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Developmental Biology

रूट और हाइपोकॉटल विकास के दीर्घकालिक कन्फोकल इमेजिंग के लिए एक सरल चैंबर

Published: May 17, 2017 doi: 10.3791/55331

Summary

यहां प्रस्तुत किया गया है उच्च-संकल्प के समय-अंतराल के समय-अंतराल के इमेजिंग के लिए एक साधारण तकनीक है जो उच्च संख्यात्मक-एपर्चर के उद्देश्यों और प्रतिफल माध्यम के रूप में प्रतिफ्लोरोएडैलेन का उपयोग करके 3 दिनों तक रूट और हाइपोकॉटीयल विकास के लिए है।

Abstract

पौधों के विकास के कई पहलू, जैसे कि पार्श्व रूट मोर्फोजिनेसिस, कई दिनों के समय काल में होते हैं। अंतर्निहित सेलुलर और सबसेल्युलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, उच्च संकल्प समय-व्यतीत माइक्रोस्कोपी रणनीतियों, जो शारीरिक स्थितियों को संरक्षित करते हैं, आवश्यक हैं। पौधे के ऊतकों में निरंतर गैसीय एक्सचेंज के साथ पर्याप्त पोषक तत्व और पानी की आपूर्ति होनी चाहिए, लेकिन, जब डूबे हुए और एक कंसलिप के नीचे स्थिर हो, तो वे अनॉक्सिया के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील होते हैं। सफलतापूर्वक काम करने वाली एक रणनीति ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की लगातार आपूर्ति को बनाए रखने के लिए एक छिड़काव प्रणाली का उपयोग है। हालांकि, ऐसी व्यवस्था जटिल हो सकती है, बोझिल होती है, और विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है। यहाँ प्रस्तुत एक विसर्जन माध्यम के रूप में प्रतिफ्लोरोडास्केलिन का उपयोग कर एक सरल इमेजिंग सिस्टम के लिए एक वैकल्पिक रणनीति है। इस प्रणाली को स्थापित करना आसान है, कम से कम उपकरण की आवश्यकता होती है, और आसानी से एक माइक्रोस्कोप मंच पर माउंट किया जाता है, जिससे कई इमेजिंग कक्षों की स्थापना की जाती है और समान रूप से चित्रित किया जाता है।allel। इस प्रणाली में, बाद के रूट विकास दर पहले दो दिनों के लिए अगर प्लेटों पर मानक शर्तों के तहत विकास दर से अप्रभेद्य होते हैं, और कम से कम एक और दिन के लिए पार्श्व की दर कम हो जाती है। प्लांट के ऊतकों को एक अगर स्लैब के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की जाती है जो कि औषधीय यौगिकों की एक श्रृंखला को संचालित करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। सिस्टम की स्थापना रूटल रूट डेवलपमेंट पर नजर रखने के लिए की गई थी, लेकिन छवि को अन्य पौध अंगों जैसे हाइपोकोटील और प्राथमिक जड़ों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है।

Introduction

पौधे के विकास के अधीन सेलुलर और सबसेल्युलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, उच्च-रिज़ॉल्यूशन दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग रणनीतियों की बढ़ती मांग है। इस तरह के इमेजिंग प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण चुनौती शारीरिक स्थिति का रखरखाव है जिसमें पर्याप्त गैसीय आदान-प्रदान, पानी और पोषक तत्व 1 , 2 , 3 की आपूर्ति शामिल है। इष्टतम ऑप्टिकल रिज्यूशन के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चरों के साथ उद्देश्यों का उपयोग करने के लिए, नमूने कंसलिप के निकट के निकट और उन्मुख समानांतर में स्थित होने चाहिए। इमेजिंग के दौरान एक्स, वाई, और जेड दिशाओं में आंदोलन कम से कम होना चाहिए।

जबकि अक्सर छोटी या छोटी अवधि के इमेजिंग के लिए जल या जलीय घोल में रोपाई की जाती है, पानी में सीओ 2 और ओ 2 (1.54 मिलीग्राम / एमएल और 0.04 मिलीग्राम / एमएल, क्रमशः 20 डिग्री सेल्सियस, 0.1 एमपीए) भंग करने के लिए कम क्षमता है 4 , किसने बनायायह विस्तारित समय चूक प्रयोगों के लिए अनुपयुक्त है। छिड़काव प्रणाली जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के निरंतर स्तर को बनाए रखती है, इस समस्या का एक समाधान है और दोनों confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) 1 , 2 , 3 और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएम) 5 के लिए विकसित किया गया है। रूट कैप 2 और रूट ऐरे 3 जैसी सिस्टम विशेष रूप से विकासशील जड़ों की समय चूक इमेजिंग के लिए तैयार किए गए हैं और कस्टम-बिल्ड बहु-नमूना डिवाइस में बीज अंकुरित करना शामिल हैं। ये व्यवस्था कम से कम यांत्रिक उलझन सुनिश्चित करती है और कई पौधों के समानांतर विश्लेषण के लिए तैयार की जाती हैं, लेकिन subcellular संरचनाओं के इमेजिंग के लिए अनुकूलित नहीं हैं। काल्डर और सहकर्मियों ने एक अधिक जटिल छिड़काव-आधारित इमेजिंग चैम्बर तैयार किया है जो सबसेल्युलर संरचनाओं के इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया है जिसमें नमूना एक जाल द्वारा स्थिति में आयोजित किया जाता हैउच्च बढ़ाई विसर्जन लेंस 1 के उपयोग की अनुमति देने के लिए

यहाँ प्रस्तुत एक समस्या है, जो इस समस्या का सरल समाधान है जो छिड़काव प्रणालियों पर आधारित नहीं है, लेकिन पेरफ्लोरोएडेलिन (पीएफडी) का उपयोग करता है, जो एक पेफ्लुओरकार्बन है जो हालिया में अरबीडॉप्सिस इमेजिंग 6 , 7 , 8 के लिए बढ़ते माध्यम के रूप में लोकप्रियता प्राप्त की है। इस तरह के अनुप्रयोगों में पीएफडी की उच्च क्षमता सीओ 2 और ओ 2 (1. 9 जी / एमएल पीएफडी में पीएफडी में 0.04 मिलीग्राम / एमएल पानी की तुलना में) भंग करने के लिए 9 , विसर्जित ऊतक द्वारा गैसीय विनिमय की अनुमति देता है। इसके अलावा, पीएफडी गैर फ्लोरोसेंट है और इसका अपवर्तक सूचकांक (1.313) पानी (1.333) के साथ तुलनीय है और हवा (1.000) 6 की तुलना में साइटोसोल (~ 1.4) के करीब है। विभिन्न प्रकार के पौधों और पौधों के पौधों पर पेफ्लुओरकार्बन के कम शारीरिक प्रभाव पड़ता हैपीएफडी में डूबने और पानी के 10 के साथ आपूर्ति की कम से कम दो दिनों के लिए सामान्य विकास और विकास का प्रदर्शन करते समय मूली के बीज अंकुरित होने पर अंक 6 अरबीडोपिस बीज 6 अंकुरण के लिए इसी तरह के अवलोकन किए गए हैं। घुसपैठ के बाद अरबीडोपिस के पत्ते के ऊतकों में पीएफडी के वितरण को प्रत्यक्ष रूप से चित्रित करने के लिए उत्तेजित रमन बिखरने के आधार पर, लिटिलजोन और उनके सहयोगियों ने निष्कर्ष निकाला कि पीएफडी जीवित कोशिकाओं 8 द्वारा संभवतः नहीं उठाया जाता है। पीएफडी को पहले से मुख्य रूप से इमेजियल टिश्यू में इस्तेमाल किया गया है, जहां यह इमेजिंग गहराई को बढ़ाता है क्योंकि यह कम सतह तनाव 6 के कारण आसानी से हवा में घुसपैठ कर सकता है। यहां, पीएफडी को दीर्घकालिक जड़ों के विकास के दीर्घकालिक इन्फोकल इमेजिंग के लिए अपनाया गया है। इस विन्यास में, एक या एक से अधिक पौधों को वृक्षारोपण माध्यम के एक स्लैब पर रखा जाता है जो पीएफ़डी में विसर्जित होता है। पीएफडी जी की अनुमति देता हैइमेजिंग चैम्बर में अस्तिष्क विनिमय, अनॉक्सिआ को रोकने पीएफडी अत्यधिक अस्थिर है, इसलिए इसे पॉली (डाईमेथिलसिलोक्सैन) गम की गैसकेट द्वारा बनाए रखा जाता है जिसमें उच्च गैस पारगम्यता भी होती है (1.5 x 10-12 pmol m -1 s -1 1 -1 -1 सीओ 2 के लिए ) पोषक तत्वों और पानी की आपूर्ति की जाती है अगर मध्यम के स्लैब द्वारा आपूर्ति की जाती है। इसी समय, इस अगर स्लैब धीरे से कवरलिप के खिलाफ जड़ को दबा देता है, इस तरह इमेजिंग चैंबर में अपनी रिश्तेदार स्थिति तय करता है और उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले पानी के विसर्जन लेंस का उपयोग करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, अगर स्लैब का इस्तेमाल औषधि के कई प्रकार के उपचारों के लिए किया जा सकता है, जिसमें डेक्सैमाथासोन, ऑरिज़लीन, और आइसॉक्सैबन शामिल हैं। इमेजिंग कक्षों को न्यूनतम उपकरण के उपयोग से मानक माइक्रोस्कोपी स्लाइड्स से बड़ी संख्या में इकठ्ठा किया जा सकता है। इमेजिंग कक्षों को विकसित और पार्श्व रूट विकास का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन वे प्राथमिक बीजों के इमेजिंग के लिए अनुकूल हैं जैसे मुख्य रूट टिप्स औरhypocotyls।

Protocol

1. चैंबर बनाना

  1. कांच के कटर का इस्तेमाल करना, 1 मिमी मोटी सूक्ष्मदर्शी स्लाइड के अंत से 3 मिमी चौड़ी पट्टी काट कर। एक साइनोस्रीलेट सुपर-गोंद या डबल-साइड टेप का प्रयोग करना, ये ग्लास एक दूसरे सूक्ष्मदर्शी स्लाइड की चौड़ाई ( चित्रा 1 ए ) की चौड़ाई के अलावा लगभग 45 मिलीमीटर का छिद्र करता है। एक स्लाइडर प्रति कक्ष की आवश्यकता है, साथ ही अतिरिक्त स्लाइड्स को अगर स्लैब्स डालना है (एक स्लाइड से 2-3 एज स्लैब उत्पन्न होंगे)। स्लाइड का पुन: उपयोग किया जा सकता है
  2. ग्लास स्ट्रिप्स के बीच, गैस-पारगम्य पाली (डाईमेथाइलसिलोक्सन) गम से बाहर की समान ऊंचाई के एक गैस्केट का फैशन। स्लाइड ( चित्रा 1 बी ) में पाली (डाईमेथाइलसिलोक्सन) गम की एक गेंद रखें, 100% पूर्ण इथेनॉल की एक छोटी मात्रा के साथ एक दूसरी स्लाइड गीला करें, और दूसरी स्लाइड के साथ पॉली (डाईमेथाइलसिलोक्सैन) गम बॉल को समतल तक पहुंचें, जब तक यह ऊंचाई तक नहीं पहुंच जाता ग्लास स्ट्रिप्स ( चित्रा -1 सी ) का
    1. यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त पाली ट्रिम करेंथाल्सिलॉक्सेनैन) एक रेजर ब्लेड के साथ गम और दोहराने सपाट।
  3. पूर्णतया इथेनॉल में एक उपयुक्त कटर या रेज़र ब्लेड का प्रयोग करके, पॉली (डाईमेथिलसिलोक्सैन) गम के आंतरिक भाग को गुहा बनाने के लिए निकालें जो बाद में अंकुर और अगर स्लैब ( चित्रा 1 डी ) रखेगी।
  4. लगभग 2 मिमी ( चित्रा 1 ई ) की अंतिम दीवार मोटाई के साथ एक गैस्केट बनाने के लिए एक रेजर ब्लेड से जेल को सावधानी से ट्रिम करें। पाली (डाइमिथाइलसिलाक्सन) बाधा के माध्यम से गैसों की पारगम्यता 50 माइक्रोन 11 से ऊपर मोटाई से स्वतंत्र है।

2. ग्रोथ मध्यम के अग्रस्तरीय स्लैब बनाना

  1. दो गिलास स्ट्रिप्स के साथ एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर, एक कसलीप (22 मिमी x 50 मिमी) रखें ताकि यह दोनों ग्लास स्ट्रिप्स पर निर्भर हो।
  2. पिपेट ने अर्ध-ताकत में पिघलाया मुरैशिगे और स्कोउड ग्रोथ माध्यम युक्त 1% वाइड / वी सुक्रोज और 1.5% वाय / वी अदर (½ एमएस) जिसके परिणामस्वरूप अंतरिक्ष मेंजब तक पूरी तरह से भरा हुआ (लगभग 1 एमएल कुल मात्रा) coverslip नीचे और जब तक सेट सेट है (लगभग 5 मिनट)।
    नोट: स्लैब डाले जाने से पहले तरल माध्यम के लिए उचित सांद्रता जोड़कर औषधीय यौगिकों को अगर स्लैब के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है। यह सफलतापूर्वक 12 , आइसोसेबेन, 2,6-डाइक्लोरोबेंज़ोनिट्रील (डीसीबी), ऑरज़ेलिन, और लेट्रुंकुल्कन बी के लिए डीएक्सएमेथासोन के लिए परीक्षण किया गया था।

3 चैंबर सेटअप समाप्त करना

  1. एक ट्यूब 7 में पीएफडी की एक छोटी मात्रा को मिलाकर हवा को पीएफडी संतुलित करना जेल गैस्केट के ठीक से एक छोटी राशि (लगभग 200 μL) हवा-समतल पीएफडी को जोड़ें, लेकिन कक्ष को पूरी तरह से भरना न दें। यह पीएफडी अगर स्लैब के तहत हवाई बुलबुले के फँसाने से बचने में मदद करेगा क्योंकि इसे कक्ष में रखा जाता है
  2. एसर स्लैब से कंसलिप को निकालें (ऊपर की तरफ 2.2 पर) और एक रेज़र ब्लेड का उपयोग करें, जिसमें से एक हिस्से को काट लेंआकार और आकार आकार फिर इसे जेल गैसकेट ( चित्रा 1 एफ ) के कूच में रखें। चारों ओर चारों ओर गैस्केट में 2-4 मिमी का अंतर होना चाहिए
  3. कक्ष को पूरी तरह से हवा-समसामयिक पीएफडी भरें।
  4. पीएफ़डी ( चित्रा 1 जी ) में तैरते हुए, सीटालडों और हाइपोकॉटील के किनारे पर लटका हुआ किनारों पर एक या अधिक थैलियाना पौधों (2-3 दिनों से अधिक इमेजिंग के लिए इमेजिंग के लिए) रखें।
  5. बीज प्राप्त करने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ बीज बाँध, 1% सूक्रोज और 0.8% अगर के साथ पूरक 1/2 एमएस माध्यम पर संयंत्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 दिनों के लिए स्तरीय, और खड़ी उन्मुख प्लेटों पर 22 डिग्री सेल्सियस पर एक 16 एच प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे शासन पार्श्व जड़ों की इमेजिंग के लिए, इमेजिंग कक्षों को स्थानांतरित करने से पहले 7-10 दिनों के लिए पौधों को बढ़ाना।
  6. कक्ष को बंद करने के लिए, उद्देश्य के प्रकाशिकी से मेल खाए गए एक कवरलिप को लागू करें, धीरे-धीरे इसे एक गिलास सूक्ष्मदर्शी स्लाइड के किनारे तक दबाकर कवरलिप तक स्लाइड करेंग्लास स्ट्रिप्स ( चित्रा 1 एच ) दोनों पर निर्भर करता है।
  7. 1.25 सेमी चौड़े माइक्रोप्रोअरी टेप कट की स्ट्रिप्स के साथ प्रत्येक छोर पर अर्ध-लंबाई के अनुसार कटौती करें, अगर वांछित ( चित्रा 1I )। इमेजिंग से पहले नमूना लगभग 30 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें। यह इमेजिंग के दौरान नमूना आंदोलन को कम करता है।
  8. विकास के लिए एक नियंत्रित सब्सट्रेट बनाए रखने के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग करना। 20 एक्स / 0.7 एनए या 63 एक्स / 1.2 एनएएस CS2 उद्देश्यों का उपयोग करें

Representative Results

इमेजिंग कक्षों में शारीरिक जड़ें शारीरिक दर पर बढ़ती हैं

इमेजिंग कक्षों में पौधों की पार्श्व की जड़ लंबाई प्रति घंटा अंतराल ( चित्रा 2 ए , बाएं, मूवी 1, एन = 23) में मापा गया था और विकास दर की तुलना समान पेटी प्लेटों पर बढ़ी हुई पार्श्व जड़ों की तुलना में की जाती थी, जो कि समान-समन्वित माध्यम ( चित्रा 2 ए , दायें, मूवी 2, एन = 23)। विकास की गति और विस्तार 13 के तेजी से लंबे क्षेत्र के कारण जड़ की लंबाई लंबाई के साथ, विकास दर एक तय करने वाला कारक है। इसलिए, इमेजिंग चैम्बर और एगर प्लेट दोनों में विभिन्न प्रारंभिक लंबाई (50 माइक्रोग्राम से लेकर 1150 माइक्रोन तक) की जड़ों का प्रतिनिधित्व करने के लिए पार्श्व जड़ों का सेट चुना गया था। प्रयोग की शुरुआत में पार्श्व की औसत लंबाईप्रत्येक सेट (क्रमशः इमेजिंग कक्षों और प्लेटों के लिए 43 9 और 442 माइक्रोन) में समान था। 27 घंटे के विश्लेषण समय अंतराल में, पार्श्व की जड़ की वृद्धि लगभग इमेजिंग कक्षों और प्लेटों में, प्लेटों पर 52 माइक्रोग्राम / प्रति घंटे (आर 2 = 0.9 9 7 ) और इमेजिंग कक्षों में 51 माइक्रोग्राम / एच की औसत वृद्धि दर के साथ थी। आर 2 = 0.9 9 3 ) ( चित्रा 2 बी )। अलग-अलग पार्श्व की जड़ों की वृद्धि दर जहां प्लेटों और इमेजिंग कक्षों ( चित्रा 2 सी ) में दोनों बेहद परिवर्तनीय हैं, जिसमें इमेजिंग कक्षों में 17 माइक्रोग्राम / एच से 82 माइक्रोग्राम / एच और प्लेटों पर 13 माइक्रोग्राम / एच से 87 माइक्रोग्राम / एच है। हालांकि विकास दर आम तौर पर जड़ की लंबाई के साथ बढ़ती जाती है, फिर भी विकास दर समान लंबाई की जड़ों के बीच काफी भिन्न होती है, लेकिन विचरण इमेजिंग कक्षों और प्लेटों पर समान था।

पार्श्व जड़ें इमेजिंग कक्षों में फैली हुई हैं और हाय का उपयोग करके इमेजेट किया जा सकता हैग संख्यात्मक-एपर्चर उद्देश्य

प्लाज्मा-झिल्ली मार्कर एनपीएसएन 12-वाईएफपी 14 को सह-अभिव्यक्त करते हुए पार्श्व जड़ और इमेजिंग चेंबर में सेल प्रसार के दौरान माइक्रोट्यूब्यूले मार्कर यूबीक्यू 1 :: एमआरएफपी-ट्यूबलिन बीटा 6 (आरएफपी-टीबी 6) 15 सीएमएलएम द्वारा 1 एच अंतराल पर चित्रित किया गया। ( चित्रा 2 डी , मूवी 3)। इन कक्षों में, पार्श्व की जड़ों एक्स, वाई और जेड अक्षरों पर अपनी स्थिति में अत्यधिक स्थिर थी, जिससे कई घंटों से निरंतर समय-विलंब कबूल के ढेर के अधिग्रहण की अनुमति मिलती है। प्रीस्टोफेज बैंड ( चित्रा 2 डी , हरे तीर), मैटोटिक स्पिंडल ( चित्रा 2 डी , सफेद तीर), और फ्रैगमोप्लास्ट ( चित्रा 2 डी , नीला तीर) के गठन से स्पष्ट रूप से मर्सिस्टमेटिक कोशिका लगातार बढ़ रही हैं। पेट्री प्लेटों पर पौधों के साथ,इमेजिंग कक्षों में पूरी तरह से लम्बी रूट कोशिकाओं ने रूट चेयर ( चित्रा 2 ए , चित्रा 2 डी , एरो हेड) की शुरुआत की, और इमेजिंग कक्षों में अपेक्षित विकास के रूप में आगे बढ़ने का संकेत दिया। विस्तृत फ़ील्ड ऑफ़ व्यू प्रदान करने के लिए, चित्र 2 डी में चित्र 20x / 0.7 एनए उद्देश्य से प्राप्त किए गए थे। उच्च संख्यात्मक-एपर्चर 63x / 1.2 एनए पानी-विसर्जन उद्देश्य ( चित्रा 2 ई ) का उपयोग करके पार्श्व जड़ों की उच्च संकल्प छवियां प्राप्त करना भी संभव था।

इमेजिंग चेंबर्स में तीन दिन तक पार्श्व मुकाबले की वृद्धि निरंतर होती है।

इमेजिंग कक्षों को भौतिक दरों में पार्श्व की मूल वृद्धि का समर्थन करने के लिए, इमेजिंग कक्षों (एन = 27) में पार्श्व की जड़ की लंबाई और प्लेटों (एन = 33) में लंबे समय तक 0 एच, 24 घंटे, 48 घंटे, जड़ों choसेन 200 हर्ट्ज से कम 0 घंटे था, इमेजिंग कक्षों में 117 माइक्रोन की औसत पार्श्व रूट लंबाई और प्लेटों पर 121 माइक्रोन थे। चूंकि छोटी जड़ें औसत पर अधिक धीरे-धीरे बढ़ती हैं ( चित्रा 2 सी ), वे अगर स्लैब के किनारे पर कम हो जाती हैं, और छवि के लिए आसान होती थी। सभी पार्श्व जड़ों की औसत वृद्धि पहले 48 घ ( चित्रा 3 ए ) में पेट्री प्लेटों की तुलना में इमेजिंग कक्षों में काफी भिन्न नहीं थी। हालांकि, औसत वृद्धि 48 घ और 72 घ ( चित्रा 3 ए ) के बीच काफी कम हो गई थी। हालांकि 48 घंटे के बाद इमेजिंग कक्षों में वृद्धि दर आम तौर पर धीमी होती है, व्यक्तियों के बीच विकास दर अत्यधिक चर ( चित्रा 3 बी , 3 सी ) बनी रहती है, जिसका अर्थ है कि पार्श्व जड़ों का एक बड़ा सबसेट है जो प्लेटों और कक्षों में तुलनात्मक दर पर बढ़ता है पूर्ण 72 घंटे की विकास अवधि 33 में से 23 पार्श्व जड़ों की वृद्धि हुईप्लेटों (69.7%) पर लंबाई लंबाई के एक मानक विचलन के भीतर 72 घंटे (927 और 3,163 सुक्ष्ममापी, चित्रा 3 बी , लाल के बीच) तक पहुंचने के लिए। इमेजिंग कक्षों में से 27 में से 10 (37.0%) पार्श्व जड़ें इस अंतराल के भीतर एक लंबाई तक पहुंच ( चित्रा 3 बी , लाल)।

इमेजिंग कक्षों को आसानी से पुराने पार्श्व जड़ों, प्राथमिक जड़ों और हाइपोकॉटीज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है

मूल इमेजिंग चेंबर डिजाइन की सीमाओं में से एक यह है कि जब कठोर अगर स्लैब ने कुछ यांत्रिक प्रतिरोध प्रदान किए थे, तो गुरुत्वाकर्षण से बढ़ते जड़ें अंततः अगर स्लैब में घुस गईं, जिसके परिणामस्वरूप छवि गुणवत्ता ( चित्रा 4 बी ) और उच्च एनए की काम दूरी लेंस, यहां तक ​​कि अपेक्षाकृत लंबा काम दूरी (0.3 मिमी) 63x / 1.3 एनए CS2 उद्देश्य। युवा पार्श्व की जड़ें पत्थरों से युक्त होती हैंगुरुत्वाकर्षण के लिए आवश्यक कोलममेला कोशिकाओं 17 इसलिए उन्होंने शुरू में इमेजिंग कक्षों में आच्छादन के लिए समांतर ( चित्रा 2 ई ) बढ़ दिया। जैसे-जैसे वे लंबे होते हैं और कोलुमेला और स्टैटोलिथ के रूप में होते हैं, पार्श्व जड़ें सकारात्मक गुरुत्वाकर्षण को बढ़ाते हुए दिखाते हैं, जबकि प्राथमिक जड़ें अंकुरण से एक मजबूत गुरुत्वाकर्षण प्रतिक्रिया दर्शाती हैं। यह कुछ घंटों तक सीमित है, जिस पर प्राथमिक जड़ों को चित्रित किया जा सकता है और यह पार्श्व की जड़ों की शुरुआत-लंबाई को गंभीर रूप से सीमित करता है जिसे 48 घंटे या उससे अधिक के लिए लगातार इमेज किया जा सकता है। इस सीमा को पार करने के लिए, चेंबर को संशोधित किया गया था कि विकास सेलुलोसिक सेलोफ़ेन झिल्ली द्वारा कवरलिप के समानांतर बनाए रखा जाता है जो एगर स्लैब ( चित्रा 4 ए ) की सतह पर प्रवेश अवरोध के रूप में कार्य करता है। 1.5% अगर स्लैब का उपयोग करने के शुरुआती प्रयासों ने पहले 24 घंटे के भीतर रूट की वृद्धि को कम कर दिया, शायद यांत्रिक तनाव के कारण। स्लैब में लोअर अगर सांद्रता का परीक्षण किया गया थाडी यह पाया गया कि कक्षों में 0.8% अगर और सेलूलोज़ फिल्म वाले स्लैब के साथ, युवा पार्श्व की जड़ विकास दर पहले 48 घंटे के लिए पारंपरिक कक्षों में वृद्धि दर से भिन्न नहीं थी। 0-24 एच के लिए, सेलूलोज चैंबर और पारंपरिक कक्षों में रूट विकास क्रमशः 242 माइक्रोग्राम और 262 माइक्रोन होता है (पी = 0.78 छात्र टी-टेस्ट) और 24-48 घंटे के लिए 330 माइक्रोन और 355 माइक्रोन 1 क्रमशः (पी = 0.67 विद्यार्थी का t- परीक्षण); N = 12 और n = 11, क्रमशः। इस व्यवस्था ने पार्श्व की जड़ों को झालर से दूर बढ़ने से रोकने की कोशिश की, और अगर जड़ से 48 घंटे ( चित्रा 4 सी ) तक इमेजिंग की अनुमति दी।

इमेजिंग कक्षों को जड़ों के अलावा अन्य अंगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या नहीं, यह परीक्षण करने के लिए, एबिडॉप्सिस हाइपोकोटिल्स को चुना गया था। पारंपरिक इमेजिंग चैम्बर में, हाइपोकोटिल्स मूल रूप से जड़ों की तुलना में अधिक मोटा है, सबसे ऊपरी सीआईएसएल को कवरलेट के खिलाफ निचोड़ा गया, जिससे विरूपण हो गया। एक वैकल्पिक डिजाइन इसलिए गुहा स्लाइड का उपयोग करके विकसित किया गया था जिसमें उनके केंद्र में एक अंडाकार अवसाद होता है ( चित्रा 4 डी )। इस विन्यास में, अगर की एक 1 मिमी मोटी स्लैब (2.2 ऊपर के रूप में तैयार) स्लाइड के गुहा ( चित्रा 4 डी ) में कुछ मिमी द्वारा फैला हुआ एक छोर के साथ स्थित था। हाइपोकोटिल्स स्लाइड में गुहा के ऊपर स्थित थे जबकि जड़ क्षैतिज भाग के ऊपर स्थित था। इससे यह सुनिश्चित हुआ कि अंकुर रूट में अंतरिक्ष में तय किया गया था, लेकिन हाइपोकॉटीयल कुचल नहीं था। जबकि प्लेटों की तुलना में प्लेटों की तुलना में विकास दर व्यवस्थित नहीं थी, इमेजिंग चैंबर में हाइपोकोटिल्स ने हाइपोकॉटील ( चित्रा 4 ई , 4 एफ ) 16 को पलायन करने वाले अनुदैर्ध्य विकास की अच्छी तरह से वर्णित लहर का प्रदर्शन किया।

आकृति 1 चित्रा 1 : एक इमेजिंग कक्ष को इकट्ठा करना सभी विवरण टेक्स्ट में वर्णित हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : पार्श्व जड़ें इमेजिंग कक्षों में शारीरिक परिस्थितियों में बढ़ती हैं। ( ) अरबिडोप्सिस इमेजिंग चेंबर (बाएं) में और 25 घंटे (लगातार प्रकाश, क्षैतिज ऊष्मायन, एक साथ इमेजिंग) पर एक पार्श्व (दाएं) में पार्श्व रूट विकास। स्केल बार = 200 माइक्रोन ( बी ) पार्श्व जड़ों की लंबाई 27 घंटे से अधिक (1 एच अंतराल में मापा) दिखा रहा है, पार्श्व जड़ों की ( ) में दिखाया गया है। individभूरे रंग में रखी गई मूल जड़ें (प्लेटों और इमेजिंग कक्षों के लिए एन = 23), लाल चक्कर के रूप में औसत लंबाई त्रुटि बार = 1 एसडी लाल रेखा औसत लंबाई के माध्यम से रैखिक फिट है। ( सी ) प्लॉट अपनी प्रारंभिक लंबाई के सापेक्ष ( बी ) में दिखाए गए सभी पार्श्व जड़ों के लिए औसत वृद्धि दर दिखा रहा है। ( डी ) एनपीएसएन 12-वाईएफपी और आरएफपी-टीयूबी 6 को लगातार समय बिंदुओं पर व्यक्त करते हुए पार्श्व जड़ों से प्राप्त 3 डी कन्फोकल स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमान। इनसेट: बॉक्सिंग क्षेत्र की बढ़ाई ग्रीन तीर: प्रीप्रोफस बैंड; सफेद तीर: मैटोटिक स्पिंडल; नीले तीर: phragmoplasts; Arrowheads: रूट बाल। ( ) उच्च संकल्प छवियों के अधिकतम तीव्रता के अनुमानों ( डी ) में 63x / 1.2 एनए उद्देश्य और Nyquist नमूनाकरण (पिक्सेल आयाम 77 एनएम x 77 एनएम) 0 एच और 16 में उपयोग में ट्रांसजेनिक लाइन के एक युवा पार्श्व रूट से प्राप्त की ज; तारों प्रत्येक समय बिंदु पर समान कोशिकाओं की खोज; तीर उस कक्ष को दर्शाता है जो 0h और 16 h के बीच विभाजित करता है।स्केल बार = 50 माइक्रोन (एसी); 20 माइक्रोन (ई) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 : इमेजिंग कक्षों में दीर्घकालिक रूट रूट विकास ( ) प्लेट्स की तुलना में इमेजिंग कक्षों में लगातार तीन 24 एच अंतराल में औसत पूर्ण रूट विकास दिखा रहा है। Ns p> 0.05 इंगित करता है; *** p <0.001 (छात्र टी-परीक्षण) इंगित करता है एन = 33 (प्लेट्स) और एन = 27 (इमेजिंग चेंबर) ( बी ) (ए) में इस्तेमाल की गई सभी जड़ों पर लगातार समय बिंदु पर पार्श्व की जड़ लंबाई दिखाए जाने वाले प्लॉट। लाल: प्लेटों (927 और 3163 सुक्ष्ममापी के बीच) में विकसित सभी पार्श्व जड़ों के मतलब के 1 एसडी के भीतर अंतिम लंबाई के साथ सभी पार्श्व जड़ों। ( सी ) में अधिकतमपार्श्व जड़ों में प्लाज्मा-झिल्ली मार्कर NPSN12-YFP के प्रतिनिधि 3 डी कन्फोकल स्टैक के घनत्व अनुमानों को 72 घंटों से लगातार समय पर हासिल किया गया। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : इमेजिंग कक्षों को अन्य पौधों के अंगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ( - सी ) प्राथमिक जड़ों के लिए इमेजिंग चैंबर एडेप्शन। ( ) इमेजिंग चेंबर डिजाइन के योजनाबद्ध यह दो संशोधनों के अलावा मानक डिजाइन ( चित्रा 1 ) के समान है: एमएस मध्यम स्लैब में 1.5% अगर की बजाय 0.8% अगर की होती है, और एक सेलूलोज़ फिल्म (लाल) विकास को रोकने के लिए अगर और पौधे के बीच रखा जाता हैअगर में ( बी ) XY (शीर्ष) और XZ (नीचे) प्लाज्मा-झिल्ली मार्कर NPSN12-YFP के प्रतिनिधि 3 डी कन्फोकल स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमानों को 7 दिन के पुराने अंकुर के प्राथमिक रूट में 0 घंटे और 48 घंटे में एक पारंपरिक इमेजिंग में चित्रित किया गया है। चैम्बर। ध्यान दें कि रूट इसकी गुरुत्वाकर्षण प्रतिक्रिया के कारण अगर में बढ़ता है। ( सी ) XY (शीर्ष) और XZ (नीचे) प्लाज्मा-झिल्ली मार्कर NPSN12-YFP के प्रतिनिधि 3 डी कन्फोकल स्टैक की अधिकतम तीव्रता के अनुमानों को इमेजिंग में 0 घंटे और 48 घंटे में संकलित सात-दिवसीय बीजों की प्राथमिक जड़ में सेलूलोज़ फिल्म के साथ चैंबर आवेदन के पहले, सेलूलोज़ फिल्म को 80% इथेनॉल में निष्फल कर दिया गया था और तरल ½ एमएस मध्यम में भिगोया गया था। ध्यान दें कि जार में गुरुत्वाकर्षण के विकास में रोका जा सकता है। ( डी - एफ ) हाइपोकोटाइल के लिए इमेजिंग चैंबर एडेप्शन। ( डी ) योजनाबद्ध हाइपोकोटिक इमेजिंग चैम्बर डिज़ाइन एक पाली (डाईमेथिलसिलोक्सैन) गम गैस्कट (ग्रे) मैनुअल हैदो ग्लास स्ट्रिप्स (पीला) के बीच एक गुहा स्लाइड पर लाल। यहां तक ​​कि मोटाई (बेज) के 1.5% अगर का स्लैब स्लाइड पर रखा जाता है, आंशिक रूप से गुहा में पहुंचता है। चैम्बर पीएफडी (नीला) से भरा है। रोटी को अगर स्लैब पर रखा जाता है ताकि हाउकोटीली गुहा में अगर स्लैब के नीचे-ढलान वाले क्षेत्र में रहती है, जबकि जड़ अगर की क्षैतिज भाग पर स्थित होता है। कक्ष एक कंसलिप के साथ बंद है ( ) प्लाज्मा-झिल्ली मार्कर NPSN12-YFP के प्रतिनिधि 3 डी कन्फोकल स्टैक की अधिकतम तीव्रता के अनुमानों को दो-दिवसीय वृक्ष के एक हाइपोकोटील में 48 घंटे से लगातार समय बिंदु पर चित्रित किया गया है। ( एफ ) ( ) में दिखाए गए हाइपोकॉटल के एपिकल अक्ष (ई में दिखाए गए धुरी के साथ 0 घ पर रिश्तेदार स्थितियां) के आधार पर अलग-अलग कोशिकाओं के लगातार दो बार अंतरालों में अनुदैर्ध्य वृद्धि। विकास की पिछली वर्णित लहर को नोट करें, जो हाइपोकॉटील 16 को स्थानांतरित कर रहा है। स्केल सलाखों = 100 μमीटर। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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मूवी 3
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Discussion

यहां प्रस्तुत विधि दो और तीन दिनों के लिए पार्श्व जड़ों के विकास के उच्च संकल्प confocal इमेजिंग के लिए एक सरल रणनीति है। 48 घंटे तक की अवधि के लिए, पार्श्व रूट विकास पर इमेजिंग सिस्टम का कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं देखा गया। 48 घंटे के बाद, औसत पार्श्व रूट विकास धीमा होना शुरू हुआ, हालांकि जड़ों की पर्याप्त उपसंबद्ध (37%) प्लेटों पर औसत रूट विकास के बराबर दर पर बढ़ती रही। इसलिए, जड़ों की पर्याप्त संख्या में इमेजिंग के माध्यम से, जिनके विकास में 48 घंटों के बाद धीमा पड़ता है, उन्हें बाहर रखा जा सकता है। इमेजिंग कक्षों के व्यवस्थित परीक्षण 72 घंटे से अधिक की अवधि के लिए नहीं किए गए थे, लेकिन यदि विस्तारित इमेजिंग अवधि वांछित हैं तो वैकल्पिक रणनीतियों की सिफारिश की जाती है। इमेजिंग कक्षों को सूक्ष्मदर्शी स्तर पर लगातार छोड़ा जा सकता है, यदि उपयुक्त पर्यावरण स्थितियां प्रदान की जाती हैं या विकास सुविधा को हटा दी जाती हैं और समय-समय पर माइक्रोस्कोप में वापस आ जाता है यह कई कक्षों को समानांतर में चित्रित करने की अनुमति देता है/ P>

यहाँ वर्णित कक्षों का एक फायदा यह है कि पार्श्व की जड़ों को उनकी स्थिति में तय किया गया है और इसे उच्च संकल्प जल विसर्जन लेंस का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। स्थानिक स्थिरता समीक्षकों का समर्थन अगर स्लैब में उपयोग की गई एकाग्रता पर निर्भर करती है। प्रारंभ में 0.8% से 2 से 2% तक की अलग-अलग सांद्रता का परीक्षण किया गया, जिससे पता चलता है कि इस सीमा में उच्च सांद्रता अंतरिक्ष में स्थिर रूप से जड़ें थीं, लेकिन रूट विकास तेजी से धीमा हो गया और कुछ जड़ें यांत्रिक तनाव के संकेतों को प्रदर्शित करती हैं, जिनमें कम सेल विस्तार शामिल है। इसके विपरीत, इमेजिंग के दौरान जरूरी समर्थन और जड़ें एक्स, वाई, और जेड में चली गईं। इष्टतम 1.5% अगर स्लैब प्रतिकूल मैकेनिकल प्रभावों के बिना नमूना की स्थिति को ठीक करता है। इन शर्तों के तहत, पहले 30 मिनट या उससे पहले के निपटान के बाद, जड़ कई घंटे से अधिक स्थिर होते हैं, रातोंरात डाटा अधिग्रहण की अनुमति देते हैं। 4 डी डेटा के अधिग्रहण के दौरान, ज़-स्टाक रेंज आमतौर पर बी थीएक अतिरिक्त 5-10 माइक्रोन से रैकेट किया गया था लेकिन यह मुख्य रूप से z-drift या wobble के बजाय पार्श्व जड़ों के बाहर के विमान वृद्धि को समायोजित करने के लिए था। हालांकि मानक अगर एकाग्रता प्रवेश के खिलाफ कुछ प्रतिरोध प्रदान करता है, गुरुत्वाकर्षण से बढ़ती जड़ों अंततः अगर प्रवेश करेंगे। हालांकि, इमेजिंग चैंबर के एक मामूली संशोधन के माध्यम से, रूट विकास को कवरलिप के समानांतर बनाए रखा जा सकता है, जिससे पुराने पार्श्व जड़ों और प्राथमिक जड़ों को इमेज किया जा सकता है। इसके अलावा, बुनियादी इमेजिंग कक्ष को आसानी से हाइपोकॉटील के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हाइपोकोटिल्स इस प्रणाली में अधिक स्वतंत्र रूप से तैर रहे हैं ताकि छवि अधिग्रहण के लिए z- अक्ष ब्रैकेट आमतौर पर लगभग 20 माइक्रोन तक बढ़ गया। इस अध्ययन में, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पूरे इस्तेमाल किया गया था, जिससे सब्सट्रेट के गुणों को नियंत्रित किया जा सकता था। इमेजिंग चैम्बर उलटा माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन के लिए अनुकूलनीय हो सकता है, लेकिन अंतराल करने वाले अंगों पर कठोर coverslip के समय पर निर्भर प्रभाव का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी। लिटिलजोन और सहकर्मियों ने यह बताया है कि पीएफडी स्वयं जैविक अणुओं को आसानी से भंग नहीं करता है, जिसका अर्थ है कि इसे औषधीय यौगिकों के वितरण के लिए प्रत्यक्ष रूप से इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। इस समस्या को समेकित विकास माध्यम के स्लैब के माध्यम से ऐसे यौगिकों की आपूर्ति करके दूर किया गया था, जिस पर अगर स्लैब टिकी हुई है हालांकि छिड़काव प्रणाली धो-आउट प्रयोगों के लिए पसंद की विधि रहेगी, जबकि इमेजिंग चैंबर डीएक्सएमेथासोन 12 और अन्य यौगिकों के प्रशासन के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। एक नोट, जबकि यह लेख तैयारी वॉन वेगनहेम और उनके सहकर्मियों में था 18 ने हल्के शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पार्श्व रूट विकास इमेजिंग के लिए एक कक्ष का वर्णन किया।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम बीज-व्यक्त आरएफपी-ट्यूबल 6 और सहायक सुधारों के लिए एक अनाम समीक्षक के लिए प्रोफेसर जेफ्री वस्तीनी, ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय का धन्यवाद करते हैं। हम प्रोफेसर ह्यू डिकिन्सन के लिए आभारी हैं कि हमें सेल्यूलोज फिल्म के उपयोग के लिए एक मैकेनिकल समर्थन और फोटोग्राफी के लिए जॉन बेकर के रूप में सतर्क करने के लिए अलर्ट किया गया। यह काम बीबीएसआरसी अनुसंधान अनुदान BB / G013993 / 1 और बीबी / डी 0 0 04055/1 को आईएम में, और बीबीएसआरसी डॉक्टरल प्रशिक्षण पुरस्कार और सीके को क्लैरेडन छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfluorodecalin F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK FLUTEC PP6
Poly(dimethylsiloxane) gum  Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA Item # 132700 Carolina Observation Gel
Cavity Microscope Slides VWR International Ltd, Lutterworth, UK 10118-600 Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice
Cyanoacrylate glue Loctite 604753 Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice
Cellulosic cellophane membrane AA Packaging Limited, Preston, UK 325P cellulose film; 80 mm disc

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 123 कन्फोकल इमेजिंग प्लांट मोर्फोजेनेसिस पेर्फ़्लोरोएडेक्लिन पार्श्व रूट विकास टाइम-लोप इमेजिंग डेक्सामाथासोन ऑरज़ैलीन और आइसॉक्सैबेन
रूट और हाइपोकॉटल विकास के दीर्घकालिक कन्फोकल इमेजिंग के लिए एक सरल चैंबर
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Kirchhelle, C., Moore, I. A SimpleMore

Kirchhelle, C., Moore, I. A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development. J. Vis. Exp. (123), e55331, doi:10.3791/55331 (2017).

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