Summary
Здесь мы описываем хроматографического пробирного, в сочетании с разделением мобильность ионов пептид прекурсоров, следуют с высоким разрешением (~ 30,000) MS-обнаружение терпеноидные фрагменты для количественной оценки стандартов шипами пептида в моноклональных антител Дайджест.
Abstract
Анализ низкого уровня (1-100 ppm) белковых примесей (например, хост клетки белки (ВДС)) применения инновационных технологий биотерапевтических белка является сложной пробирного, требующих высокой чувствительности и широким динамическим диапазоном. Масса на основе спектрометрии количественная оценка анализов для белков, как правило, включают переваривания белка следуют реакции мониторинг/несколько селективная реакция, мониторинг (SRM/MRM) количественная оценка пептидов, используя разрешением тандем (Rs ~ 1000) квадрупольный масс-спектрометр. Один из недостатков этого подхода явление интерференции наблюдается, когда пептид интерес имеет «же» прекурсоров и фрагмент массы (с точки зрения значения m/z) как другие совместно eluting пептидов в образце (в окне 1-Da). Чтобы избежать этого явления, мы предлагаем альтернативный масс-спектрометрических подход, высокая избирательность (HS) MRM assay, который сочетает в себе разделение мобильность ионов пептид прекурсоров с высоким разрешением (Rs ~ 30000) MS обнаружения фрагментов пептидов. Мы изучили возможности такого подхода для количественного определения низкого изобилие пептид стандартов шипами в дайджест моноклональных антител (МАБ) и продемонстрировал, что он имеет чувствительность и динамический диапазон (по крайней мере 3 порядков) обычно достигнутого в ГПУ анализ. Все шесть пептид стандартов были обнаружены в концентрациях, как низко как 0.1 Нм (1 femtomole загружены на Хроматографическое столбец ID 2.1-мм) в присутствии высоких изобилие пептид фон (2 мкг МАБ дайджест загружен на-столбца). При рассмотрении МВт кролик фосфорилаза (97,2 кДа), от которого были получены шипами пептиды, LOQ этот assay меньше чем 50 ppm. Относительной стандартных отклонений (RSD) пик областей (n = 4 реплицирует) были меньше, чем 15% в диапазоне всего концентрация расследование (0,1-100 Нм или 1-1000 ppm) в этом исследовании.
Introduction
Количественная оценка крупных биомолекул (белков) в промышленных условиях в настоящее время основывается на immunoassays (например, ELISAs), главным образом из-за ряда преимуществ: чувствительность, высокой пропускной способности, простота использования и низкая стоимость на сэмпл. При применении для анализа низкой обилие белковых примесей (1-100 ppm-клетки хозяина белков (ВДС)) в терапии белка, эти биологические анализы обычно предоставляют общую концентрацию HCP (обычно выражается в ppm или нг HCP/мг МАБ), но они не удается определить и оценить отдельные загрязнители HCP. Недавно были подготовлены несколько анализов на основе MS для дополнения ELISAs или предоставлять информацию, что ELISAs не предлагать1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. Ввиду сложности образца и требование для обнаружения HCP пептиды через широкий динамический диапазон концентрации (по крайней мере 3 порядков), имеют многомерные Хроматографические методы торгов обширной выборки фракционирования традиционно использовались для выявления низкого обилие ВДС1,2,3,4,5,6,7.
Естественный шаг после HCP идентификации и проверки является HCP отслеживание (мониторинг) через несколько серий биофармацевтики. В этой ситуации были предложены методы одномерного LC/МС для улучшения образца пропускной способности8,9. Однако точность и динамический диапазон HCP измерений могут быть затронуты в assay LC/МС 1D подавляющее присутствие биофармацевтической пептиды. По сравнению с многомерной разделения, потенциал для сигнала помехи19,20,,2122 увеличивается в одномерных хроматографического разделения потому что вероятность больше пептид прекурсоров будет совместно eluting увеличивается. Включение ортогональных средств для разделения пептид прекурсоров без продления хроматографического разделения времени явно бы выгодным. Путешествия волны ионной подвижности (TWIM)10 имеет возможность разрешения перегруженных МС спектры в миллисекундах. Около 500 цветоделение мобильности может быть выполнена во время элюции одного пептид, предполагая полную хроматографического пика шириной 10 s и учитывая, что среда выполнения им разделения на инструменте подвижности ионов 20 мс.
Масс-спектрометрических анализов для количественного определения белка были успешно разработаны в последние десятилетия с использованием общепринятых выбран (несколько) реакции, мониторинг подход (SRM/MRM метод) реализован на тандеме масс-спектрометров11, 12,13,14,,1516,,1718,19,20,21 ,,22-23. Одним из ограничений этот разрешением масс-спектрометрических assay является вмешательство явление19,20,21,22 наблюдается при пептид интерес имеет «же» прекурсоров и фрагмент массы других совместно eluting пептиды представляют в образце (в окне 1-Da). Существует два способа для улучшения точности методов SRM/Записями: один вариант предусматривает дополнительное разделение шаг на уровне прекурсоров для удаления мешающих ионов прекурсоров, в то время как другой вариант заключается в том, чтобы увеличить разрешение MS прекурсоров/фрагмент обнаружения для Избегайте перекрывающихся MS сигналов. Высокоизбирательные Записями (HS) приобретение режим описано здесь использует оба этих подхода, связывая разделение мобильность ионов пептид прекурсоров с высоким разрешением (Rs ~ 30000) MS обнаружения фрагментов пептидов. Assay описано здесь охватывает, по меньшей мере трех порядков, которые это динамический диапазон обычно наблюдается в SRM/MRM протеомики эксперименты17,18,24.
Утилита assay HS-Записями для квантификации HCP свидетельствует мониторинг линейность сигнала, производимые шесть стандартов пептид, шипами в различных концентрациях (диапазоне 0.1 - 100 Нм) в дайджест моноклональных антител.
Protocol
1. Подготовка инфликсимаб дайджест (~ 24 h процедура)
- Подготовьте свежие решения бикарбонат аммония 50 мм, 1% анионных ПАВ в 50 мм NH4HCO3, 500 мм Дитиотреитол (DTT) в 50 мм NH4HCO3и iodoacetamide (IAM) 500 мм на 50 мм NH4HCO3.
- До 750 мкл 50 мм NH4HCO3добавить 200 мкл концентрированного препарата инфликсимаб МАБ (10 мг/мл) и 50 мкл раствора 1% анионных ПАВ и денатурировать протеина для 15 мин при 60 ° C в присутствии анионных ПАВ 0,05%.
- 40 мкл 500 мм DTT и уменьшить образца для 60 мин при 60 ° C в присутствии 20 мм DTT.
- 20 мкл 500 мм IAM и алкилата образца на 30 минут при комнатной температуре в темноте присутствии ~ 10 мм IAM.
- Добавьте содержимое пробки microcentrifuge стеклянный флакон, содержащий 20 мкг MS виртуализации класса Lys C/трипсина и дайджест образца для 3 ч при 37 ° C.
- Добавьте второй фермент аликвота (20 мкг) путем передачи образце перевариваются другого стекла флакон, содержащий 20 мкг MS виртуализации класса Lys C/трипсина и дайджест образца на ночь (12-15 ч) при температуре 37 ° C.
- После ночи протеолиза 5 мкл, 100% муравьиной кислоты (FA) и инкубировать дайджест для 30 минут при 37 ° C для разложения кислоты лабильной анионное ПАВ.
- Спин вниз дайджест за 15 мин на 4000 x g в центрифуге для осадка нерастворимых компонентов анионное ПАВ.
- Восстановить ~ 1000 мкл концентрированного препарата инфликсимаб дайджест и поместите его в LC auto сборники флаконе; Дайджест концентрация должна быть ~ 2 мг/мл. Храните в холодильнике при температуре-20 ° C дайджест, пока LC/МС система готова для анализа.
2. владением пептид стандартов (~ 30 мин)
- Оттепель инфликсимаб дайджест, поместив замороженного образца в стеклянный флакон на скамейке при комнатной температуре.
- Добавьте 1 мл 0,1%, Англии во флаконе дайджест H2O один кролик фосфорилаза b (Пхо) подготовить 1-мкм акций решения для всех шести пептид стандартов от Пхо, содержащийся в ампулу (флакон содержит 1 нмоль каждого пептида).
- Подготовка 4 x 1 мл разведений Пхо Стоковый раствор для получения решения, содержащие 0.1, 1, 10 и 100 Нм пептиды, используя 0,1% FA как разбавления растворителем. Подготовка всех разведениях в стеклянных флаконах (LC auto сборники ампул) и 100 мкл инфликсимаб дайджест как матрица фон для всех флаконах. Загрузка 2 мкг дайджест фон на колонке с каждой 10-мкл инъекции. Подготовьте пустую выборку, содержащую дайджест разреженных инфликсимаб (же 1:10 разрежения), с не шипами пептиды.
3. Настройка метода сбора данных LC/HDMS E
Примечание: Рабочий процесс, резюмируя шаги, необходимые для установки HS-мно приобретение изображен на рисунке 1 и подробно в разделы 3-6. Приобретение набора данных независимые HDMSE требуется установить время хранения каждого наблюдаемого пептид, родитель m/z наиболее распространенных пептид-иона, после электроспрей ионизации, и соответствующий CCS (Столкновительное крест раздел), производный от разделения подвижности ионов. Кроме того зависящий от данных dataset предоставляет информацию относительно m/z трех наиболее распространенных ионов фрагмент для каждого прекурсора пептида. На втором шаге рабочего процесса (CE оптимизация) чувствительность assay увеличивается на тюнинг столкновения энергию клеток для получения высокой интенсивности Ион для каждого фрагмента Ион. Наконец в последнем шаге, все описанные выше параметры вводятся в редактор метода HS-Записями для каждого пептид наблюдение.
- Выполните LC/MS эксперименты на квадрупольного время полета (QTOF) масс-спектрометр сочетании жидкостной хроматографии ультра производительность системы с помощью метода сбора данных независимые (HDMSE).
Примечание: Более подробную информацию относительно инструмент конфигурации включены в разделе материала. Этот инструмент использует путешествия волны Ион мобильности устройство для разделения пептид прекурсоров10. - Подготовить два подвижных фазах, содержащие 0,1% FA в воде (растворитель A) и 0.1% FA в ацетонитриле (растворитель B).
Примечание: Используйте столбец C18 заряженной поверхности гибридные (CSH) (2,1 x 150 мм, Упакованные с частицами 1.7 мкм) для разделения дайджесты шипами МАБ. - В программном обеспечении сбора данных нажмите на «Метод Create/анализа» и выберите «Создать приобретения и метода обработки.» Введите имя метода, перейдите к папке метода (каталог) и нажмите кнопку «Далее».
- Для «Тип анализа,» выбрать «пептид карта (IMS)» и в закладке «Инструмент системы» выберите инструмент «Четвертичных растворителя менеджер». Редактировать настройки градиента для достижения разделения пептид 200 мкл/мин использования градиента элюции от 1 до 40%, B растворителя в 30 мин, после чего мыть столбец 2-мин со скоростью потока и уравновешивания 9-мин, с общей средой выполнения 50 мин внедрить эти экспериментальные параметры в редакторе метода LC.
- В закладке «Инструмент системы» выберите инструмент «Образец менеджер». Установите температуру образца до 10 ° C и столбец температуру до 60 ° C.
- Работают в масс-спектрометр QTOF в положительный ион режим чувствительности ESI, разрешая типичные мощностью 30000 FWHM.
Примечание: LC/HDMSE является приобретение данных независимые (DIA) режим, который действует быстро собирая сканирование с чередующимися столкновения энергий (в ячейке столкновения) между низкой энергией (6 V для сканирование канала 1 мс) и повышенной энергии (15 - 40 V рампы производят фрагментации спектров без отбора прекурсоров в MS канал 2).- Введите параметры MS связанных с источника по умолчанию в программное обеспечение получения данных: от «Мои работы/инструмент системы,» выберите вкладку «Vion IMS Qtof» и в меню «Инструменты», введите эти параметры: 3,0 кв капиллярного напряжения, источник температуры 100 ° C, 100 V источник смещение, 50 Л/ч конус потока газа и 40 V конуса напряжения. Установите температуру desolvation до 250 ° C, desolvation скорости газового потока до 500 Л/ч и опорного напряжения капиллярного 3.0 кв.
- В программном обеспечении сбора данных нажмите на «Метод Create/анализа» и выберите «Создать приобретения и метода обработки.» Введите имя метода и перейдите к папке метода (каталог) и затем нажмите кнопку «Далее».
- Для «Тип анализа,» выбрать «пептид карта (IMS)» и в закладке «Инструмент системы» выберите инструмент «Vion IMS QTof». Нажмите «Готово».
Примечание: Метод созданного LC/HDMSE автоматически открывается на экране «Настройки метода инструмент». - На вкладке «Параметры» введите эти параметры: 3.0 кв капиллярного напряжения, источник температуры 100 ° C, 250 ° C desolvation температуры, 50 Л/ч конуса газового потока и 500 Л/ч desolvation газового потока.
- В настройках вкладку «Эксперимент» выберите «Высокой четкости MSE» и выберите «Анализ метода выполнения.» На вкладке «Параметры сканирования», введите эти параметры: низкая масса, 100; Месса, 2000; время сканирования, 400 г-жа во вкладке «CE» типа «6 V» для параметра низкой энергии и выбрать высокоэнергетических пандусом от 15 до 40 V. Убедитесь, что у «Отключить данных сокращение «проверил.
- Влить раствор 50 нг/мл лейцина энкефалины (LE), подготовленный в ацетонитриле 50% с 0.1% FA со скоростью потока 10 мкл/мин для калибровки блокировки массы во время сбора данных.
Примечание: Блокировка масса данных приобретается каждые 5 мин, с использованием той же скоростью приобретение через же область диапазона массы.
- Проанализируйте образец 10 Нм, Пхо с шипами, используя assay LC/HDMSE описанные выше путем инъекций 10 мкл образца (загружен на столбец amount является 100 фмоль для каждого стандарта пептида).
4. Настройка метода Tof-Записями для столкновения Оптимизация энергии (CE)
- Из набора данных LC/HDMSE получите время удерживания, прекурсоров и фрагмент Ион m/z для каждого Пхо пептид. Сохранить m/z и состояние заряда для наиболее распространенных прекурсоров Ион и соответствующие три наиболее распространенных фрагмент ионов.
Примечание: Пример спектров низкой энергии и высоких энергий, обычно записаны LC/HDMSE assay представлен на рисунке 2. - Используйте Оптимизация энергии (CE) столкновения в эксперименте SRM/MRM для получения наилучший сигнал для каждого пептид23.
- В программном обеспечении сбора данных нажмите на «Метод Create/анализа» и выберите «Создать приобретения и метода обработки.» Введите имя метода, перейдите к папке метода (каталог) и нажмите кнопку «Далее».
- Для «Тип анализа», выберите «Quantify.» Выбрать «Quantify Assay Tof 2D хроматографического» и нажмите «Далее». На вкладке «Инструмент системы» выберите «Vion IMS QTof» и нажмите «Готово».
Примечание: Метод созданного Tof-мно автоматически открывается на экране «Настройки метода инструмент». - На вкладке «Параметры» введите эти параметры: 3.0 кв капиллярного напряжения, источник температуры 100 ° C, 250 ° C desolvation температуры, 50 Л/ч конуса газового потока и 500 Л/ч desolvation газового потока.
- В настройках вкладку «Эксперимент» выберите «Функция таблицы» и выберите «один или более MS, МСМ или Записями функций». С помощью стрелки вниз, настроить функцию «Tof-Записями» для каждого пептид, введя три «переходы» (комбинации самых распространенных прекурсоров и три из его самых распространенных ионов фрагмент).
Примечание: В режиме Tof-МНО, высокая чувствительность достигается с помощью запланированного подход управления записями сообщений. - В редакторе функция «Tof-мно» выберите одно окно времени удержания для каждого пептида (по крайней мере 1 мин), организованы в порядке элюции пептида. В редакторе функция «Tof-мно» вставьте пептид прекурсоров m/z и продукт m/z; Выберите окно quad изоляции как «Low» (4-Да окно) для пептида прекурсоров; Выберите время фиксированная сканирования 100 мс; и выбрать значения энергии двенадцать различных столкновений в диапазоне 14-36, следующим образом: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 и 36, как показано в примере на рисунке 3.
Примечание: С описанным выше способом Tof-МНО, данных по меньшей мере 10 очков за хроматографического пика собираются для каждого перехода на каждый указанный CE. Чтобы уменьшить размер файла данных, выберите параметр «Широкий» (6-Da окно) для сигнала фрагмент иона. В таблице 2 приведены примеры значений CE оптимизирована. - Проанализируйте образец 10 Нм, Пхо с шипами, используя assay Tof-МНО, описанные выше путем инъекций 10 мкл образца (загружен на столбец amount является 100 фмоль для каждого стандарта пептида).
5. Настройка метода окончательного приобретения HS-мно пептид количественной оценки с использованием Ион мобильности разделение пептид прекурсоров
- В меню «Расследования» программного обеспечения сбора данных отображения всех 11 хроматографического трассировки, созданные для каждого CE для Каждый пептид и интегрировать пиков, используя кнопку «Включить» из панели «Обработка параметров/операций»; области высокий пик покажет лучший CE для каждого перехода.
- Визуально сравнить лучших районов пик для 3 фрагменты каждого пептида и сохранить только лучших «переход» (фрагмент Ион который производит наиболее интенсивных сигнал); Таблица 2 показывает лучшие «переходы», полученные из четырех Пхо пептиды.
- Настройка метод HS-МНО, содержащие только один фрагмент Ион за пептид. Используйте значения уху каждого прекурсора пептид из LC/HDMSE набора данных.
- Измените метод Tof-МНО, созданный в предыдущем разделе (раздел 4), выбрав функцию «HS-мно» вместо «Tof-мно» функции.
- В редакторе функция «HS-МНО», введите следующие параметры, связанные с прекурсорами: m/z, квадрупольный резолюции: низкая (4 Да), государство, значение УХУ прекурсоров и прекурсоров CCS резолюции: низкий. Для продукта Ион, введите его m/z, оптимальный столкновения энергию, выберите время сканирования 0.4 s и выберите параметр «широкий» (6 ПДР) чтобы включить все его изотопов. Пример метода окончательного приобретения HS-Записями для всех четырех пептиды представлен на рисунке 4.
- Анализировать все образцы с помощью метода HS-МНО, начиная с пустой дайджест МАБ (не шипами образец), следуют 4 реплицировать инъекции (по 10 мкл) следующих концентраций: 0.1, 1, 10 и 100 Нм Пхо пептиды.
6. Создание метода обработки для анализа набора данных HS-мно
- Создайте метод обработки для анализа набора данных HS-Записями.
- В методе анализа, созданный для метода сбора данных «HS-мно» перейдите на вкладку «Цели» и выберите «Управление компоненты.»
- В раскрывающемся меню в разделе «Тип эксперимент» выберите параметр «HS МС/МС/HS-Записями».
- Нажмите кнопку «Создать/Новая запись» и ввести следующие параметры в редакторе метода обработки: время хранения пептида (RT), состояние заряда прекурсоров, прекурсор m/z и прекурсоров дрейф время (DT). Для фрагмента Ион введите состояние m/z и заряд и укажите «XIC» след как в режиме извлечения.
- В закладке «Цель» один и тот же метод приобретения «HS-Записями», нажмите на «Сумм по умолчанию» и введите следующие значения: 0.1, 1, 10 и 100 Нм Пхо пептиды.
- Введите следующие параметры в разделе «настройки обработки/извлечения»: по умолчанию массового терпимости, 10 ppm (для m/z всех ионов фрагмента) и по умолчанию Дрифт время, 5%; Пример метода обработки пептид Пхо показан на рисунке 5.
- Для калибровки типа выбор линейной кривой с 1 / X2 весов.
- Процесс HS-Записями данных для интеграции всех хроматограммы и строить калибровочные кривые каждого Пхо пептида.
Representative Results
Отдельные последовательности шести фосфорилаза b пептид стандартов, содержащихся в Пхо пептид смеси приведены в таблице 1, наряду с их удержания раз и их наиболее распространенных прекурсоров, наблюдаемые в HDMSE эксперимент. Первым шагом в развитии пробирного управления записями сообщений (HS) высокоизбирательные является приобретение набора данных HDMSE учредить элюции раз каждой Пхо пептида, наряду с его соответствующего наиболее обильные прекурсоров и три наиболее распространенных фрагментов. Рисунок 2 показывает HDMSE спектры, приобрел для одной из Пхо пептидов (ОПТОСОЗ 6) шипами в инфликсимаб дайджест. После установления 3 лучших «переходы» (комбинации прекурсоров и фрагмент масс) для каждого пептид, Tof-мно эксперимент выполняется найти оптимальный столкновения энергию максимизировать сигналов для каждого пептид. В таблице 2 резюмируются результаты эксперимента оптимизации CE. Окончательный анализ HS-мно (см. рисунок 4) сохраняет только лучших «переход» для каждого пептида и используется для анализа всех загрязненной образцами. Примеры хроматограммы HS-МНО, созданные для 4 Пхо пептиды во всех исследованы концентрации представлены на рисунке 7. Четыре калибровочных кривых полученные за каждый следующий пептид, интеграции HS-мно пиков, подчеркнул на рисунке 7, отображаются на рисунке 8. Кроме того пик области относительной стандартное отклонение, рассчитанные на основе 4 реплицировать инъекции, резюмируется в 4 таблицы, показанные в таблице 3.
| Пептид | Пептид | Сохранение | Обязанности государств | ||||
| ID | Последовательность | время (мин) | + 1 | + 2 | + 3 | + 4 | |
| ОПТОСОЗ 1 | VLYPNDNFFEGK | 19.4 | 1442.6951 | 721.8512 | 481.5699 | 361.4292 | |
| ОПТОСОЗ 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16,0 | 1874.9065 | 937.9569 | 625.6404 | 469.4821 | |
| ОПТОСОЗ 3 | IGEEYISDLDQLRK | 18,9 | 1678.8646 | 839.9360 | 560.2931 | 420.4716 | |
| ОПТОСОЗ 4 | LLSYVDDEAFIR | 21.1 | 1440.7369 | 720.8721 | 480.9172 | 360.9397 | |
| ОПТОСОЗ 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19,7 | 1890.0080 | 945.5076 | 630.6742 | 473.2574 | |
| ОПТОСОЗ 6 | VFADYEEYVK | 17.7 | 1262.5939 | 631.8006 | 421.5362 | 316.4039 | |
Таблицы 1. Пхо пептид стандарты, содержащиеся в микс массы PREP, шипами в инфликсимаб дайджест. Пептид удержания раз и их наиболее распространенных прекурсоров (выделено жирным шрифтом) отображаются в табличном формате.
| Пептид | Пептид | Сохранение | Пептид прекурсоров | Наиболее распространенным фрагмент ионов/зарядки | Оптимальный | ||||
| ID | Последовательность | время (мин) | m/z и заряд | Дрейф время (МС) | Я | II | III | CE (V) | |
| ОПТОСОЗ 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16,0 | 625.6404 (+ 3) | 6.2 | 714.3781 (+ 1) | 807.4177 (+ 2) | 827.4621 (+ 1) | 24 | |
| ОПТОСОЗ 4 | LLSYVDDEAFIR | 21.1 | 720.8721 (+ 2) | 7.5 | 865.4050 (+ 1) | 964.4734 (+ 1) | 1214.5688 (+ 1) | 22 | |
| ОПТОСОЗ 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19,7 | 630.6742 (+ 3) | 6.3 | 642.3570 (+ 1) | 689.8391 (+ 2) | 832.4236 (+ 2) | 20 | |
| ОПТОСОЗ 6 | VFADYEEYVK | 17.7 | 631.8006 (+ 2) | 7.0 | 830.3931 (+ 1) | 945.4200 (+ 2) | 1016.4571 (+ 1) | 24 | |
Таблица 2. Результаты эксперимента оптимизации Tof-мно: три самых распространенных фрагменты каждого Пхо пептид, количественно в этом исследовании указывается, вместе с соответствующей энергии оптимизированный столкновения.
| Конц | Сумма | Пик областей ОПТОСОЗ 2 (таблица 3A) | |||||
| (Нм) | колонка (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Среднее | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 490 | 439 | 462 | 431 | 456 | 5.8 |
| 1 | 10 | 5121 | 4842 | 5198 | 4842 | 5001 | 3.7 |
| 10 | 100 | 63853 | 64279 | 66111 | 62509 | 64188 | 2.3 |
| 100 | 1000 | 612392 | 605553 | 613229 | 611004 | 610545 | 0.6 |
| Конц | Сумма | Областей ОПТОСОЗ 4 пик (таблица 3B) | |||||
| (Нм) | колонка (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Среднее | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 275 | 359 | 325 | 288 | 312 | 12.2 |
| 1 | 10 | 3559 | 3694 | 3287 | 3754 | 3574 | 5.8 |
| 10 | 100 | 45259 | 45775 | 42976 | 45548 | 44890 | 2.9 |
| 100 | 1000 | 459374 | 467927 | 436272 | 458994 | 455642 | 3.0 |
| Конц | Сумма | Пик областей ОПТОСОЗ 5 (таблица 3 c) | |||||
| (Нм) | колонка (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Среднее | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 3194 | 3243 | 3202 | 3257 | 3224 | 1.0 |
| 1 | 10 | 31464 | 31150 | 31464 | 31433 | 31378 | 0.5 |
| 10 | 100 | 313638 | 320712 | 311943 | 311943 | 314559 | 1.3 |
| 100 | 1000 | 2845736 | 2840031 | 2882006 | 2864052 | 2857956 | 0,7 |
| Конц | Сумма | Областей ОПТОСОЗ 6 пик (таблица 3D) | |||||
| (Нм) | колонка (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Среднее | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 490 | 583 | 440 | 440 | 488 | 13,8 |
| 1 | 10 | 6429 | 6429 | 6848 | 6623 | 6582 | 3.0 |
| 10 | 100 | 71295 | 70400 | 71563 | 70400 | 70915 | 0.9 |
| 100 | 1000 | 707640 | 707640 | 694461 | 729490 | 709808 | 2,0 |
Таблица 3. Таблица, содержащая пик области HS-мно хроматограммы записаны для 4 Пхо пептидов (ОПТОСОЗ 2, 4, 5 и 6) для каждой инъекции LC/MS (16 LC/MS бежит и 4 концентрации испытания).
Относительное отклонение был лучше, чем 15% для всех пептидов в диапазоне всего концентрация расследование.
Рисунок 1. Диаграмма рабочего процесса, подведение итогов трех шагов, необходимых для создания метода приобретения HS-мно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Пример HDMSE данных:
(A) низким энергетического спектра показаны Ион прекурсоров 6 ОПТОСОЗ. (B) высоких энергий фрагментации спектр же пептид, отображение Топ-3 самых распространенных фрагмент ионов (кружил) для оптимизации энергии столкновения Tof-мно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Параметры, используемые для настройки оптимизации Tof-Записями эксперимент.
Для каждого перехода были протестированы одиннадцать столкновения энергий (в диапазоне от 16 до 36 V). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Пример использования метода окончательного HS-Записями.
Некоторые параметры являются обязательными для каждого «перехода» включая пептид прекурсоров m/z, его состояние заряда и ионной подвижности дрейф время, m/z наиболее распространенных фрагмент Ион, оптимальной столкновения энергии и время приобретения МС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Параметры, используемые методом обработки для анализа набора данных HS-Записями.
Каждый пептид контролируется сингл «переходный период» описан пептид прекурсоров m/z, зарядки состояние и ожидаемое время удерживания, наряду с m/z наиболее распространенных фрагмента и его состояние заряда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Диаграмма в ионной подвижности масс-спектрометр.
В режиме приобретения HS-МНО, прекурсоров пептид, который будучи количественно отделены от других совместно eluting (помехи) пептида прекурсоров в мобильности литиевого, изолированные четырехполюсника и фрагментарный характер с фиксированной столкновения энергии в ячейка столкновения. Сигнал от ионов Пептидный фрагмент повышается, регулируя частоту толкача, и пептида количественная оценка осуществляется с использованием высокой MS-резолюции (> 30000) сигналов, производимые наиболее интенсивные Ион фрагмент каждого пептида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. HS-мно хроматограммы записаны для 4 Пхо пептидов в 4 различных концентрациях, охватывающих 3 порядков (0.1, 1, 10 и 100 Нм).
(A) ОПТОСОЗ 2 хроматограм, 4 (B) ОПТОСОЗ хроматограм, хроматограммы (C) ОПТОСОЗ 5 и 6 (D) ОПТОСОЗ хроматограммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8. Калибровочные кривые для 4 Пхо пептиды через 4 разные концентрации (0.1, 1, 10 и 100 Нм).
Таблицы в каждой кривой отображения отдельных пик областей (Y-значения) записаны для каждой инъекции, в то время как второй столбец из каждой таблицы показывает процент отклонения от ожидаемый линейный отклик. (A) ОПТОСОЗ 2 калибровки, 4 (B) ОПТОСОЗ калибровки, калибровка (C) ОПТОСОЗ 5 и 6 (D) ОПТОСОЗ калибровки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
С высоким разрешением (Rs > 20000) масс-спектрометрия регулярно используется для структурных характеристик терапевтических белков на различных платформах инструмента. В отличие от количественной оценки на основе MS белка производится обычно SRM/Записями на низком (~ 1 000 рупий) тандем квадрупольного масс-спектрометров с помощью подписи пептиды, порожденных ферментативного расщепления белков11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. как одномерные хроматографического цветоделение не удается разрешить полностью комплекс пептидных смеси производится путем ферментативного пищеварения, пептид совместное Элюирующий является обычным явлением, даже в случае одного белка дайджест. Для очень сложных белков дайджесты (например, для количественной оценки 1-100 ПМП ВДС присутствии пептид богатый фон, производимые терапевтических белков), чувствительность, точность или линейности SRM MRM пробирного могут быть затронуты помех.
SRM/MRM анализов у одномерного избирательности, полагаясь только на «уникальный» сочетание прекурсоров/фрагмент масс. По этой причине, эти анализы не в ситуациях, когда неожиданно изменяется фон пептида (например, для биофармацевтической образцов, полученных из различных очистительных процедур). Чтобы преодолеть эти ограничения, мы предлагаем здесь высокоизбирательные пробирного (HS) MRM, реализованы на Ион мобильности с поддержкой высокого разрешения квадрупольного время полета (QTOF) гибридный масс-спектрометр (для документа схемы, см. рисунок 6).
Инструмент отделяет прекурсоров пептид интерес от других совместно eluting (помехи) пептида прекурсоров в мобильности литиевого, изолирует полный изотопный конверт прекурсоров в квадрупольного и фрагменты его с фиксированной CE в ячейка столкновения. Сигнал от его наиболее распространенным Пептидный фрагмент усиливается, регулируя частоту толкателя (цель расширения), которые выборочно толкает массового регионы интереса в рейс трубки, а не всех ионов, как с полного сканирования. Пептид количественная оценка осуществляется с использованием сигналов высокой MS-резолюции (Rs ~ 30000), производимые этот фрагмент Ион. По сравнению с SRM/MRM анализов, HS-мно assay предлагает две дополнительные уровни избирательность: один обеспечивается Ион прекурсоров уровень мобильности разделения, в то время как второй обеспечивается увеличение массы резолюции TOF анализатора. Результаты принес эти избирательности улучшения видны в HS-мно хроматограммы отображены на рисунке 7, которые свободны от помех через трех порядков.
В отличие от SRM/MRM анализов, есть несколько параметров, которые могут корректироваться для оптимизации анализов HS-мно: RT окна вокруг предвестником пептида (обычно устанавливается в 0,2 мин), квадрупольного изоляции окна (4 Да), окна во время дрейфа вокруг прекурсоров (± Полувысоте пика прекурсоров из соответствующего Ион mobilogram) и резолюции МС фрагмент Иона (20 000-40 000). HS-мно анализов очень чувствительны: низкая обнаруженных для каждого Пхо пептиды составляет 1 femtomole на столбец (или 0,1 нм с точки зрения концентрация пептидный). При рассмотрении пептид МВт (см. таблицу 1 для точной MWs), сумма обнаружено на столбец порядка 1-2 стр., в то время как столбец загружается с значительно большее количество фон пептидов в дайджесте МАБ (2 мкг).
Рассматривая молекулярный вес полнометражного Пхо белка (97,2 кДа), из которого были получены шипами пептиды, assay может обнаружить 50 ppm белковых примесей в присутствии ионов высокой изобилие фон. Ниже пределов обнаружения (5-10 ppm) достижимы для ниже, молекулярным весом ВДС (10-20 кДа). Assay охватывает три порядков (как показано в калибровочных кривых на рисунке 8), что означает, что он может измерять ВДС в диапазоне 1-1000 ppm. Кроме того воспроизводимость анализов HS-МНО, показано в таблице 3, очень хорошо соответствует воспроизводимость анализов мелкомолекулярных SRM/MRM, с площади пика RSDs лучше, чем на 15%.
Мы изучили возможности Роман assay для количественного определения стандартов шипами пептида в дайджест моноклональных антител (МАБ) и продемонстрировал его чувствительность и утилита для обычно охватывают широкий динамический диапазон (по крайней мере трех порядков) При анализе HCP. Все шесть пептид стандартов были обнаружены в концентрациях, как низко как 0.1 Нм (1 femtomole загружены на Хроматографическое столбец ID 2.1-мм) в присутствии высоких изобилие пептид фон (2 мкг МАБ дайджест загружен на-столбца). Путем включения целевых HRMS и ионной подвижности прекурсоров разделения, HS-мно assay имеет большой потенциал для стать быстрый, высок объём пробирного контроля для нескольких ВДС через несколько серий биофармацевтики.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками корпорации воды, которая является производителем ряда реагентов и инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Лесли Malouin и Тони Catlin от вод корпорации за подготовку рисунок 6 рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
| Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
| Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
| Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
| 2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
| Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
| LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
| Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
| Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50) | Eppendorf | 22431102 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
| Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |
References
- Doneanu, C. E., et al. Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry. MAbs. 4, 24-44 (2012).
- Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry. Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).
- Zhang, Q., et al. Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6, 659-670 (2014).
- Farrell, A., et al. Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E). Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).
- Zhang, Q., et al. Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification. Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).
- Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise. Anal Biochem. , 1-6 (2014).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis. MAbs. 7, 1128-1137 (2015).
- Giles, K., et al. Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).
- Anderson, V., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).
- Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).
- Picotti, P., et al. High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes. Nat Methods. 7, 43-46 (2010).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. (53), (2011).
- Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry. Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification. J Vis Exp. (102), (2015).
- Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate. Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).
- Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics. Cell. 138, 795-806 (2009).
- Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy. Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring. Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).
- Bao, Y., et al. Detection and correction of interference in SRM analysis. Methods. 61, 299-303 (2013).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Mbasu, R. J., et al. Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis. Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).
