olarak kullanılmıştır. Dirençli Darbe Algılama (RPS) elektrikli ölçümlerin 15 doğrudan, sağlam, hassas ve yüksek verimli algılama mekanizması sunuyor mikroakışkan kanallarda küçük partiküllerin entegre algılama için caziptir. RPS olarak, bir elektroliti içine daldırılmış bir elektrot çifti arasındaki empedans modülasyonu, bir parçacık tespit etmek için bir araç olarak kullanılır. Parçacık bir delikten geçerken, tanecik mertebesinde boyutlu, sayı ve elektrik akımı, geçici darbelerin genliği, sırasıyla, sayısı ve büyüklüğü parçacıkların için kullanılır. Ayrıca, sensör geometrisi duyarlılığı 16, 17, 18, 19 artırmak için ya mikroakışkan kanal 20 içindeki parçacıkların dikey konumunu tahmin etmek için mukavemet darbesi dalga şekillerini şekil fotolitografik çözünürlükte tasarlanabilir.
Biz son zamanlarda Elektrik Algılama (mikroakışkan KODLARI) 21 tarafından mikroakışkan Kodlu Ortogonal Algılama denilen ölçeklenebilir ve basit çoklanmış direnç darbe algılama teknolojisini tanıttı. Mikroakışkan KODLARI bir dayanmaktadırdirenç darbe sensörleri ağından çoklama sağlayacak şekilde her biri bir benzersiz ayırt edici bir şekilde iletimini modüle etmek için mikro boyuttaki elektrotlar bir dizi ihtiva etmektedir. Biz özellikle kod bölmeli çoklu erişim kullanılan dijital kodları benzer dik elektrik sinyalleri üretmek için her sensör tasarladık 22 (CDMA) telekomünikasyon ağları, bireysel rezistif nabız sensörü sinyal benzersiz, tek bir çıkış dalga elde edilebilir ve böylece bile sinyallerinden eğer farklı sensörler müdahale. Bu şekilde, bizim teknolojinin en az aygıta ve sistem düzeyinde daha karmaşık bir tutarken, mikroakışkan çip üzerinde farklı konumlarda parçacıkların izlenmesine izin veren bir 1D elektrik sinyaline parçacıkların 2B uzamsal bilgiler sıkıştırır.
Bu yazıda, deneysel ve hesaplamalı mikroakışkan KODLARI teknolojiyi kullanmak için gerekli yöntemler yanı sıra r için ayrıntılı bir protokol mevcutsimüle biyolojik numunelerin analizi kullanımı ile ilgili epresentative oluşur. tekniği açıklamak için bir örnek olarak dört çoklanmış sensörlerle bir prototip cihaz sonuçlarını kullanarak, (2) deney düzeneği açıklama da dahil olmak üzere mikroakışkan KODLARI teknolojisi ile mikroakışkan cihazlar oluşturmak için (1) mikroimalat sürecinde protokolleri sağlamak elektronik, optik, ve akışkan bir donanım, (3) farklı sensörlerden müdahale sinyallerin dekode edilmesi için bir bilgisayar algoritması, ve (4) tespit edilmesi ve mikroakışkan kanal kanser hücrelerinin analiz sonuçları. Biz ayrıntılı bir protokol kullanarak burada anlatılan, diğer araştırmacıların araştırma için bizim teknoloji uygulayabilirsiniz inanıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kodlama Elektrotların 1. Tasarım
Not: Şekil 1a micropatterned elektrotlar 3-D yapısını göstermektedir.
- Mikroakışkan kanal 23 kodlama için dört adet 7-bitlik Altın kodları bir dizi tasarlayın.
- İki doğrusal geri beslemeli kayan-register (LFSRs), ilkel bir polinomu temsil eden her Construct.
- 7-bit m dizileridir bir tercih çifti oluşturmak için LFSRs kullanın.
- Döngüsel m dizileridir tercih çifti kayması ve dört ayrı altın kodları oluşturmak için mod 2 ekleyebilirsiniz.
- Kodlama elektrotlar (Şekil 1b) düzenini tasarlayın.
- Üç köşelerde pozitif, negatif ve referans elektrotlar temsil üç elektrot terminalleri yerleştirin.
- Rota pozitif ve negatif elektrot, her mikroakışkan kanal karşıt taraflarında izler.
- içine pozitif ve negatif elektrotlar uzatınbenzersiz atanan Altın kodu (Şekil 1c) Aşağıdaki elektrot parmaklar gibi mikroakışkan kanallar.
- Pozitif ve negatif elektrot parmakları arasında referans elektrot yerleştirin.
- kodlama bölgesinin dışında elektriksel iletimin en aza indirmek için çok dış referans elektrotu parmaklarından pozitif ve negatif elektrot izleri yerleştirin.
Yüzey Elektrotların 2. Mikro ve
Not: Şekil 2b yüzey elektrot üretim süreci gösterir.
- bir pirana çözelti 4 inçlik bir borosilikat cam levhanın temizlenmesi (% 98 sülfürik asit:% 30 hidrojen peroksit = 5: 1), 20 dakika boyunca tüm organik kirleri çıkarmak için 120 ° C'de. 20 dakika artık suyun ayrılması için daha sonra 200 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin.
- Bir spinner için gofret aktarın. gofret üzerine 2 mL negatif ışığa dağıtın ve 3 hızında gofret dönmeye, Muntazam olarak örtmesi 40 s 1.5 mikron fotorezist tabakası ile gofret için 000 rpm.
- 150 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin ve 1 dakika boyunca döndürülmüştür ışığa fırında.
- Bir maske hizalama kullanarak bir krom maske aracılığıyla 365 nm UV ışık (225 mJ / cm2) ile ışığa maruz.
- 100 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin ve 1 dakika boyunca maruz kalan ışığa fırında.
- 15 saniye boyunca bir fotorezist geliştirici (RD6) gofret daldırarak ışığa geliştirin. Yavaşça deiyonize (DI) su püskürtün ve gofret yıkayın. sıkıştırılmış azot üfleyerek kuru.
- E-demeti metal buharlaştıncıya desenli fotorezist ile gofret yerleştirin ve 3 x 10 -6 Torr bir taban baskısı ile en gofret üzerine 80 nm-kalınlıkta bir altın filmi, ardından 20 nm-kalınlıkta bir krom içermeyen bir film, yatırma 1 a / s 'lik bir depozisyon oranı.
- Oda tav 30 dakika boyunca% 100 genliği ile 40 kHz arasında bir frekansta ultrasonik banyo seti aseton içine metal kaplı gofret daldırınAltta yatan ışığa etch ve kalkış işlemini tamamlamak için çalıçtırdıgınızda.
- geleneksel dicing testere kullanarak küçük parçalar halinde gofret zar.
Mikroakışkan Kanallar için SU-8 Kalıp 3. Fabrikasyon
Not: Şekil 2a mikroakışkan kanallar için kalıbın üretim süreci gösterir.
- Temizleyin ve 2.1 açıklanan aynı prosedürü kullanarak bir 4-inç çaplı silisyum gofret pişirin.
- Bir spinner için gofret aktarın. gofret üzerine 4 mL ışığa dökün. Coat fotorezist ile gofret.
- 15 saniye için 500 rpm'de gofret dönerler.
- 15 saniye için 1.000 rpm'de gofret Spin.
- 60 s üniform kaplanmış 15-mikron kalınlığında fotorezist tabakası elde etmek için 3000 rpm'de gofret Spin.
- Bir temiz oda silin aseton batırılmış üzerinde gofret yüzü yukarı bakacak ve arka ve gofret kenarlarından kalan ışığa çıkarmak.
- Sıcak bir pl üzerine gofret aktarınYumuşak pişirme için yedi. İlk olarak, 1 dakika için 65 ° C 'de gofret fırında. Sonra hızlı bir şekilde 95 ° C sıcak plaka gofret taşımak ve 2 dakika pişirin.
- Bir maske hizalama kullanarak krom maske aracılığıyla 365 nm UV ışık (180 mJ / cm2) ile ışığa maruz.
- 1 dakika için 65 ° C 'de gofret, aşağıdaki maruz fırında ve 2 dakika süre daha sonra at 95 ° C.
- geliştirici gofret daldırın ve yavaşça 3 dakika kabı çalkalayın. Ardından, izopropanol alkol (IPA) ile gofret durulayın ve sıkıştırılmış azot üfleyerek kurulayın. beyaz renkli kalıntı gofret belirirse, yeniden geliştirici içine batırmak ve daha uzun süre ve kuru için gelişir.
- tamamen kuruması için 30 dakika için 200 ° C sıcak plaka üzerinde gofret fırında.
- bütünlüğü sağlamak için gofret genelinde farklı yerlerde bir profilometre kullanılarak desenli paslanmaz çeliğin kalınlığını ölçün.
- buhar kaplama tekniği kullanılarak kalıba gofret Silanize. tr 200 uL ekleyin8 saat için SU-8, kalıp gofret ile birlikte bir vakumlu kurutucuda bir Petri kabı ve yerine ichlorosilane.
Mikroakışkan KODLARI Cihazın 4. Meclis
- 150 mm çaplı Petri kabındaki kalıp 4-inç çaplı silisyum gofret yerleştirin ve kenarlarından itibaren bantlama ile sabitleyin.
- 10 oranında polidimetilsiloksan (PDMS) ön polimer ve çapraz bağlayıcının karıştırın: 1 ve Petri kabına karışımı 50 g dökün. 1 saat boyunca gaz çıkışına karışımı bir vakum kurutucu içinde Petri tabağına yerleştirin, ve daha sonra en az 4 saat (Şekil 2a) için 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde onu tedavi.
- Bir neşter kullanılarak tedavi PDMS katman kesip bir cımbız kullanarak kalıp gofret o soyulabilir. kanıtı prensibi cihazının boyutu yaklaşık 20 mm x 7 mm. Sonra biyopsi zımba kullanarak mikroakışkan kanal girişi ve çıkışı için PDMS ile 1,5 mm çapında delikler.
- i yerleştirerek PDMS parçası desenli tarafını temizlemekBir temiz oda yapışkan bant t.
- aseton, IPA ve saf su ile durulama ile alanlı elektrodlara sahip cam alt-tabakanın temizlenmesi ve basınçlı azot ile kurutulur.
- 100 mW ayarlanmış bir RF plazma jeneratörü yukarı bakacak şekilde her parçasının Mikroişlenmiş tarafı ile 30 s için, oksijen plazma içinde PDMS yüzeyleri ve cam substrat etkinleştirir.
- Cam alt tabaka üzerindeki yüzey elektrotları fiziksel temas içinde iki plazma aktive yüzeyleri getirin, sonra bir optik mikroskop kullanılarak ve PDMS mikroakışkan kanal hizalayın.
- sıcak plaka cam kaplama yüzü 5 dakika boyunca 70 ° C sıcak plaka aygıtı fırında.
- lehim ile tellerle elektrotların temas pedleri bağlayın.
Simüle biyolojik numunenin 5. hazırlanması
- RPMI 1640 içinde kültür HeyA8 insan yumurtalık kanseri hücreleri, 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin CO2 atmosferinde% 5 ile desteklenmiş% 80 izdiham ulaşana kadar.
- Bir cam pipet kullanarak kültür şişesi medya aspire. Koyun ve aspirat 1X fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkamak için kullanılır.
- 37 ° C'de 2 dakika boyunca tripsin çözeltisi (ağ / hac) yapışık hücrelerin süspansiyonu 2 mL% 0.05 hücreleri inkübe edin. Daha sonra, tripsin nötralize edilmesi için, kültür ortamının 4 ml.
- Santrifüj, 5 dakika boyunca 100 x g'da hücre süspansiyonu, bir test tüpü içinde pelet hücreleri. Sonra, aspirat süpernatant tamamen.
- Hafifçe yukarı pipetleme ve mekanik ayırmak hücre kümeleri aşağı 1-2 ml 1x PBS hücrelerin yeniden askıya.
- Bir pipet içine hücre süspansiyonu küçük bir miktar çizin ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını.
- 10 5 -10 6 hücre / ml nihai hücre konsantrasyonuna sahip bir numune hazırlamak için PBS ile hücre süspansiyonu seyreltilir.
6. mikroakışkan KODLARI Cihaz Koşu
Not: Fişekil 3 deney düzeneği gösterir.
- Optik mikroskop sahnede mikroakışkan KODLARI cihazı yerleştirin.
- elektronik fonksiyon jeneratörü kullanarak çip üzerinde referans elektrot 400 kHz sinüs dalgası uygulayın.
- voltaj sinyalleri her akım sinyalleri dönüştürmek için iki bağımsız trans empedanslı amplifikatörlere pozitif ve negatif algılama Elektrotlar.
- iki kutuplu bir sinyal elde etmek için bir diferansiyel gerilim yükseltici kullanarak negatif algılama elektrodu voltaj sinyalinin pozitif algılama elektrodu voltaj sinyali çıkarın.
- doğrulama ve karakterizasyon amaçlı cihazın optik kayıt işlemi için yüksek hızlı kamera kullanın.
- Bir şırınga pompası kullanılarak sabit bir akış oranında (50-1,000 uL / saat) mikroakışkan KODU cihazı ile bir hücre süspansiyonu sürün.
- Bir kilit-amplifikatör kullanarak empedans modülasyon sinyali ölçün.
- ref referans AC sinyalini bağlayınkilit-amplifikatör ferans girişi. giriş sinyali olarak kilit-amplifikatör diferansiyel bipolar sinyalini bağlayın.
- kilit-amplifikatör çıkışı diferansiyel sinyalin RMS genlik edinin.
- Daha fazla analiz için veri toplama kurulu aracılığıyla bir bilgisayara 1 MHz hızında kilit-amplifikatör çıkış sinyalini Örnek.
Sensör Sinyallerin 7. İşleme
- post-processing ve kod çözme için MATLAB içine kaydedilen elektriksel verileri aktarın.
- yüksek frekanslı gürültü (> 2.5 kHz) kaldırmak için bir Butterworth filtre (MATLAB yerleşik işlev) kullanarak dijital alanda kaydedilen sinyali Filtre.
- Sensör sinyallerinden bir şablon kod kütüphanesi oluşturun.
- cihazın her sensöre gelen temsilci örtüşmeyen kod sinyallerini tespit ve ayrı dalga vektörleri olarak veri kümesinden bu sinyal blokları ayıklayın.
- Her şablon kodu dalga vektör Normalekendi gücüyle. Sinyal gücünü ölçmek için MATLAB yerleşik fonksiyonu (bandpower) kullanın.
- dijital elektrotlar üzerinde hücre akış hızı değişiklikleri karşılamak için değişik sürelerle normalize kod sinyallerinin sürümlerini oluşturarak şablon kütüphanesi genişletmek için MATLAB fonksiyonunu (resample) kullanın.
- filtrelenmiş dalga şeklindeki: (SNR> 12 dB eşiği) aktivitesini sensör karşılık sinyal blokları belirleyin. eşiğin altında SNR ile dalga formu gürültü olarak kabul edilecektir.
- Ardışık girişim iptal dayalı iteratif bir algoritma, yaygın çoklu kullanıcı CDMA iletişim ağları 24, 25 kullanılan bir tekniği kullanılarak kaydedilen sinyal sensör aktivitesi bireysel blok çözer.
- Nokta ürün kayar kullanarak kütüphane şablonlardan tüm her bir sinyal bloğunun çapraz korelasyon hesaplayın.
- larg üreten şablonu tanımlamakest oto-korelasyon zirve baskın bireysel sensör kod sinyalini belirlemek için. otokorelasyon tepe zaman ve genlik hem kaydedin.
- Ölçülen otokorelasyon tepe genlik dayalı tanımlanan kod şablonu ölçekleme ve (adım 7.5.2 belirlenen) bilgi zamanlama ile bir tahmin sensör kod sinyalini Construct.
- Orijinal verilerden tahmin sensör kod sinyalini çıkartın.
- artık sinyal matematiksel az 0.5 olan korelasyon katsayısı olarak tanımlanan şablon kütüphanede herhangi bir sinyal, benzemez kadar 7.5.1 den süreci yineleme.
- bir optimizasyon işlemi kullanılarak adım 7.5 den ilk sensör sinyal tahminleri daraltın.
- Her yineleme tahmin bireysel sensör sinyalleri ekleyerek sinyali yeniden yapılandırma.
- Kaydedilen elektrik sinyali ile en uygun üretmek için orijinal tahminler etrafında bireysel sensör sinyallerinin genlik, süre ve zamanlama Sweepdayalı en küçük kareler 26 Yaklaşım.
- Optik görüntü karşı elektrik sinyalleri kalibre hücre boyutu tahmin sensör sinyallerinin genlikleri dönüştürün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dört mikroakışkan kanal üzerinden dağıtılmış dört sensör oluşan mikroakışkan KODU cihazı Şekil 1b 'de gösterilmiştir. (1) birden çok hücre paralel ve (2) hücre elektrotları yakın kalır hassasiyetini arttırarak elektrotlar üzerinden geçemez, böylece bu sistemde, her bir mikroakışkan kanal enine kesiti, bir hücre boyutuna yakın olacak şekilde tasarlanmıştır . Her sensör benzersiz 7-bit dijital kodu üretmek için tasarlanmıştır. Bundan sonra, cihaz, bir hücre süspansiyonu kullanılarak test edilmiştir. Dört ayrı sensörlere gelen kaydedilen elektrik sinyalleri Şekil 4'te ilgili ideal bir dijital kodları ile gösterilir. küçük sapmalar var yok ederken kaydedilen sinyaller yakından ideal kare darbeleri ile maç. Bu tür sapmalar farklı bir diğer elektrot çifti, küresel şekli arasındaki bağlantı, aynı düzlemde elektrotlar arasında tek biçimli olmayan elektrik alanı dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklanırHücreler, hem de mikroakışkan kanal hücrelerin sabit bir akış hızı. Biz recoded Sensör sinyallerine dayalı bir şablon kütüphanesi oluşturdu. Kütüphanede şablon her kaydedilen sinyalleri ilişkilendirmeye ederek, en otomatik korelasyon pik noktası üretilen bir şablonu (Şekil 4) tespit edilmiştir. mikroakışkan kanal için dijital kodları birbirine dik olacak şekilde tasarlanmıştır gibi, baskın bir otomatik bağıntı zirve sağlam bu işlemde tanımlanabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, hesaplama hücre geçirildi mikroakışkan kanal, sensör sinyalinin süresi ve hücrenin, bu nedenle akış hızını belirlemek de mümkündür.
Birden fazla hücre aynı anda kodlama elektrotlar ile etkileşim mikroakışkan KODLARI teknoloji durumları çözebilirsiniz. Bu tür çakışmalar meydana geldiğinde, bireysel sensörlerden gelen sinyalleri müdahale ve sonuçtaki dalga kolayca herhangi ilişkili olamazBelirli bir sensör tekabül eden tek bir şablonu. Doğru gibi üst üste binen sinyallerin şifresini çözmek parazitler meydana olasılığı daha yüksek olan, güvenilir işlemler, yüksek yoğunluklu numune için özellikle önemlidir. Olayları üst üste çözmek için, biz genellikle CDMA iletişim ağlarında çoklu kullanıcı tespiti için kullanılan bir ardışık girişim iptal (SIC) şema 24, 25, dayalı iteratif bir algoritma geliştirdi. Şekil 5 SIC algoritması dört farklı mikroakışkan kanallarda dört örtüşen hücrelerden kaynaklanan bir dalga formu çözümünde nasıl uygulanır gösterir. Her bir yinelemede olarak, ilk şablon kütüphanesi ile giriş dalga biçimini (Şekil 5a, 1. sütun) ilişkilendirerek, güçlü parazit sinyaline karşılık gelen, (Şekil 5a, 2. sütun) baskın otomatik korelasyon pik noktası tespit edilmiştir. Seçilen şablon t dayalıo biz o zaman güçlü müdahale sinyali (Şekil 5a, 3. sütun) tahmin ve giriş dalga onu çıkarılır, oto-korelasyon genlik ve sonuç. Kalan dalga girdi olarak sonraki yineleme geçildi. Bu süreç net bir oto-korelasyon tepe (Şekil 5a, 5 inci satır, 2. arsa) vermedi şablon kütüphanesi ile artık sinyal korelasyon kadar devam etti. Girişim iptal işleminin sona ermesini takiben, her yineleme (Şekil 6a) tüm tahmini sinyalleri birleştirerek dalga tahmini yeniden. Orijinal dalga ve yeniden sinyal arasındaki ortalama kare hata en aza indirmek için en küçük kareler yaklaşım dayanan bir optimizasyon süreci kullanarak, biz (Şekil 6b) genlik, süre tahminlerimizi güncellenen ve bireysel sensör kod sinyallerinin göreli zamanlama. Biz de boyutunu tahminHücreler tahmini bireysel sensör sinyallerinin genliği dayanılarak tespit. Bu amaca ulaşmak için, doğrusal regresyon (Şekil 6b) kullanılarak optik olarak ölçülen, hücre boyutları elektrik sinyal amplitüdleri kalibre. Eş zamanlı olarak kaydedilen yüksek hızlı mikroskop görüntüleri elde edilen bilgiler ile mikroakışkan KODLARI bizim sonuçların karşılaştırılması hücre boyutu ve hız doğru bizim sonuçlar (Tablo 1) doğrular, hangi ölçülebilir olduğunu göstermektedir. Şekil 6c çözme sonucunu doğrulamak için kullanılan eş zamanlı olarak kaydedilen yüksek hızlı mikroskopi görüntü gösterir.
Bizim sonuçların tekrarlanabilirliği ve aynı zamanda yüksek verimli bir numune işleme mikroakışkan KODLARI teknolojinin performansını göstermek için,> 1000 hücrelere karşılık gelen elektrik sinyallerini analiz. sinyalleri otomatik olarak açıkladı algoritması çalıştırarak MATLAB deşifre edildiyukarıda ve sonuçların doğruluğu doğrudan eş zamanlı olarak kaydedilen yüksek hızda video optik veri ile sonuçlar karşılaştırılarak değerlendirildi. Bizim analiz hücrelerinin 96,15% (973/1012) elektrik sinyalleri doğru olarak deşifre belirtir. örtüşmeyen ve üst üste hücre sinyallerin dekode edilmesi için başarı oranı 98.71% (688/697), sırasıyla 90.48 (% 285/315) 'dir.
Dört kanallı mikroakışkan KODLARI cihazın 1. Tasarım Şekil. (A) Her mikroakışkan kanal Elektrotlar benzersiz bir dijital kod oluşturmak için micropatterned edilir. nedeniyle elektrot çiftleri ile hücrelerin akan sıralı etkileşimlere empedans modülasyon elektrik sinyalleri yol açar. (B) mikroakışkan KODU cihazının bir mikroskop görüntüsü. imalat işlemi sırasında, kodlayıcı alanlı elektrodlara sahip bir cam alt-tabaka aynı hizaya mikroskop altında PDMS mikroakışkan kanalları ile. 7-bitlik Altın dizileri üreten kodlu yüzey elektrotlar (c) yakın çekim görüntüsü: "1010110", "0111111", "0100010", "0011000". Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Mikro ve süreci. (A) PDMS mikroakışkan kanallar yumuşak litografi 27 kullanılarak imal edilir. (B) yüzey elektrotları bir asansör-off süreci kullanılarak imal edilir. (C) son cihazın bir enine kesit şematik bir. PDMS mikroakışkan kanal hizalanır ve yüzey elektrotlar cam substrata bağlanmaktadır. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. Deneysel kurulumu Şekil. Bir şırınga pompası kullanılarak, hücre süspansiyonu, sabit bir akış hızında mikroakışkan KODU cihaz üzerinden çalıştırılır. 400 kHz AC sinyali bir fonksiyon jeneratörü ile bir referans elektrot uygulanır. Pozitif ve negatif algılama elektrotlardan akımı sinyaller ilk iki transempedans amplifikatörler ile voltaj sinyaline dönüşen bir diferansiyel yükselteci ile birbirine çıkartılır. diferansiyel bipolar sinyal kilit-amplifikatör tarafından çıkarılan ve daha sonra sinyal işleme ve kod çözme için bir bilgisayara örneklenir. Yüksek hızlı optik mikroskopi doğrulama ve karakterizasyon amacıyla cihazın optik kayıt işlemi için kullanılır.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bireysel sensörler ve bunların korelasyonları 4. Kaydedilmiş elektrik sinyalleri Şekil. Kaydedilen sinyaller ve birbirleri ile ilişki dört kod çoklamasız rezistif darbe sensörleri için verilmiştir. Sensör 1 (a) sensör 2 (b) sensör 3 (c) ve sensörü 4 (d) 7-bitlik dijital dalga üretecek şekilde dizayn edilmiştir "1.010.110", "0.111.111", "0.100.010" ve "0.011.000" sırasıyla . Her bir sensör için, üst rakam her sensörden gelen kaydedilen normalize sinyal algılayıcı üretmek için dizayn edilmiştir ideal bir kare darbe dizisi ile yakından eşleştiğini gösterir. Her bir sensör için, alt panel kaydedilmiş sensör sinyalini gösterir9; s otokorelasyon ve ağdaki diğer üç kod çoklamasız sensörlere gelen sinyallerle çapraz korelasyon. ayrı sensörlerin dijital kodları birbirine dik olacak şekilde tasarlanmıştır, çünkü her durumda, bir otokorelasyon pik sağlam tespit edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Birbirini takip eden girişim iptali ile üst üste binen bir dalga biçimini deşifre Şekil 5.. Her tekrarında, giriş dalga (1. sütun) maksimum korelasyon genlik (2. sütun) ile sonuçlanan belirli bir şablon tanımlamak için önceden monte edilmiş şablon kütüphanesi ile ilişkilidir. Bu belirli bir şablon kullanarak, en güçlü müdahale sinyal büyüklüğüne dayalı tahmin edilmektedirve korelasyon zirve (3. sütun) bilgi zamanlama. Tahmini sinyal daha sonra nedeniyle büyük hücreye etkili bir şekilde en güçlü girişim iptal, orijinal dalga çıkarılır. Korelasyon zirve tespit edilebilir kadar işlem tekrarlanır (yani, korelasyon katsayısı <0.5) artık sinyal olarak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. Çözme sonuç analizi. (A) Tahmini sinyaller rafine yeniden ve en küçük kareler yaklaşımı kullanarak orijinal kaydedilen dalga arasındaki en uygun elde etmek için amaçlayan bir optimizasyon algoritmasına dayanır. Optimizasyon işlemi sonunda, (b),zamanlaması ve kalibre sinyallerin genliği doğru yüksek hızda mikroskobu ile ölçülen hücre parametreleri yansıtmaktadır. (C) Aynı zamanda kaydedilen yüksek hızlı mikroskopi görüntü elektrik ölçümlerden sonuçlarımızı doğrular. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Ölçüm tipi | r ch1 (um) | R -CH2 (um) | R, CH3 (um) | r CH4 (um) | ¨t 1 (ms) | ¨t 2 (MS) | ¨t 3 (MS) |
| Elektrik | 8.010 | 6,490 | 5.300 | 6.550 | 0.465 | 1,705 | 0,744 |
| Optik | 8,320 | 6,770 | 5,680 | 7,040 | 0.375 | 1.625 | 0.750 |
Şekil 6b elektrik ve optik açıdan ölçülen hücre parametrelerinin Tablo 1. karşılaştırması. Bizim tahminler doğrulamak için, biz optik yüksek hızlı mikroskopi görüntü hücre boyutları ölçülür. farklı hücreler arasındaki göreli zamanlama optik saniyede 8.000 kare kaydedilen yüksek hızda video hücreleri arasındaki kare sayısı ölçülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çoklu dirençli darbe sensörleri daha önce mikroakışkan cips 28, 29, 30, 31, 32 içine dahil edilmiştir. Bu sistemlerde, dirençli darbe sensörler, 28, 29, 30, 31 çoklanır değildi ya da tek tek sensörler farklı frekanslarda 32 yönlendirilmesi için gerekli. Her iki durumda da, özel bir dış bağlantılar çip üzerindeki her bir dirençli nabız sensörü için gerekli olan ve bu nedenle de bir sensör, çok sayıda daha büyük bir donanım karmaşıklığı olmadan entegre olabilir. Mikroakışkan KOD önemli avantajı, basit bir cihaz tek bir çıkış birden fazla direnç darbe sensörler aynı anda okuma izin vermesidir. Biz m kullanarak bunu başarmakyaygın telekomünikasyon kullanılan ultiplexing teknikleri mikroakışkan cihazlar entegre Mikroişlenmiş rezistif darbe sensörleri tasarımı. Özünde, teknoloji parçacık tespit edildiğinde bir ayırt sinyal üretmek için her tasarlayarak kod çoklama üzerinde on-chip Coulter sayaçları bir ağ dayanır. ağdaki her Mikroişlenmiş sensör bu elektrotlar sayesinde partiküllerin akan sıralı etkileşimi dik empedans modülasyon dalga biçimleri üretir böyle yapılandırmaları farklı sipariş birden eşdüzlemli yüzey elektrot oluşur. Asenkron parçacık sensörü etkileşimi yerleştirmek için, özellikle altın kodları 33, tipik olarak CDMA telekomünikasyon ağlarının uplink kullanılan sözde dik dijital kodları üretmek için her sensör tasarlanmış. Rastgele faz farklarının 34 ile hizadan zaman Altın kodları bile belli bir seviyenin dikliğini muhafaza.
Microfluidic KODLARI kolayca ölçeklenebilir. Bu yazıda dört sensörlü bir prototip mikroakışkan KODLARI cihazdan sonuçlarını sundu olmasına rağmen geri kalanından ayırt çıkış sinyalleri üretmek için tasarlanmış zaman, daha fazla sensör cihazda dahil edilebilir. Sensör ağını genişletmek için bir yolu daha uzun dijital kodları ile büyük ortogonal kod setleri dayalı sensörleri tasarlamaktır. Daha uzun daha fazla bit ortogonal kodlar kod çözme yüksek işlem kazancı sağlamak ve parazit olduğunda birbirinden ayırt edilebilir. Öte yandan, cihazın daha uzun Altın kodlar da müdahale sensörlerin beklenen sayısını artırır büyük algılama hacmi anlamına gelir. Benzer şekilde, belirli bir numune yoğunluğu için sensör sayısının artırılması genel algılama hacminde bir artış nedeniyle üst üste fazla parçacıklara neden olur. Bu şekilde, numunenin parçacık yoğunluğu mikroakışkan KODU teknolojisi kullanılarak dikkate alınması gereken bir kritik bir parametredir. maksimum p(CDMA telekomünikasyon ağının kanal kapasitesi ile benzer şekilde) çözülebilir makale yoğunluğu, bireysel sensör sinyalleri ve onların ilişkisi, kod çözme şeması, mikroakışkan cihazın düzeni ve elektronik gürültü seviyesi gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Uygulamaya bağlı olarak, örnek olarak uygun bir hata oranı üreten bir partikül yoğunluğa ulaşmak için seyreltilebilir.
Sinyal işleme açısından, mikroakışkan KODU cihazdan zamanlı dalga kod çözümünün bir CDMA ağı üzerinde cep telefonu haberleşme gerçek zamanlı olarak çoklaması edilebilir gerçeği ile kanıtlandığı üzere, mevcut sistemler kullanılarak yoğun bir hesaplama değildir. Ayrıca, fiziksel olaylar mikroakışkan cihazlarda deşifre edilmesi bizi daha gelişmiş ve zaman alıcı biz yinelemeli si üst üste çözmek için kullanmak gibi SIC olarak algoritmalar ve bir optimizasyon süreçleri, kullanmak için izin cep telefonu iletişiminde bit iletim hızı daha yavaş olursensörlerden gnals.
Birlikte ele alındığında, mikroakışkan KODLARI kolayca onlar çip üzerinde işlenen olarak parçacıkların takip ederek kantitatif analizleri gerçekleştirmek için çeşitli mikroakışkan cihazlar entegre edilebilir çok yönlü, ölçeklenebilir elektronik algılama teknolojisidir. teknoloji, (1) (2) bunun herhangi bir aktif on-chip bileşeni olmadan doğrudan elektronik okuma-out sağlar (3) yumuşak litografi ile doğrudan uyumlu bir donanım açısından çok basit, çünkü uygulamak çok kolay ve (4) sinyal işleme ve veri yorumlama için basit hesaplama algoritmaları kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
