Introduction
A replicação de ADN é uma característica conservada de toda a vida celular. Enquanto a identidade e número de componentes de replicação variam amplamente, os mecanismos gerais são compartilhadas entre a evolução 1. Aqui, descrevemos, experimentos cinéticos descontínuos à base de gel, utilizando substratos radioativos, visando a compreensão da cinética de síntese de DNA atraso vertente in vitro por componentes do replisome T7. A maquinaria de replicação do bacteriófago T7 é muito simples, consistindo em apenas quatro proteínas (a polimerase de ADN, GP5, e o seu factor de processabilidade, tioredoxina de E. coli, os GP4 primase-helicase bifuncionais, e a proteína de ligação ao ADN de cadeia simples, GP2. 5) 2. Esta característica torna-se um sistema de modelo atractivo para estudar os mecanismos bioquímicos conservadas envolvidas na replicação do ADN.
Especial ênfase é colocada sobre a formação de primers ribonucle�ido por DNA T7 primase, uma critical passo na iniciação de síntese de ADN. Além disso, pode-se também analisar a utilização desses iniciadores por ADN-polimerase de T7 ou outras proteínas de replicação através da sua inclusão na mistura de reacção. A primase de T7-helicase, GP4, catalisa a formação de iniciadores para a síntese de DNA em sequências de ADN específicos chamados locais de reconhecimento, ou primase PRS, (5'-TCG-3 '). A citosina no PRS é enigmática, é essencial para o reconhecimento do local, mas não é copiado para o produto 3. O primeiro passo na síntese do iniciador por GP4 envolve a formação do dinucleótido pppAC, que é então estendida a um trímero, e, eventualmente, a iniciadores tetranucleotídeo funcionais pppACCC, pppACCA, ou pppACAC dependendo da sequência no molde 4. Estes iniciadores podem então ser utilizados por ADN-polimerase de T7 para iniciar a síntese de ADN, que é também um processo assistido por GP4 5, 6. A este respeito, o primasedomínio estabiliza os tetraribonucleotides extremamente curtos com o modelo, impedindo a sua dissociação, envolve polimerase ADN de uma forma conducente a garantir o primer / modelo no sítio ativo 7 polimerase. Estes passos (a síntese de ARN do iniciador, a polimerase de handoff iniciador, e extensão) são repetidos em ciclos múltiplos de replicar a costa de retardamento e tem de ser coordenado com a replicação da costa principal.
Os ensaios descritos aqui são altamente sensíveis e podem ser executadas num período de tempo moderado. No entanto, eles são relativamente de baixo rendimento e um grande cuidado deve ser exercido no uso e descarte de materiais radioativos. Dependendo da velocidade à qual a reacção prossegue, pode-se empregar um instrumento de têmpera rápida para atingir as amostras em escalas de tempo favorável para análise significativa de cursos de tempo da reacção, quer em contínuo ou no estado pré-estável. Recentemente, usamos ensaios descritos aqui para fornecer evidence a importância da introdução do iniciador a partir do domínio de primase de GP4 na iniciação de fragmentos de Okazaki. Além disso, encontramos evidências de um papel regulador para a proteína, gp2.5 ligação do T7 DNA de cadeia simples, na promoção da formação de primer eficiente e utilização 8.
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Protocol
NOTA: Siga todas as normas institucionais relativas à utilização segura e eliminação de material radioactivo, incluindo, mas não limitado a, o uso de equipamento de protecção individual, como luvas, óculos de segurança, jaleco, e escudos de acrílico adequados.
NOTA: O tampão padrão consiste em 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, glutamato de potássio 50 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (tampão esta é pré-fabricados, a uma concentração 5x) e 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicação de T7 são purificados como descrito 8, 9, 10. ADN de cadeia simples contendo um único sítio de reconhecimento da primase de T7 (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') podem ser adquiridos a partir de uma variedade de companhias de síntese de ADN (o comprimento o ADNcs pode depender da enzima de escolha, para a primase de T7, um pentâmero é o comprimento mínimo do molde para sintetizar um iniciador de comprimento completo 11, como o críptico C é essencial, no entanto, se o iniciador está a ser estendido pela polimerase de, nucleótidos adicionais deve estar presente na extremidade 3 'do molde. As reacções são iniciadas pela adição de uma concentração final de 10 mM de MgCl 2 e incubou-se a 25 ° C. a amostragem manual funciona bem para pontos de tempo de 5 segundos ou mais. Se pontos de tempo mais curto do que são necessárias, é recomendado o uso de um instrumento de fluxo rápido de retardamento para obter dados precisos.
1. Multiple-turnover Primer Síntese Reaction por amostragem manual
- Antes de iniciar a experiência, alíquota de 2 mL de tampão de corante de formamida (formamida a 93% (v / v) de formamida, 50 mM de EDTA, 0,01% de cianol de xileno e 0,01% de azul de bromofenol) em 8 tubos de polipropileno de 1,5 mL. Em geral, o número de tubos é igual ao número de pontos de tempo analisados.
- Prepara-se uma mistura de 20 uL de tampão 1x que consiste, ATP 0,1 mM e CTP, 0,25 mCi / ml de [32 P α-] CTP, 0,1 uM SSDMolde de NA, e 0,1 uM GP4 (expresso como concentração hexâmero - 0,6 uM monómero).
- Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 5 min.
- Retirar 2 ul da mistura utilizando um pipetador e misturar com 2 ul de tampão de formamida de corante num tubo de 1,5 ml, preparado no passo 1.1 para o controlo sem reacção (tempo zero).
- Adicionar 2 mL de 0,1 M MgCl2 a mistura reaccional (para uma concentração final de 10 mM).
- retirar manualmente amostras de 2 mL da misturas reaccionais utilizando um pipetador em intervalos de 10s e misturar-se com corante de formamida predispensed em tubos de 1,5 ml, preparado no passo 1.1.
- amostras de calor a 95 ° C durante 5 min num bloco de calor.
- Carregar alíquotas das amostras num gel desnaturante. Os pequenos produtos de iniciadores tetraribonucleotide sintetizados pelo primase de T7 estão bem resolvidas num 0,4 mm de espessura de 25% de acrilamida: bisacrilamida (19: 1), ureia 3 M, 1 x TBE (Tris-borato de 100, 1 mM de EDTA).
- Coloque toda gel em chromatograpapel phy e cubra com filme plástico. gel seco utilizando um secador de gel.
- Prepara-se uma série de diluições do restante da mistura de reacção e detectar o mesmo volume carregados sobre o gel para papel de cromatografia, ou seja, Spot 4 uL da diluição se 4 ul de amostra foram carregados.
NOTA: Este servirá como a curva padrão para determinar a concentração de produtos secundários formados durante a reacção. Por exemplo, diluições de cinco vezes, utilizando tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) funcionam bem, abrangendo uma gama de 1:25 a 1: 15625 (5 2 -5 6), mas as diluições devem ser ajustado, dependendo do nível de actividade. - Expor gel seco e padrão usando uma tela phosphorimager. Quantificar a radioactividade na série de diluição e construir uma curva padrão, tal como descrito 8, 12
NOTA: Inclusão de polimerase de ADN de T7 à mistura reaccional permite EXAmina o uso de iniciadores tetraribonucleotide por esta enzima. Optimamente, a concentração da polimerase deve ser saturando para simplificar a interpretação dos dados. A concentração da polimerase de 0,4 uM ou mais elevadas dá bons resultados. Além disso, o efeito de outras proteínas, tais como proteínas de ligação de cadeia simples de ADN, de cada iniciador de síntese ou em atraso de cadeia de iniciação pode ser examinado desta maneira.
2. Multiple-turnover Reaction Primer Síntese Usando um Instrumento Rapid-têmpera
- Preparação de misturas reaccionais
- Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 0,2 uM GP4 hexâmero, 0,2 uM molde de ADNcs, dNTP 0,6 mM, 0,2 mM de ATP e CTP (incluindo 0,5 mCi / ml de [32 P α-] CTP.
- Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e MgCl2 20 mM.
- A operação do instrumento de fluxo rápido-têmpera
- Ligue rapinstrumento de fluxo id-têmpera; depois de aparecer o menu principal, digite 7 no teclado do instrumento para mover o motorista seringa para a posição inicial.
- posição seringa aberta tampão para "LOAD".
- Seringas Carregando tampão
- Anexar um tampão contendo 10 mL seringa à porta seringa unidade. Alterar posição do botão de seringa para "LOAD".
- Usando 10 mL seringas, encher tampão instrumento reservatório A e B com 10 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM e encher a seringa C com solução de paragem (EDTA 250 mM, e SDS a 0,2%). Remover bolhas de ar empurrando êmbolos dentro e para fora.
- posições Alterar botão para "FOGO". Digite 2 para ajustar a posição da barra de motorista seringa. Pressione o botão "AJUSTE PARA BAIXO" botão para baixar a seringa até tampão sai do loop de saída: (7-desce continuamente; 8 grande passo para baixo; 9-pequeno passo para baixo). Tipo "ESC" para voltar ao menu principal.
- tubos de lavagem
- Attach linha de saída para vácuo. Alterar botões de amostra para "FLUSH". Fechar tampão de seringa definindo as pegas para a posição horizontal. Ligue vácuo e mergulhar as alças 2 de descarga em H2O durante 10 s, em seguida, mergulhar em MeOH durante 10 s. lacetes secas por sugar o ar para ~ 15 s, ou até secar.
- de colocar as amostras
- Mudança amostra posição do botão de "Load". Coloque a solução A à seringa de 1 mL. Ligue seringa em uma das portas de carga da amostra. Repita o procedimento para a solução B, e coloque no porto de carga amostra oposto.
- Recolha de pontos temporais
- No menu principal, digite 1 para execução de têmpera-flow. Digite o tempo de reação (s) e pressione "ENTER". O número de loop reação a utilizar será exibida. Mudar para loop de reacção necessário. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4.
- Vire botões de amostra para "carregar". reação carga mistura em loops até pouco fora do compartimento de mistura central. Coloque todos os botões para "FIRE ". Confirmar que todos os botões estão na posição correcta.
- Coloque 1,5 mL tubo na extremidade do circuito de saída. Pressione o botão "GO" para executar a reação. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4. Recarregar seringas tampão A e B, até que atingiu o motorista.
- Repetir passos 2.2.6.2-2.2.6.3 para cada ponto de tempo desejado. Exceção: Não coloque solução contendo o reagente de partida (ou seja, MgCl 2, neste caso) quando apagar o controle de tempo de ponto-zero.
- Quando terminar a recolha de amostras, digite "ESC" para voltar ao menu principal. Pressione o botão "7" para voltar motorista tampão seringa para sua posição inicial.
- Instrumento de limpeza
- Remover seringas mistura de reacção. Vire amostra de carga botão para "LOAD" posição. Sob vácuo, lavar cada circuito de amostra com 10 mL de NaOH 0,2 N, seguido de 10 ml de 0,3 NH 3 PO 4 e 10 mL de MeOH.
- Vire botões de seringa para a posição "LOAD". Pressione os 3 syringe êmbolos para recuperar de reacção e extingue-se tampões. Lavar seringas com 5 mL de H 2 O, pelo menos, duas vezes.
- Preencha seringas novamente com 5 mL de H2O e vire botões para "fogo" posição. Mudar posições dos botões e ligue vácuo para remover H 2 O. Lavar como no passo 2.2.4. Desligue instrumento.
Nota: Os produtos são analisados conforme descrito nas etapas 1.7-1.12. Além disso, a polimerase de ADN de T7 e outras proteínas de replicação pode ser adicionado na mistura de reacção para analisar o seu efeito sobre a síntese de iniciador ou de extensão.
3.-turnover Individual Primer Síntese Reaction
NOTA: Os ensaios de iniciador de síntese / extensão-turnover único são levadas a cabo de modo semelhante às reacções de múltiplas volume de negócios, com algumas diferenças importantes: estes ensaios segue a conversão de ATP marcado radioactivamente no iniciador ou de extensão de produtos, no entanto, a concentração de substratos e proteínas são considerăBly superior. Além disso, a fim de atingir a resolução de milisegundos para permitir a análise da reacção de síntese de iniciadores, deve-se utilizar uma máquina de fluxo rápido-têmpera.
- Preparação das misturas de reacção.
- Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 3 uM hexâmero GP4, 6 uM molde de ADNcs, dNTPs 0,6 mM, CTP a 1 mM, e 2 nM de [γ- 32 P] ATP. Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e MgCl2 20 mM.
- Operação de fluxo Rapid-têmpera
- Realizar reacções tal como descrito na etapa 2.2. Se desejado, adicionar ADN-polimerase T7 ou a proteína de ligação-ADN de cadeia simples de T7 a uma concentração de 15 uM e 20 uM, respectivamente. Neste caso, os produtos de extensão acumulam num regime de tempo que permite a amostragem manual da reacção.
Análise 4. Dados
- curvas de progresso do produto Fit para menos- não-linearquadrados modelos usando software disponível comercialmente capazes de mínimos quadrados ajustes e / ou integração numérica. Os detalhes da operação irá variar de acordo com o software utilizado, mas abaixo são formas generalizadas de equações utilizadas para ajustamento dos dados.
- Determinar a velocidade de formação de produto de múltiplas reacções de síntese de rotatividade iniciador ajustando a curva de progresso de uma equação linear. Se houver curvatura significativa, utilizar o método da taxa inicial 13, 14, através do ajuste dos dados a uma função exponencial simples: y = A (e - k t), onde y é a concentração de produto, A é a amplitude de reacção, k é a constante de velocidade observada, t é o tempo, em segundos. A inclinação da linha tangente em tempo = 0 é a velocidade inicial.
NOTA: reações de síntese de primer estado Fit pré-constante para uma equação linear ou para a equação de estado pré-estacionário estouro y = A (e - bu krst t) + taxa ss t, em que A é a amplitude da reacção, k ruptura é a constante de velocidade observada para a explosão estado pré-estável, SS taxa é o estado estacionário ss Velocidade = k cat [Enzima]), t é o tempo , em segundos. Fit reações de síntese primer volume de negócios única curva de progresso para uma única função exponencial y = A (e - k t). No caso de GP4, ajustar os dados por integração numérica 15, para um modelo com três passos de condensação de NTP, em que cada intermédia está em equilíbrio com a enzima, utilizando software disponível comercialmente.
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Representative Results
Os resultados mostrados na Figura 1A foram obtidos como descrito no passo 1 do protocolo, isto é, por amostragem manualmente uma reacção de síntese de primer catalisada por GP4 sob condições de turnover múltiplo. Aqui, uma gama de produtos, após electroforese em gel pode ser observado usando CTP marcado com 32 P na posição-α em reacções de síntese do iniciador (Figura 1A). O precursor marcado, CTP, mostra a maior mobilidade e migra em direcção ao fundo do gel, seguido por espécies que migram mais lentas correspondentes ao di-, tri-, e tetraribonucleotides sintetizados por GP4. Dependendo da duração de incubação, e o modelo de contexto de sequência, os produtos adicionais rotulados correspondentes aos oligómeros superiores (pentaribonucleotides, etc.) podem ser observadas. Uma curva de progresso da reacção é representada pelo primeiro a determinação da concentração de iniciadores de comprimento completo (isto é, tetrae pentaribonucleotides) em cada ponto temporal e traçando a concentração de iniciadores sintetizado como uma função do tempo.
Enquanto a obtenção de dados de estado estacionário, as experiências de vários volume de negócios é relativamente fácil, o conteúdo de informação dos dados é um pouco limitada, pois os dados são muito definida por substrato de ligação e eventos de lançamento de produtos, ie., Esses eventos geralmente dominam ou grandemente determinar K M e gato k valores de 16. Se a reacção é observado em pontos de tempo curto o suficiente, antes de o estado estacionário é estabelecida (por outras palavras, o estado pré-constante) muito maior conteúdo de informação pode ser derivada a partir de experiências cinéticas. O exame das reacções no estado pré-estável pode fornecer um tesouro de informações. Por exemplo, se for observado um "pré-estável estado explosão" de formação do produto, é boa indicação de que a libertação do produto é um passo limitante da taxa de iN, a reacção. Além disso, pode-se extrair a taxa de formação de produto (ou o passo química) a partir da fase de pré-estado estacionário da reacção. Em contraste, se uma explosão de formação de produto não se observa, em seguida, é prova de que a taxa em regime estável é limitado, quer pelo passo químico, ou um passo precedente e que a libertação do produto é rápida em comparação.
Quando um instrumento rápida de têmpera é utilizado para examinar a reacção catalisada por GP4 em escalas de tempo na gama de segundo até alguns milissegundos (passo 2 do protocolo), é evidente que a acumulação de iniciador não é linear, mas exibe uma bifásica perfil (Figura 1B, linha sólida). Este é um resultado de diagnóstico demonstrar evidência para uma explosão estado pré-constante de acumulação de produto, o que sugere que a formação do produto é rápida e de libertação que se encontra no estado estacionário limitante da velocidade. Outros sistemas enzimáticos podem não mostrar estacomportamento. Por exemplo, uma curva de progresso hipotética é apresentado o que resultaria se a formação de iniciador por GP4 não proceder com uma explosão estado de pré-equilíbrio (Figura 1B, linha pontilhada). Em casos como estes, a interpretação seria a de que a formação de produto, ou um passo precedente, é o passo limitante da velocidade.
Outra forma de realização da cinética do estado de pré-equilíbrio é o experimento de rotação única, em que uma baixa concentração de substrato marcado está ligado por quantidades saturantes de enzima (bem como ADN e CTP, no caso de GP4). Este tipo de experiência é especialmente adequado para proporcionar informações sobre a formação e decomposição de espécies intermédias durante a conversão do substrato em produto. Na reação catalisada por GP4 (passo 3 do protocolo), formação de primer é o resultado de três reações de transferência de nucleótidos. Recentemente, nós usamos reações de síntese primer volume de negócios única para revelar informaçõescerca de iniciadores intermediários 8 (Figura 1C) por encaixe a acumulação dependente do tempo e desaparecimento dos di-, tri-, e produtos tetraribonucleotide para um modelo sequencial de três passos de transferência de nucleótidos, em que os intermediários de ribonucleótidos estão em equilíbrio com GP4.
Figura 1: Análise cinética da síntese do iniciador pela T7 primase-helicase. (A) Time-curso de formação de primer por gp4 em um ssDNA com um único PRS. As amostras foram removidas antes da adição de MgCl2 (tempo = 0) e amostrado em intervalos após a sua adição. Os produtos são indicados à esquerda da imagem do gel. (B) Linha sólida: Formação Primer por gp4 exibe uma explosão estado pré-estacionário. Os valores são a média de pelo menos três experiências independentes. pontilhada line: Representação de uma curva de progresso da reação se a reação catalisada por gp4 prosseguiu sem uma explosão estado pré-estacionário. Modificado de 8. (C) síntese primer volume de negócios Único por gp4. Esquerda: tempo de curso de formação de tetrâmero. Direita: terreno de formação intermediária em função do tempo. Os valores são a média de pelo menos três experiências independentes. Os dados foram ajustados por integração numérica; linhas sólidas mostram o ajuste. Modificado de 8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O factor mais importante na realização destas experiências é a disponibilidade da enzima purificada altamente activa. Durante o nosso trabalho com GP4, por exemplo, verificou-se que o armazenamento da enzima purificada em tampão (fosfato de potássio 20 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contendo 50% de glicerol a -20 ° C, leva a uma redução a actividade específica da preparação ao longo de alguns meses. Portanto, agora flash-freeze pequenas alíquotas de GP4 purificada em Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, TCEP 1 mM, e glicerol a 10% usando azoto líquido e armazená-las a -80 ° C. Durante a utilização do instrumento de fluxo rápido de retardamento, especialmente durante a aquisição das primeiras amostras, é importante para permitir que os reagentes para atingir a temperatura de reacção (temperatura ambiente) antes de se iniciar a reacção. Além disso, muito cuidado deve ser tomado para limpar completamente o tubo (passo 2.2.4 do protocolo), após cada ponto de tempo, como qualquer reagente de camuflagem restante noa linha irá inibir significativamente a actividade da enzima, conduzindo a resultados erróneos. Outra consideração envolve a composição do gel de poliacrilamida e o seu manuseamento. Os produtos de reacções de síntese de iniciadores catalisadas por GP4 não resolver bem em geles com menos do que, pelo menos, 20% de acrilamida. Na verdade, em 15% geles, o substrato nucleótido e todos os produtos de reacção migra como uma zona indistinta de radioactividade. Portanto, é altamente aconselhável ajustar a percentagem de acrilamida em conformidade, se os pequenos produtos de ribonucleótidos são para ser analisado. Uma grande desvantagem da utilização de géis contendo uma percentagem elevada de acrilamida é que eles não aderem bem ao papel; portanto, muito cuidado deve ser usado para transferi-los para cromatografia em papel para secar. Finalmente, géis contendo uma elevada percentagem de acrilamida tendem a rachar em secadores de gel movidos a vácuo. Descobrimos que a diminuição da temperatura de secagem para 65 ° C conduz a uma menor craqueamento de géis. Alternativamente, os géis podem ser expostos a-fósforotelas imager sem ressecar.
Há um grande número de variações nas condições de reacção e reagentes que podem ser testados utilizando este protocolo, e que estamos buscando em nossos estudos de gp4, variando de testar o comportamento enzimática de enzimas mutantes, examinando o efeito da adição de pequenas putativa inibidores de moléculas ou activadores, ou substratos alternativos, tais como os análogos de nucleótidos, bem como moldes de ADN alternativos, ou cofactores de iões metálicos. O protocolo descrito acima usa temperatura ambiente como temperatura de reacção. Se uma outra temperatura de reacção é desejada, a maioria dos instrumentos rápida atenuação conter uma válvula que permite conectar o instrumento a um banho de água controlado por calor. Nos casos em que a separação electroforética do produto não é satisfatória, especialmente se o tampão de reacção contém uma elevada concentração (> 200 mm) de sal, é aconselhável para tratar amostras após têmpera com 1-10 unidades de fosfatase alcalina e incubar a 37 ° C durante pelo menos 30 minutos. Isto irá remover os trifosfatos terminais de PTR e produtos de ribonucleótidos e aumentar a sua separação eletroforética. No entanto, isto só é prático se o nucleótido marcado está na posição α.
A utilização de um instrumento de têmpera rápida não é conveniente para a análise de alto rendimento. Um usuário experiente pode executar o protocolo de fluxo rápido-têmpera descrito aqui, a partir de preparação da amostra, recolhendo cerca de 18 pontos de tempo, e limpar o instrumento em cerca de duas horas. Uma restrição adicional de tempo é o tempo necessário para a electroforese em gel, a exposição do gel, e a análise de dados. Outra limitação é que requer uma experiência típica de 500 a 1000 ul de volume de reacção, e a obtenção de enzima suficiente poderia ser um desafio no caso de proteínas que não são expressas de forma eficiente.
Há um grande interesse no desenvolvimento de ensaios que permitem a triagem de alto rendimento da primaatividade se, sobretudo para desenvolver novas terapias anti-bacterianos 17, 18. Apesar dos avanços no desenvolvimento, ensaios contínuos não radioativos para a atividade de primase, estes ensaios sofrem de duas grandes limitações e, assim, impedir o seu uso em investigações cinéticas rápidas, ou seja, a falta de resolução de tempo suficiente e sensibilidade produto. Portanto, o ensaio radioativo, descontínua descrito aqui é atualmente o padrão ouro no exame cinética da atividade primase por gp4, e primases de DNA em geral. Concretizações mais sofisticadas do protocolo aqui descrito pode ser usado na determinação da via de cinética de uma reacção catalisada por enzima utilizando um instrumento de fluxo rápido de retardamento, por exemplo, em experiências de pulse-chase destina-se a determinar a cinética de particionamento de substratos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
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