Introduction
La replicación del ADN es una característica conservada de toda la vida celular. Mientras que la identidad y el número de componentes de replicación varían ampliamente, los mecanismos generales se comparten a través de la evolución 1. A continuación, describimos, experimentos cinéticos discontinuos a base de gel, utilizando sustratos radiactivos, dirigidas a la comprensión de la cinética de la síntesis de ADN de hebra retrasada in vitro por los componentes de la replisome T7. La maquinaria de replicación del bacteriófago T7 es muy simple, que consiste en sólo cuatro proteínas (la ADN polimerasa, GP5, y su factor de procesividad, E. coli tiorredoxina, los gp4 bifuncionales primase-helicasa, y la proteína de unión de ADN de una sola hebra, GP2. 5) 2. Esta característica lo convierte en un sistema modelo atractivo para estudiar los mecanismos bioquímicos conservados implicados en la replicación del ADN.
Se hace especial hincapié en la formación de cebadores de ribonucleótidos por T7 ADN primasa, una critical paso en la iniciación de la síntesis de ADN. Además, también se puede examinar el uso de estos cebadores por ADN polimerasa de T7 o de otras proteínas de replicación mediante su inclusión en la mezcla de reacción. La T7 primasa-helicasa, GP4, cataliza la formación de cebadores para la síntesis de ADN en secuencias específicas de ADN denominadas sitios de reconocimiento primase, o PRS, (5'-GTC-3 '). La citosina en el PRS es críptica, es esencial para el reconocimiento del sitio, pero no se copia en el producto 3. El primer paso en la síntesis de cebador mediante gp4 implica la formación del dinucleótido pppAC, que luego se extiende a un trímero, y eventualmente a cebadores tetranucleotide funcionales pppACCC, pppACCA, o pppACAC dependiendo de la secuencia en la plantilla 4. Estos cebadores pueden usarse entonces por ADN polimerasa de T7 para iniciar la síntesis de ADN, que es también un proceso gp4 asistida 5, 6. En este sentido, la primasadominio estabiliza los tetraribonucleotides extremadamente cortos con la plantilla, lo que impide su disociación, se dedica ADN polimerasa de una manera conducente a asegurar el cebador / plantilla en el sitio activo de la polimerasa 7. Estos pasos (síntesis de ARN del cebador, de traspaso cebador para la polimerasa, y de extensión) se repiten en múltiples ciclos para replicar el filamento de revestimiento y deben coordinarse con la replicación de la hebra que lleva.
Los ensayos descritos aquí son altamente sensibles y pueden realizarse en un marco de tiempo moderado. Sin embargo, son relativamente de bajo rendimiento y gran cuidado debe ejercerse en el uso y desecho de materiales radiactivos. Dependiendo de la velocidad a la que transcurre la reacción, se puede emplear un instrumento de rápido enfriamiento para alcanzar muestras a escalas de tiempo susceptibles de un análisis significativo de los cursos de tiempo de reacción, ya sea en la constante o el estado pre-estacionario. Recientemente, hemos utilizado ensayos descritos aquí para proporcionar evidence de la importancia de la liberación de imprimación desde el dominio de primasa de GP4 en la iniciación de los fragmentos de Okazaki. Además, se encontró evidencia de un papel regulador de la proteína T7, gp2.5 de unión al ADN de una sola cadena, en la promoción de la formación y la utilización eficiente de imprimación 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Siga todas las normativas institucionales con respecto al uso seguro y la eliminación de los materiales radiactivos, incluyendo pero no limitado a, el uso de equipo de protección personal, como guantes, gafas de seguridad, ropa de laboratorio, y escudos de acrílico adecuados.
NOTA: El tampón estándar consta de 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de glutamato de potasio, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (este tampón se pre-hizo a una concentración 5x) y 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicación de T7 se purifican como se describe 8, 9, 10. ADN de una sola hebra que contiene un único sitio de reconocimiento de T7 primasa (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') se pueden adquirir en una variedad de empresas de síntesis de ADN (la longitud de el ssDNA puede depender de la enzima de elección, para primasa T7, un pentámero es la longitud mínima molde para sintetizar un cebador de longitud completa 11, ya que la críptica C es esencial, sin embargo, si el cebador se va a extender por la polimerasa, nucleótidos adicionales deben estar presentes en el extremo 3 'de la plantilla. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de una concentración final de 10 mM MgCl 2 y se incubaron a 25 ° C. El muestreo manual funciona bien para los puntos de tiempo de 5 segundos o más. Si se requieren puntos de tiempo más cortos que eso, se recomienda utilizar un instrumento de flujo rápido de enfriamiento rápido para obtener datos precisos.
1.-rotación múltiple Primer Síntesis de reacción por muestreo manual
- Antes de iniciar el experimento, alícuota de 2 l de tampón de colorante formamida (93% (v / v) de formamida, EDTA 50 mM, 0,01% xileno cianol y 0,01% de azul de bromofenol) en 8 tubos de polipropileno de 1,5 mL. En general, el número de tubos es igual al número de puntos de tiempo analizados.
- Preparar una mezcla que consiste en 20 l de tampón 1x, 0,1 mM de ATP y CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32 P] CTP, 0,1 M SSDplantilla NA, y 0,1 M gp4 (expresado como concentración hexámero - 0,6 M de monómero).
- Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min.
- Retire 2 l de la mezcla usando una pipeta y se mezcla con 2 l de tampón de colorante formamida en un tubo de 1,5 ml preparada en la etapa 1.1 para el control ninguna reacción (tiempo cero).
- Añadir 2 l de 0,1 M MgCl 2 a la mezcla de reacción (a una concentración final de 10 mM).
- Extraiga con las muestras 2 l de las mezclas de reacción utilizando una pipeta en intervalos de 10 s y se mezcla con el tinte de formamida predispensed en tubos de 1,5 ml preparada en el paso 1.1.
- muestras de calor a 95 ° C durante 5 minutos en un bloque de calor.
- Cargar alícuotas de las muestras en un gel desnaturalizante. Los pequeños productos de cebadores tetraribonucleotide sintetizados por la primasa T7 se resuelven bien en un 0,4 mm de espesor 25% de acrilamida: bisacrilamida (19: 1), 3 M de urea, 1x TBE (100 mM Tris-borato, EDTA 1 mM).
- Coloque gel de todo el chromatograPHY papel y la cubierta con una envoltura de plástico. gel seco utilizando un secador de gel.
- Preparar una serie de diluciones del resto de la mezcla de reacción y detectar el mismo volumen cargado en el gel en papel de cromatografía, es decir, detectar 4 l de la dilución si se cargaron 4 l de muestra.
NOTA: Esto servirá como la curva estándar para determinar la concentración de los productos formados durante la reacción. Por ejemplo, cinco veces diluciones usando tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) funcionan bien, abarca una gama de 1:25 a 1: 15.625 (5 2 -5 6), pero las diluciones deben ser ajustado en función del nivel de actividad. - Exponer gel seco y estándar utilizando una pantalla PhosphorImager. Cuantificar la radiactividad en la serie de dilución y construir una curva estándar como se describe 8, 12
NOTA: La inclusión de T7 DNA polimerasa a la mezcla de reacción permite que uno EXAmina el uso de cebadores tetraribonucleotide por esta enzima. De manera óptima, la concentración de la polimerasa debe ser saturando para simplificar la interpretación de los datos. Una concentración de la polimerasa de 0,4 M o superiores da buenos resultados. Además, el efecto de otras proteínas, tales como proteínas de unión al ADN de una sola hebra, ya sea en la síntesis de cebador o retraso-strand iniciación se puede examinar de esta manera.
2. Múltiple-rotación Primer Síntesis de reacción usando un instrumento rápido enfriamiento rápido
- Preparación de mezclas de reacción
- Preparar 400 l de solución A, que contiene tampón 1x, 0,2 mM hexámero GP4, 0,2 M plantilla ssDNA, dNTPs 0,6 mM, 0,2 mM ATP y CTP (incluyendo 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP.
- Preparar 400 l de solución B, que contiene tampón 1x y MgCl 20 mM 2.
- El funcionamiento del instrumento de flujo rápido enfriamiento rápido
- Encienda el rapIdentificación del instrumento de flujo enfriamiento rápido; después de que aparezca el menú principal, tipo 7 en el teclado del instrumento para mover el controlador de la jeringa a la posición inicial.
- posición de la jeringa tampón abierta a "CARGA".
- Jeringas de carga de amortiguamiento
- Adjuntar un tampón que contiene 10 ml de la jeringa al puerto de jeringa unidad. Cambiar la posición de la perilla de la jeringa para "CARGA".
- El uso de jeringas de 10 ml, llenar tampón instrumento depósito A y B con Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM y llenar la jeringa C con una solución de enfriamiento rápido (EDTA 250 mM, y 0,2% SDS). Eliminar las burbujas de aire empujando los émbolos de entrada y salida.
- Cambie la posición de la perilla para "disparar". Tipo 2 para ajustar la posición de la barra de conductor jeringa. Pulse "DISMINUIR" botón para bajar la jeringa hasta tampón sale del bucle de salida: (7-baja de forma continua; 8 a gran paso hacia abajo; 9-pequeño paso hacia abajo). Tipo "ESC" para volver al menú principal.
- tubos de lavado
- attlínea de salida ada a vacío. Cambiar mandos de la muestra a "flush". Cerrar tampón jeringa mediante el establecimiento de los mandos a la posición horizontal. A su vez en el vacío y moja los bucles 2 ras en H2O durante 10 s, luego sumerja en MeOH durante 10 s. bucles secos por succión de aire para ~ 15 s, o hasta que se seque.
- carga de muestras
- posición de la perilla del cambio de la muestra de "CARGA". Coloque la solución A en 1 ml de la jeringa. Enchufe jeringa en uno de los puertos de carga de la muestra. Repita el procedimiento para la solución B, y el lugar en el puerto de carga de la muestra opuesta.
- Colección de puntos temporales
- En el menú principal, tipo 1 para la corrida de flujo de enfriamiento. Introduzca el tiempo (s) de reacción y de prensa, "ENTER". El número de bucle de reacción a utilizar será mostrado. Cambiar al circuito de reacción requerida. Repita el procedimiento de lavado en el paso 2.2.4.
- Vueltas a los botones de muestra "cargar". Cargar reacción se mezcla en los bucles de muestra hasta justo fuera del compartimiento central de mezcla. Gire todas las perillas de "FIRE ". Confirmar que todos los mandos estén en la posición correcta.
- Colocar tubo de 1,5 ml en el extremo del lazo de la salida. Pulse el botón "GO" para realizar la reacción. Repita el procedimiento de lavado en el paso 2.2.4. Actualizar jeringas tampón A y B hasta que lleguen al conductor.
- Repita los pasos 2.2.6.2-2.2.6.3 para cada punto de tiempo deseado. Excepción: No cargue solución que contiene el reactivo de partida (es decir, MgCl 2 en este caso) cuando apagar el control de tiempo de punto cero.
- Cuando haya terminado la recogida de muestras, introduzca "ESC" para volver al menú principal. Pulse la tecla "7" para volver conductor jeringa búfer a su posición inicial.
- Instrumento de limpieza
- Retire las jeringas mezcla de reacción. Girar el botón de carga de la muestra a la posición "LOAD". Bajo vacío, lavar cada bucle de muestra con 10 ml de NaOH N 0,2, seguido de 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 y 10 ml de MeOH.
- Gire las perillas de jeringa a la posición "LOAD". Presione hacia abajo en los 3 SYRémbolos inge para recuperar reacción y enfriamiento rápido tampones. Lavar jeringas con 5 ml de H2O al menos dos veces.
- Llenar jeringas de nuevo con 5 ml de H2O y girar las perillas a la posición de "disparo". Cambiar las posiciones de perilla y encienda el vacío para eliminar el H 2 O. rasante como en el paso 2.2.4. Apaga instrumento.
NOTA: Los productos se analizaron como se describe en los pasos 1.7-1.12. Además, ADN polimerasa de T7 y otras proteínas de replicación se pueden añadir en la mezcla de reacción para analizar su efecto sobre la síntesis del cebador o la extensión.
3.-rotación con cebador único Síntesis de Reacción
NOTA: Single-rotación de los ensayos de imprimación síntesis / extensión se llevan a cabo de manera similar a las reacciones de múltiples volumen de negocios, con algunas diferencias importantes: estos ensayos siguen la conversión de ATP radiomarcado en cebadores o de extensión productos, sin embargo la concentración de sustratos y proteínas son consideraBly superior. Además, con el fin de alcanzar una resolución de milisegundos para permitir el análisis de la reacción de síntesis del cebador, se debe utilizar una máquina de flujo rápido enfriamiento rápido.
- Preparación de mezclas de reacción.
- Preparar 400 l de la solución A, que contiene tampón 1x, 3 M hexámero GP4, 6 M ssDNA plantilla, dNTPs 0,6 mM, CTP, 1 y 2 nM de [γ- 32P] ATP. Preparar 400 l de solución B, que contiene tampón 1x y MgCl 20 mM 2.
- Operación de flujo rápido enfriamiento rápido
- Llevar a cabo reacciones como se describe en el paso 2.2. Si se desea, añadir ADN polimerasa de T7 o proteína de unión de T7 sola-ADN de cadena a una concentración de 15 mM y 20 mM, respectivamente. En este caso, los productos de extensión se acumulan en un régimen de tiempo que permite la toma de muestras manual de la reacción.
Análisis 4. Datos
- Fit curvas de progreso de producto a lo menos- no linealcuadrados modelos que utilizan el software disponible en el mercado capaces de mínimos cuadrados ajustes y / o integración numérica. Los detalles de la operación variará con el software empleado, pero a continuación son formas generalizadas de ecuaciones utilizadas para el montaje de los datos.
- Determinar la tasa de formación de producto de múltiples reacciones de síntesis de imprimación rotación mediante el ajuste de las curvas de progresar a una ecuación lineal. Si hay curvatura significativa, utilice el método de la tasa inicial de 13, 14 ajustando los datos a una función de un solo exponencial: y = A (e - k t), donde y es la concentración de producto, A es la amplitud de reacción, k se la constante de velocidad observada, t es el tiempo, en segundos. La pendiente de la recta tangente en el tiempo = 0 es la velocidad inicial.
NOTA: Ajuste pre-estacionario reacciones de síntesis de imprimación estado a una ecuación lineal o de la ecuación de estado pre-estacionario estallar y = a (e - k buprimer t) + tasa ss t, donde A es la amplitud de reacción, k ráfaga es la constante de velocidad observada para la ráfaga estado pre-estacionario, ss tasa es la ss tasa = k gato de estado estacionario [Enzima]), t es el tiempo , en segundos. Encajan solo volumen de negocios reacciones de síntesis de imprimación curvas a una sola función exponencial y = A progresan (e - k t). En el caso de GP4, ajustar los datos por integración numérica 15, a un modelo con tres etapas de condensación NTP, donde cada intermedio se encuentra en equilibrio con la enzima, el uso de software disponible en el mercado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los resultados mostrados en la Figura 1A se obtuvieron como se describe en el paso 1 del protocolo, es decir, mediante el muestreo de forma manual una reacción de síntesis del cebador catalizada por la GP4 en condiciones de múltiples volumen de negocios. Aquí, una gama de productos después de la electroforesis en gel se puede observar mediante el uso de CTP marcada con 32 P en la α-posición en reacciones de síntesis de cebadores (Figura 1A). El precursor marcado, CTP, muestra la mayor movilidad y se desplaza hacia la parte inferior del gel, seguido de especies de migración más lenta que corresponden a la di-, tri-, y tetraribonucleotides sintetizados por GP4. Dependiendo de la duración de la incubación, y contexto de la secuencia plantilla, los productos etiquetados adicionales que corresponden a oligómeros superiores (pentaribonucleotides, etc.) pueden ser observados. Una curva de progreso de la reacción se representa mediante la determinación de primera la concentración de cebadores de longitud completa (es decir, tetra-y pentaribonucleotides) en cada punto de tiempo y el trazado de la concentración de los cebadores sintetizados como una función del tiempo.
Si bien la obtención de datos de estado estacionario, los experimentos de múltiples volumen de negocios es relativamente fácil, el contenido de información de los datos es algo limitado, ya que los datos se define en gran medida por la unión del sustrato y los eventos de lanzamiento de productos, es decir., Estos eventos suelen dominar o en gran medida determinar K y M k cat valores de 16. Si se observa la reacción a los puntos de tiempo lo suficientemente corto, antes de que se estableció el estado estacionario (en otras palabras, el estado pre-estacionario) mucho mayor contenido de información se puede derivar a partir de experimentos cinéticos. El examen de las reacciones en el estado pre-estacionario puede proporcionar un tesoro de información. Por ejemplo, si se observa una "ráfaga estado pre-estable" de formación de producto, es una buena indicación de que la liberación del producto es un paso limitante de la velocidad in la reacción. Además, se puede extraer la tasa de formación de producto (o la etapa de la química) de la fase de estado pre-constante de la reacción. Por el contrario, si no se observa una explosión de la formación de producto, entonces es evidencia de que la tasa de estado estacionario está limitada ya sea por el paso químico, o una etapa anterior y que la liberación del producto es rápida en comparación.
Cuando se utiliza un instrumento de rápido enfriamiento para examinar la reacción catalizada por gp4 en escalas de tiempo en el intervalo de segundos a unos pocos milisegundos (paso 2 del protocolo), es evidente que la acumulación de imprimación no es lineal, pero muestra una bifásica perfil (Figura 1B, línea continua). Este es un resultado de diagnóstico que demuestra evidencia de una ráfaga estado pre-constante de acumulación de producto, lo que sugiere que la formación de producto es rápida y que la liberación es limitante de la velocidad en el estado estacionario. Otros sistemas enzimáticos pueden no mostrar estacomportamiento. Por ejemplo, una curva de progreso se presenta hipotética que resultaría si la formación de imprimación por GP4 no procedió con una ráfaga estado pre-estacionario (Figura 1B, la línea de puntos). En casos como estos, la interpretación sería que la formación de producto, o un paso que lo precede, es el paso limitante de la velocidad.
Otra forma de realización de la cinética de estado pre-estacionario es el experimento de un solo volumen de negocios, donde una baja concentración de sustrato marcado se une saturando cantidades de enzima (así como ADN y CTP, en el caso de GP4). Este tipo de experimento es especialmente adecuado para proporcionar información acerca de la formación y la descomposición de las especies intermedias durante la conversión de sustrato a producto. En la reacción catalizada por GP4 (paso 3 del protocolo), la formación de imprimación es el resultado de tres reacciones de transferencia de nucleotidyl. Recientemente, hemos utilizado solo volumen de negocios reacciones de síntesis de imprimación para revelar informaciónsobre intermedios de cebadores 8 (Figura 1C) de ajuste de la acumulación dependiente del tiempo y la desaparición de los di-, tri-, y productos tetraribonucleotide a un modelo secuencial de tres pasos de transferencia nucleotidyl, donde los intermedios de ribonucleótido están en equilibrio con GP4.
Figura 1: El análisis cinético de la síntesis del cebador por la T7 helicasa primase-. (A) El curso temporal de la formación de imprimación por GP4 en un ssDNA con un único ERP. Las muestras se retiraron antes de la adición de MgCl 2 (tiempo = 0) y se tomaron muestras a intervalos después de su adición. Los productos se indican a la izquierda de la imagen del gel. (B) Línea continua: formación de cebador mediante GP4 exhibe una ráfaga estado pre-estacionario. Los valores son la media de al menos tres experimentos independientes. l de puntosINE: Representación de una curva de progreso de la reacción si la reacción catalizada por GP4 a cabo sin un estallido estado pre-estacionario. Modificado de 8. (C) la síntesis del cebador de un solo volumen de negocio por GP4. A la izquierda: el curso temporal de la formación de tetrámero. Derecha: parcela de formación intermedia en función del tiempo. Los valores son la media de al menos tres experimentos independientes. Los datos se ajustaron por integración numérica; líneas continuas muestran el ajuste. Modificado de 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El factor más importante en la realización de estos experimentos es la disponibilidad de enzima purificada de gran actividad. Durante nuestro trabajo con GP4, por ejemplo, se encontró que el almacenamiento de la enzima purificada en tampón (20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) que contiene 50% de glicerol a -20 ° C conduce a una reducción en la actividad específica del preparado durante unos meses. Por lo tanto, ahora flash congelación pequeñas alícuotas de gp4 purificada en 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, TCEP 1 mM, y 10% de glicerol utilizando nitrógeno líquido y almacenar a -80 ° C. Durante el uso del instrumento de flujo rápido de enfriamiento rápido, especialmente durante la adquisición de las primeras muestras, es importante para permitir que los reactivos alcancen la temperatura de reacción (temperatura ambiente) antes de iniciar la reacción. También, el gran cuidado se debe tomar para limpiar a fondo el tubo (etapa 2.2.4 del protocolo) después de cada punto de tiempo, como cualquier reactivo de enfriamiento restante enla línea será en gran medida inhibir la actividad enzimática, dando lugar a resultados erróneos. Otra consideración consiste en la composición del gel de poliacrilamida y su manejo. Los productos de las reacciones de síntesis de cebador catalizada por gp4 no resuelven bien en geles con menos de al menos 20% de acrilamida. De hecho, en 15% de geles, el sustrato de nucleótidos y de todos los productos de reacción migran como una zona borrosa de la radiactividad. Por lo tanto, es altamente recomendable ajustar el porcentaje de acrilamida en consecuencia si los productos de ribonucleótidos pequeños se van a analizar. Una importante desventaja del uso de geles que contienen un alto porcentaje de acrilamida es que no se adhieren bien al papel; Por lo tanto, el gran cuidado debe ser utilizado para transferirlos a la cromatografía en papel para el secado. Finalmente, los geles que contienen un alto porcentaje de acrilamida tienden a agrietarse en secadores de gel accionado por vacío. Encontramos que la reducción de la temperatura de secado a 65 ° C conduce a una menor agrietamiento de los geles. Alternativamente, los geles pueden estar expuestos a fósforopantallas Imager sin resecar.
Hay un gran número de variaciones en las condiciones de reacción y reactivos que se pueden probar usando este protocolo, y que están llevando a cabo en nuestros estudios de GP4, que van desde probar el comportamiento enzimática de las enzimas mutantes, examinar el efecto de la adición de pequeñas putativo inhibidores de moléculas o activadores, o sustratos alternativos, tales como análogos de nucleótidos, así como moldes de ADN alternativos, o cofactores de iones metálicos. El protocolo descrito anteriormente usa la temperatura ambiente como la temperatura de reacción. Si se desea otra temperatura de reacción, la mayoría de los instrumentos de rápido enfriamiento rápido contienen una válvula que permite que uno para conectar el instrumento a un baño de agua controlado de calor. En los casos en electroforética separación del producto no es satisfactoria, sobre todo si el tampón de reacción contiene una alta concentración (> 200 mM) de sal, es recomendable para el tratamiento de las muestras después del temple con 1-10 unidades de fosfatasa alcalina y se incuba a 37 ° C durante al menos 30 minutos. Esto eliminará los trifosfatos terminales de los PNT y productos de ribonucleótidos y mejorar su separación electroforética. Sin embargo, esto sólo es práctica si el nucleótido se marca en la posición α.
El uso de un instrumento de rápido enfriamiento no es conveniente para el análisis de alto rendimiento. Un usuario experimentado puede llevar a cabo el protocolo de flujo rápido enfriamiento rápido se describe aquí, a partir de la preparación de muestras, la recogida de aproximadamente 18 puntos de tiempo, y limpiar el instrumento en unas dos horas. Una restricción de tiempo adicional es el tiempo requerido para la electroforesis en gel, la exposición gel, y el análisis de datos. Otra limitación es que un experimento típico requiere 500 a 1000 l de volumen de reacción, y la obtención de suficiente enzima podría ser difícil en el caso de las proteínas que no se expresan de manera eficiente.
Hay un gran interés en el desarrollo de ensayos que permiten el cribado de alto rendimiento de primala actividad en sí, sobre todo para el desarrollo de nuevos productos terapéuticos antibacterianos 17, 18. A pesar de los avances en el desarrollo de ensayos no radiactivos, continuos para la actividad primasa, estos ensayos tienen dos limitaciones importantes y por lo tanto impedir su uso en investigaciones cinéticas rápidas, es decir, carecen de suficiente tiempo de resolución y sensibilidad de los productos. Por lo tanto, el ensayo radiactivo, discontinua descrito aquí es actualmente el estándar de oro en el examen cinética de la actividad primasa por GP4, y primasas de ADN en general. Las realizaciones más sofisticadas del protocolo descrito aquí se pueden utilizar en la determinación de la vía de cinética de una reacción catalizada por la enzima utilizando un instrumento de flujo rápido enfriamiento rápido, por ejemplo, en los experimentos de pulso-caza destinados para determinar la partición cinética de sustratos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
