Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kinetikken for lagging-kjedet DNA Synthesis Published: February 25, 2017 doi: 10.3791/55312
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

Introduction

Replikering av DNA er en konservert egenskap av alt cellenes liv. Mens identitet og antall replikasjonskomponenter varierer mye, blir de generelle mekanismer delt på tvers av en evolusjon. Her beskriver vi gel-baserte, diskontinuerlig kinetiske eksperimenter, ved hjelp av radioaktive substrater, med sikte på å forstå kinetikken av lagging kjedet DNA-syntese in vitro av komponenter av T7 replisome. Replikasjon maskineri til bakteriofag T7 er meget enkel og består av bare fire proteiner (DNA polymerase den, GP5, og dens processivity faktor, E. coli tioredoksin, de bifunksjonelle primase-helikase gp4, og enkelt-trådet DNA bindende protein, GP2. 5) 2. Denne funksjonen gjør det til et attraktivt modellsystem for å studere konserverte biokjemiske mekanismene som er involvert i DNA replikasjon.

Det legges spesielt vekt på dannelsen av ribonukleotid primere av T7 DNA primase, en critical trinn i initiering av DNA-syntese. I tillegg kan man også undersøke bruken av disse primere av T7 DNA-polymerase eller en annen replikasjonsproteiner ved å inkludere dem i reaksjonsblandingen. T7-primase-helikase, gp4, katalyserer dannelsen av primere for DNA-syntese ved spesifikke DNA-sekvenser som kalles primase sider gjenkjennings, eller PRS, (5'-GTC-3 '). Den cytosin i PRS er kryptisk, det er viktig for anerkjennelse av området, men det er ikke kopiert inn i produktet 3. Det første trinnet i syntesen av primer gp4 involverer dannelsen av dinukleotid pppAC, som deretter utvides til en trimer, og til slutt til funksjons tetranukleotid primere pppACCC, pppACCA, eller pppACAC avhengig av sekvensen i malen 4. Disse primere kan deretter brukes av T7 DNA-polymerase for å initiere DNA syntese, som også er en gp4 assistert prosess 5, 6. I denne forbindelse, primasedomene stabiliserer ekstremt korte tetraribonucleotides med malen, hindrer deres dissosiasjon, engasjerer DNA polymerase på en måte som bidrar til å sikre primer / mal i polymerase aktive området 7. Disse trinnene (RNA primer syntese, primer overlevering til polymerase, og forlengelse) blir gjentatt i flere sykluser for å gjenskape lagging strand og må koordineres med replikering av de ledende tråden.

Analysene beskrevet her er meget følsomme og kan utføres i et moderat tidsrom. Men de er relativt lav gjennomstrømning og stor forsiktighet må utøves i bruk og deponering av radioaktivt materiale. Avhengig av hastigheten ved hvilken reaksjonen skrider frem, kan man anvende et hurtigavkjølingsapparatet for å oppnå prøver ved tidsskalaer mottagelig for meningsfull analyse av reaksjons tidsforløp i enten stabil eller pre-stabil tilstand. Nylig har vi brukt analyser som er beskrevet her for å gi evidence av betydningen av primeren frigjøring fra primase domene av gp4 i initiering av Okazaki-fragmenter. I tillegg har vi funnet bevis for en regulatorisk rolle for T7-enkelt-trådet DNA bindende protein, gp2.5, for å fremme effektiv primer dannelse og utnyttelse 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Følg alle institusjonelle forskrifter om sikker bruk og deponering av radioaktivt materiale, inkludert men ikke begrenset til, bruk av personlig verneutstyr, som hansker, vernebriller, frakk, og egnede akryl skjold.

MERK: standard buffer består av 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM kaliumglutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (buffer denne er ferdiggjort på en 5 x konsentrasjon) og 0,3 mM av hver dNTP. T7 replikasjonsproteiner blir renset som beskrevet 8, 9, 10. Enkelt-trådet DNA inneholdende et enkelt T7 primase-gjenkjennelsessete (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') kan kjøpes fra en rekke DNA-syntese selskaper (lengden av ssDNA kan avhenge av enzymet av valget, for T7 primase, er en pentamer minimums mal lengde for å syntetisere en full-lengde primer 11, da det kryptiske C er viktig, men hvis tennsatsen skal forlenges ved polymerase, videre nukleotider må være til stede i 3'-enden av templaten. Reaksjonene initieres ved tilsetning av en sluttkonsentrasjon på 10 mM MgCl2 og inkubert ved 25 ° C. Manuell prøvetaking fungerer godt for tidspunkter på 5 sekunder eller mer. Hvis tidspunkter kortere enn det er nødvendig, er det anbefalt å bruke en hurtig-quench flyt instrument for å få nøyaktige data.

1. Fler omsetning Primer Synthesis Reaksjon ved manuell Sampling

  1. Før eksperimentet startes, alikvoter 2 pl formamid fargestoff-buffer (93% (v / v) formamid, 50 mM EDTA, 0,01% xylencyanol og 0,01% bromfenolblått) inn i 8 1,5 ml polypropylenrør. Generelt er det antall rør er lik antallet tidspunkter analysert.
  2. Forbered en 20 mL blanding bestående 1x buffer, 0,1 mM ATP og CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32P] CTP, 0,1 mikrometer SSDNA mal, og 0,1 mikrometer GP4 (uttrykt som hexamer konsentrasjon - 0,6 mikrometer monomer).
  3. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 5 min.
  4. Fjern 2 ul av blandingen ved hjelp av en pipette og bland med 2 ul formamid fargestoff buffer i et 1,5 ml rør fremstilt i trinn 1,1 for ingen reaksjon kontroll (tid null).
  5. Tilsett 2 mL av 0,1 M MgCl2 til reaksjonsblandingen (til en endelig konsentrasjon på 10 mM).
  6. trekke tilbake manuelt 2 ul prøver av reaksjonsblandinger ved hjelp av en pipette i 10 sek intervaller og bland med formamid fargestoff predispensed i 1,5 ml rør fremstilt i trinn 1.1.
  7. Varme prøvene ved 95 ° C i 5 minutter i en varmeblokk.
  8. Laster porsjoner av prøvene på en denaturerende gel. De små tetraribonucleotide primer produkter syntetisert av T7-primase løses godt innenfor et 0,4 mm tykt 25% akrylamid: bisakrylamid (19: 1), 3 M urea, 1 x TBE (100 mM Tris-borat, 1 mM EDTA).
  9. Plasser hele gel på kromatogramgrafi papir og dekke med plastfolie. Tørr gel ved å bruke en gel tørrere.
  10. Tilbered en fortynningsserie av resten av reaksjonsblandingen og spot det samme volum lastet på gelen på kromatografipapir, det vil si, få øye på 4 pl av fortynningen hvis 4 ul av prøven ble lastet.
    MERK: Dette vil tjene som standardkurven for å bestemme konsentrasjonen av produkter som dannes under reaksjonen. For eksempel, fem-gangers fortynning ved hjelp av TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) fungere godt, som spenner over et område på 1:25 til 1: 15625 (5 2 -5 6), men fortynningene bør bli justert avhengig av nivået av aktivitet.
  11. Expose tørr gel og standard ved hjelp av en phosphorimager skjerm. Kvantifisere radioaktivitet i fortynningsserie og konstruere en standardkurve som er beskrevet 8, 12
    MERK: Inkludering av T7 DNA-polymerase til reaksjonsblandingen gjør det mulig å exagruve bruken av tetraribonucleotide primere av dette enzymet. Optimalt bør polymerasen konsentrasjonen mette for å forenkle tolkningen av dataene. En polymerase konsentrasjon på 0,4 pM eller høyere gir gode resultater. I tillegg kan virkningen av andre proteiner, slik som enkelt-trådede DNA-bindende proteiner, på hver primer syntese eller henger leder initiering undersøkes på denne måte.

2. Multiple-omsetning Primer Synthesis Reaksjon Ved hjelp av en Rapid-quench Instrument

  1. Utarbeidelse av reaksjonsblandinger
    1. Forbered 400 ul av oppløsning A inneholdende 1 x buffer, 0,2 pM gp4 hexamer, 0,2 pM ssDNA templat, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP og CTP (inkludert 0,5 mCi / mL [α- 32P] CTP.
    2. Fremstille 400 ul av oppløsning B, inneholdende 1 x buffer og 20 mM MgCl2.
  2. Drift av raske slukke flyt instrument
    1. Slå på rapid-stopp flyt instrument; etter at hovedmenyen vises, skriver 7 på instrumentet tastaturet flytte sprøyten sjåføren til utgangsposisjonen.
    2. Åpne buffer sprøyte posisjon til å "LOAD".
  3. Laster buffer sprøyter
    1. Fest en 10 ml sprøyte som inneholder buffer til stasjonen sprøyten port. Endre sprøyte knott posisjon til å "LOAD".
    2. Ved hjelp av 10 ml sprøyter, fyll instrument bufferreservoaret A og B med 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA og fylle sprøyten C med quench-oppløsning (250 mM EDTA, og 0,2% SDS). Fjerne luftbobler ved å skyve stemplene ut og inn.
    3. Endre knott posisjoner til "FIRE". Type 2 for å justere posisjonen til sprøyten drivstangen. Trykk "ADJUST DOWN" knappen for å senke sprøyten før bufferen kommer ut utkjørselen bue: (7-går ned kontinuerlig, 8-stort skritt ned, 9-lite steg ned). Skriv "ESC" for å gå tilbake til hovedmenyen.
  4. Vask tubing
    1. Attach exit linje til vakuum. Endre prøve knotter til "flush". Lukk buffer sprøyten ved å sette knottene til horisontal stilling. Slå på vakuum og dypp to flush sløyfer i H 2 O for 10 s, deretter dyppe i MeOH i 10 s. Tørre loops ved å suge luft for ~ 15 s, eller til den er tørr.
  5. lastet inn prøver
    1. Endre prøven knott posisjon til å "LOAD". Plasser løsning A i 1 ml sprøyte. Plugg sprøyte inn i en av prøvelast porter. Gjenta for løsning B, og plasser i motsatt prøvelast port.
  6. Innsamling av tidspunkter
    1. På hovedmenyen type 1 for quench-flow løp. Tast reaksjonstid (e) og trykk "Enter". Reaksjonen sløyfe nummer som skal brukes vil bli vist. Bytt til nødvendig reaksjon loop. Gjenta vaskeprosedyren i trinn 2.2.4.
    2. Slå prøve knotter til "Load". Load reaksjon blander i prøve sløyfer til like utenfor det sentrale blanderommet. Snu alle knotter til "FIRE ". Bekreft at alle knotter er i riktig posisjon.
    3. Plasser 1,5 ml tube på slutten av exit loop. Trykk på "GO" for å kjøre reaksjonen. Gjenta vaskeprosedyren i trinn 2.2.4. Last buffer sprøyter A og B før de treffer sjåføren.
    4. Gjenta trinn 2.2.6.2-2.2.6.3 for hver ønsket tidspunkt. Unntak: Ikke legg løsning som inneholder starten reagens (dvs. MgCl2 i dette tilfellet) når slukke null tids punkt kontroll.
    5. Når du er ferdig å samle inn prøver, skriv "ESC" for å gå tilbake til hovedmenyen. Trykk "7" for å returnere buffer sprøyte driver tilbake til utgangsposisjon.
  7. Instrument opprydding
    1. Fjern reaksjonsblandingen sprøyter. Slå utvalg lasting knappen på "Load" posisjon. Under vakuum, vaskes hver prøvesløyfen med 10 ml 0,2 N NaOH, etterfulgt av 10 ml 0,3 NH3 PO 4 og 10 ml MeOH.
    2. Slå sprøyte knotter til "Load" posisjon. Trykk ned på alle tre syrInge stempler å hente reaksjons og kjøle buffere. Vask sprøyter med 5 ml H2O minst to ganger.
    3. Fyll sprøyter igjen med 5 ml H 2 O og vri knotter til "FIRE" posisjon. Endre knott stillinger og slå på vakuum for å fjerne H 2 O. Flush som i trinn 2.2.4. Slå av instrumentet.
      MERK: Produktene er analysert som beskrevet i trinn 1.7-1.12. I tillegg kan T7 DNA-polymerase og andre replikasjonsproteiner tilsettes i reaksjonsblandingen for å analysere deres effekt på primer-syntese eller forlengelse.

3. Single-omsetning Primer Synthesis Reaction

MERK: Single-omsetning primer syntese / forlengelses analyser er utført på samme måte som flere omsetningsreaksjoner, med noen få store forskjeller: disse analyser følge omdannelsen av radiomerket ATP inn i prime eller rekstensjonsprodukter, men konsentrasjonen av substrater og proteiner er considerably høyere. I tillegg, for å oppnå oppløsning millisekund for å tillate analyse av tennsatsen syntesereaksjonen, må man bruke en hurtig-bråkjøling strømningsmaskin.

  1. Utarbeidelse av reaksjonsblandinger.
    1. Forbered 400 ul av oppløsning A inneholdende 1 x buffer, 3 uM gp4 hexamer, 6 pM ssDNA templat, 0,6 mM dNTP, 1 mM CTP, og 2 nM [γ- 32 P] ATP. Fremstille 400 ul av oppløsning B, inneholdende 1 x buffer og 20 mM MgCl2.
  2. Rapid-stopp flyt drift
    1. Utføre reaksjonene som beskrevet i trinn 2.2. Hvis ønskelig, legge til T7 DNA-polymerase eller T7-enkelt-trådet DNA bindende protein ved en konsentrasjon på 15 uM og 20 uM, respektivt. I dette tilfelle forlengelsesprodukter akkumuleres på et tidspunkt regime som gir mulighet for manuell prøvetaking av reaksjonen.

4. Data Analysis

  1. Monter produktet fremdriftskurver til ikke-lineær minste-firkanter modeller ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare som kan minste kvadraters rykk og / eller numerisk integrasjon. Detaljene ved operasjonen vil variere med den anvendte programvare, men nedenfor er generaliserte former av ligninger som brukes for å tilpasse dataene.
  2. Bestem frekvensen av produktet dannelsen av flere omsetningen primer syntesereaksjoner ved å tilpasse til fremgang kurver til en lineær ligning. Hvis det er betydelig krumning ved å bruke den innledende hastighetsmetode 13, 14 ved å tilpasse dataene til en enkelt-eksponensiell funksjon: y = A (e - k t), hvor y er det produktkonsentrasjon, A er reaksjons amplitude, blir k den observerte hastighetskonstanten, t er tiden i sekunder. Helningen til tangentlinjen ved tid = 0 er den første satsen.
    MERK: Fit pre-steady state primer syntese reaksjoner på en lineær ligning eller til pre-steady state brast ligningen y = A (e - k burst t) + sats ss t, hvor A er reaksjonen amplitude, er k burst den observerte hastighetskonstanten for pre-steady state burst, er satsen ss steady-state rente ss = k katt [Enzyme]), er t tiden i sekunder. Passe enkelt omsetning primer syntesereaksjoner fremgang kurver til en enkelt-eksponensiell funksjon y = A (e - k t). I tilfelle av gp4, passer dataene ved numerisk integrasjon 15, til en modell med tre NTP kondensasjons-trinn, hvor hvert mellomprodukt er i likevekt med enzymet, ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatene er vist i Figur 1A ble oppnådd som beskrevet i trinn 1 i protokollen, dvs. ved manuell prøvetaking en primer syntesereaksjon katalysert ved hjelp av gp4 henhold multippel-omsetningsforhold. Her kan en rekke produkter etter gelelektroforese holdes ved hjelp av CTP merket med 32p ved α-stillingen i grunningssyntesereaksjoner (figur 1A). Det merkede forløper, CTP, viser det høyeste mobilitet og migrerer mot bunnen av gelen, etterfulgt av langsommere vandrende art som korresponderer med di-, tri-, og tetraribonucleotides syntetisert av gp4. Avhengig av lengden av inkuberingen og templatsekvensen sammenheng, kan flere merkede produkter som tilsvarer høyere oligomerer (pentaribonucleotides, etc.) holdes. En reaksjonsforløpet kurve er plottet ved først å bestemme konsentrasjonen av full-lengde primere (det vil si, tetra-og pentaribonucleotides) ved hvert endepunktet og plotting av konsentrasjonen av primerne syntetisert som en funksjon av tiden.

Mens innhente data fra steady-state, er flere omsetnings eksperimenter relativt enkelt, informasjonsinnholdet i data er noe begrenset, så dataene er sterkt definert av underlaget bindende og produkt utslipp hendelser, altså., Disse hendelsene vanligvis dominere eller sterkt bestemme K M og k katt verds 16. Dersom reaksjonen observeres ved korte nok tidspunkter, før den steady-state er etablert (med andre ord, den pre-steady state), kan langt større informasjonsinnhold være avledet fra kinetiske forsøk. Undersøkelse av reaksjoner i pre-steady state kan gi en trove av informasjon. For eksempel, hvis en "pre-steady state burst" av produktdannelse er observert, er det god indikasjon på at produktet utgivelsen er en hastighetsbegrensende trinn in reaksjonen. Videre kan man trekke hastigheten av produktdannelse (eller den kjemi trinn) fra pre-steady state fase av reaksjonen. I motsetning til dette, hvis et utbrudd av produktdannelse ikke er observert, så er det bevis på at den stabile tilstand blir begrenset enten av kjemiske trinn, eller et trinn som går forut for, og at frigjøringen av produktet er hurtig i sammenligning.

Når en hurtig-bråkjøling instrument blir brukt til å undersøke reaksjonen katalyseres av gp4 på tidsskalaer i størrelsesorden av noen sekunder ned til noen få millisekunder (trinn 2 av protokollen), er det klart at primer akkumulering er ikke lineær, men viser en bifasisk profil (figur 1B, heltrukket linje). Dette er en diagnostisk resultat demonstrerer bevis for en pre-stabil tilstand utbrudd av produkt akkumulering, noe som antyder at produktdannelse er hurtig og det er frigjøringshastighetsbegrensende i den stabile tilstand. Andre enzymsystemer kan ikke vise denneoppførsel. For eksempel er en hypotetisk kurve fremskritt presentert som ville resultere hvis primer dannelsen av gp4 ikke fortsette med en pre-stabil tilstand burst (figur 1B, stiplet linje). I tilfeller som disse, vil tolkningen være at produktdannelse, eller et trinn forut for den, er det hastighetsbegrensende trinn.

En annen utførelsesform av pre-stabil tilstand kinetikk er det enkelt-omsetning eksperiment, hvor en lav konsentrasjon av merket substrat er bundet ved metning mengder av enzym (så vel som DNA og CTP, i tilfelle av gp4). Denne type eksperiment er unikt egnet til å gi informasjon om dannelse og nedbrytning av mellomliggende arter under konvertering av substrat til produkt. I gp4-katalysert reaksjon (trinn 3 av protokollen), er primer dannelsen resultatet av tre nucleotidyl overføringsreaksjoner. Nylig har vi brukt single-omsetningen primer syntesereaksjoner å avsløre informasjonom primer mellomprodukter 8 (figur 1C) ved montering av tidsavhengige opphopning og forsvinning av di-, tri-, og tetraribonucleotide produkter til en sekvensiell modell av tre nucleotidyl overføringstrinn, hvor ribonukleotid-mellomproduktene er i likevekt med gp4.

Figur 1
Figur 1: Kinetisk analyse av primer syntese av T7-primase-helikase. (A) Tids løpet av primer dannelse av gp4 på en ssDNA med en enkelt PRS. Prøver ble fjernet før tilsetning av MgCl2 (tid = 0) og samplet ved intervaller etter at tilsetningen. Produktene er angitt til venstre for gelen bildet. (B) Solid linjen: Primer dannelsen av GP4 viser en pre-steady state briste. Verdier er gjennomsnitt av minst tre uavhengige eksperimenter. prikket line: Representasjon av et reaksjonsforløpet kurve hvis gp4-katalyserte reaksjonen skred frem uten en pre-stabil tilstand briste. Modifisert fra 8. (C) Single-omsetningen primer syntese av GP4. Venstre: tidsforløpet av tetramer formasjon. Høyre: tomt på mellom formasjon i forhold til tid. Verdier er gjennomsnitt av minst tre uavhengige eksperimenter. Data ble passe ved numerisk integrasjon; heltrukne linjer viser passform. Modifisert fra 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den viktigste faktoren i å utføre disse forsøkene er tilgjengeligheten av høyaktiv renset enzym. Under vårt arbeid med gp4, for eksempel, har vi funnet at lagring av det rensede enzym i buffer (20 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) inneholdende 50% glycerol ved -20 ° C fører til en reduksjon i den spesifikke aktiviteten av preparatet i løpet av et par måneder. Derfor har vi nå flash-fryse små alikvoter av renset gp4 i 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP, og 10% glycerol ved hjelp av flytende nitrogen og lagres ved -80 ° C. Ved bruk av hurtigavkjølingsstrømnings instrument, særlig under innhenting av de første prøvene, er det viktig å tillate reaktantene å nå reaksjonstemperatur (romtemperatur) før start av reaksjonen. I tillegg bør det utvises stor forsiktighet for å rengjøre røret (trinn 2.2.4 av protokollen) etter hver gang-punktet, som eventuelt gjenværende kjøle reagens ilinjen vil i stor grad hemmer enzymaktiviteten, noe som fører til feilaktige resultater. En annen vurdering omfatter sammensetningen av polyakrylamid gel og dens håndtering. Produktene i primer-syntesereaksjoner katalysert av gp4 løser ikke godt i geler med mindre enn minst 20% akrylamid. Faktisk, på 15% geler, nukleotid substratet og alle reaksjonsprodukter migrerer som et utydelig sone av radioaktivitet. Derfor er det sterkt anbefalt å justere akrylamid prosentandelen tilsvarende Hvis mindre ribonukleotid produkter skal analyseres. En stor ulempe ved bruk av geler inneholdende en høy prosentandel av akrylamid, er at de ikke kleber godt til papir; derfor stor forsiktighet må brukes for å overføre dem til kromatografi papir for tørking. Til slutt, geler inneholdende en høy prosentandel av akrylamid har en tendens til å sprekke i vakuumdrevne gel tørketromler. Vi finner at å senke tørketemperaturen til 65 ° C fører til mindre spalting av geler. Alternativt kan gelene bli utsatt for fosforKameraer skjermer uten tørking.

Det finnes et stort antall variasjoner i reaksjonsbetingelser og reagenser som kan testes ved hjelp av denne protokollen, og som vi arbeider med i våre studier av gp4, som strekker seg fra testing av den enzymatiske virkemåten av mutante enzymer, undersøke virkningen av tilsetningen av antatte små lavmolekylære inhibitorer eller aktivatorer, eller alternative substrater, som for eksempel nukleotid-analoger, så vel som alternative DNA-templater eller metallion-kofaktorer. Protokollen er beskrevet ovenfor bruker romtemperatur som reaksjonstemperatur. Hvis en annen reaksjonstemperatur er ønsket, de fleste hurtig-kjøle instrumenter som inneholder en ventil som gjør det mulig å koble instrumentet til en varmeregulert vannbad. I tilfeller hvor elektroforetisk separasjon produkt ikke er tilfredsstillende, særlig hvis reaksjonsbufferen inneholder en høy konsentrasjon (> 200 mM) salt, er det tilrådelig å behandle prøvene etter bråkjøling med 1-10 enheter av alkalisk fosfatase og inkuber ved tre7 ° C i minst 30 minutter. Dette vil fjerne terminal triphosphates fra NTPs og ribonukleotid produkter og forbedre deres elektro separasjon. Dette er imidlertid bare praktisk dersom nukleotid merket ved α stilling.

Bruk av en hurtig-stopp instrument er ikke praktisk for high-throughput analyser. En erfaren bruker kan utføre raske slukke flyt protokollen beskrevet her, fra prøveopparbeidelse, samle ca 18 tidspunkter, og rengjøring av instrumentet i ca to timer. En ytterligere tidsbegrensning er den tid som kreves for gelelektroforese, gel eksponering, og dataanalyse. En annen begrensning er at et typisk eksperiment krever 500 til 1000 ul reaksjonsvolum, og å skaffe tilstrekkelig enzym kan være utfordrende når det gjelder proteiner som ikke er uttrykt effektivt.

Det er stor interesse for å utvikle analyser som muliggjør high-throughput screening av primase aktivitet, særlig for å utvikle nye antibakterielle legemiddel 17, 18. Til tross for fremskritt i utviklingen av ikke-radioaktive, kontinuerlige analyser for primase aktivitet, disse analysene lider av to store begrensninger og dermed ikke å bruke dem i raske kinetiske undersøkelser, dvs. mangler tilstrekkelig tidsoppløsning og produktet følsomhet. Derfor er radioaktive, usammenhengende analysen beskrevet her er for tiden gullstandarden i den kinetiske undersøkelsen av primase aktivitet ved GP4, og DNA primases generelt. Mer avanserte utførelser av den protokoll som er beskrevet her kan anvendes til bestemmelse av den kinetiske reaksjonsveien av et enzym-katalysert reaksjon under anvendelse av en hurtig-bråkjøling strømning instrument, for eksempel i puls-chase eksperimenter som er beregnet for å bestemme den kinetiske oppdeling av substrater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris pre-set crystals
pH 7.5		 SIGMA T4128
Tris base SIGMA 93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate SIGMA G1501 
Magnesium chloride hexahydrate Mallinckrodt Chemicals 5958-04
1,4-Dithiothreitol J.T. Baker F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate MP Biomedicals 811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate Mallinckrodt Chemicals 4931-04
[α-32P] CTP PerkinElmer BLU508H radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP PerkinElmer BLU502A radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP  Affymetrix 77100 four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP Epicentre RN02825 part of NTP set
ssDNA constructs Integrated DNA Technologies N/A custom sequences 
methanol  Macron Fine Chemicals 3017-08
formamide Thermo Scientific 17899
bromophenol blue SIGMA B8026 
cylene xyanol  SIGMA X4126 
acrylamide SIGMA A9099 Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide SIGMA M7279  Toxic
Urea Boston Bioproducts P-940
Boric acid Mallinckrodt Chemicals 2549
Rapid Quench-Flow Instrument  Kintek Corp. RQF-3 
Kintek Explorer Kintek Corp. N/A
Kaleidagraph  Synergy Software N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
  2. Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
  3. Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
  4. Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
  5. Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
  6. Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
  7. Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
  8. Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
  9. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  10. Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
  11. Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
  12. Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
  13. Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
  14. Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
  15. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
  16. Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
  18. Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).

Tags

Genetikk syntese DNA replisome kinetikk raske dempingen primase polymerase
Kinetikken for lagging-kjedet DNA Synthesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Av bakteriofag T7 Replication Proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez, A. J., Richardson, C. C.… More

Hernandez, A. J., Richardson, C. C. Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins. J. Vis. Exp. (120), e55312, doi:10.3791/55312 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter