Summary
Представленная здесь простая методика для конфокальной высококонтрастной визуализации развития корня и гипокотиля с высокой разрешающей способностью на срок до 3 дней с использованием высоких численно-апертурных целей и перфтордекалина в качестве иммерсионной среды.
Abstract
Некоторые аспекты развития растений, такие как морфогенез боковых корней, происходят во временных промежутках в несколько дней. Для изучения лежащих в основе клеточных и субклеточных процессов необходимы стратегии микроскопии с высоким разрешением, которые сохраняют физиологические условия. Ткани растений должны иметь достаточное количество питательных веществ и воды с устойчивым газовым обменом, но при погружении и иммобилизации под покровным стеклом они особенно чувствительны к гипоксии. Одна из стратегий, которая была успешно применена, заключается в использовании перфузионной системы для поддержания постоянной подачи кислорода и питательных веществ. Однако такие меры могут быть сложными, громоздкими и требуют специального оборудования. Представленная здесь альтернативная стратегия для простой системы визуализации с использованием перфтордекалина в качестве иммерсионной среды. Эта система проста в настройке, требует минимального оборудования и легко устанавливается на подставку микроскопа, позволяя устанавливать и отображать несколько камер визуализации по номиналуаллель. В этой системе скорости роста боковых корней неотличимы от темпов роста в стандартных условиях на чашках с агаром в течение первых двух дней, а рост боковых корней продолжается со сниженными скоростями, по меньшей мере, в течение еще одного дня. Ткани растений снабжаются питательными веществами через агар-сляб, который также может использоваться для введения ряда фармакологических соединений. Система была создана для мониторинга развития боковых корней, но легко адаптируется к изображениям других органов растений, таких как гипокотилии и первичные корни.
Introduction
Для изучения клеточных и субклеточных процессов, лежащих в основе развития растений, растет спрос на долгосрочные технологии получения изображений с высокой разрешающей способностью. Ключевая проблема в таких экспериментах по визуализации заключается в поддержании физиологических условий, включая достаточный газообмен, плюс подачу воды и питательных веществ 1 , 2 , 3 . Чтобы использовать цели с высокими числовыми отверстиями для оптимального оптического разрешения, образцы должны располагаться в непосредственной близости и ориентироваться параллельно покровному стеклу. Движение в направлениях x, y и z в идеале должно быть минимальным во время изображения.
Хотя сеянцы часто устанавливают в воде или водном растворе для кратковременной визуализации, вода обладает низкой способностью растворять CO 2 и O 2 (1,54 мг / мл и 0,04 мг / мл соответственно при 20 o C, 0,1 МПа) 4 , что делаетОн непригоден для длительных экспериментов. Системы перфузии, которые поддерживают постоянный уровень кислорода и питательных веществ, являются одним из решений этой проблемы и разработаны для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) 1 , 2 , 3 и световой листовой микроскопии (LSM) 5 . Такие системы, как RootChip 2 и RootArray 3 , были специально разработаны для визуализации временных развитий развивающихся корней и включают проращивание семян в устройстве для создания нескольких образцов на заказ. Эти устройства обеспечивают минимальное механическое возмущение и предназначены для параллельного анализа нескольких сеянцев, но не оптимизированы для визуализации субклеточных структур. Кальдер и его коллеги разработали более сложную камеру для получения изображений на основе перфузии, оптимизированную для визуализации субклеточных структур, в которых образец удерживается на месте сеткойЧтобы позволить использовать линзы с большим увеличением 1 .
Представленное здесь альтернативное, простое решение этой проблемы, которое основано не на перфузионных системах, но использует перфтордекалин (PFD), перфторуглерод, который недавно приобрел популярность в качестве монтажной среды для изображений Arabidopsis 6 , 7 , 8 . В таких применениях высокая пропускная способность PFD для растворения CO 2 и O 2 (1,9 г / мл для O 2 в PFD по сравнению с 0,04 мг / мл в воде) 9 позволяет осуществлять газообмен в погруженной ткани. Кроме того, ПФО не флуоресцентный и его показатель преломления (1,313) сопоставим с показателем преломления воды (1,333) и ближе к цитозолу (1,4), чем по воздуху (1,000) 6 . Сообщается, что перфторуглероды оказывают минимальное физиологическое воздействие на различные растения и растенияВопросы 6 , с семенами редьки легко прорастают при погружении в ПФО и демонстрируют нормальный рост и развитие в течение по крайней мере двух полных дней, когда снабжаются водой 10 . Аналогичные наблюдения были сделаны для прорастания семян Arabidopsis 6 . На основании ВКР-рассеяния, чтобы непосредственно отобразить распределение ПФО в тканях листьев Arabidopsis после инфильтрации, Литлджон и коллеги заключают, что ПФД, вероятно, не поглощается живыми клетками 8 . Ранее ПФД использовался преимущественно для аэрофотосъемки изображения, где он значительно увеличивает глубину изображения, поскольку он легко проникает в воздушные пространства из-за его низкого поверхностного натяжения 6 . Здесь ПФО принимается для долгосрочного конфокального изображения развивающихся латеральных корешков. В этой конфигурации одну или несколько проростков помещают на плиту питательной среды, отвержденной агаром и погруженной в ПФД. PFD позволяет gВ результате чего достигается равномерный обмен в камере визуализации, предотвращающий аноксию. PFD является очень летучим, поэтому он удерживается прокладкой из полидиметилсилоксановой смолы, которая также обладает высокой газопроницаемостью (1,5 × 10 -12 пмоль / м · с -1 Па -1 для CO 2 ) 11 . Питательные вещества и вода подаются слябом из среды, отвержденной агаром. В то же время эта агарная плита мягко прижимает корень к покровному стеклу, фиксируя его относительное положение в камере формирования изображения и позволяя использовать линзы с погружением в воду с высоким разрешением. Кроме того, агарную плиту можно использовать для введения ряда фармакологических обработок, включая дексаметазон, оризалин и изоксабен. Камера формирования изображения может быть собрана в большом количестве со стандартных слайдов для микроскопа, используя минимальное оборудование. Камеры визуализации были разработаны и охарактеризованы для изучения развития боковых корней, но адаптированы к визуализации других органов рассады, таких как наконечники первичного корня игипокотиль.
Protocol
1. Создание камеры
- Используя стеклянный резак, разрежьте полоски шириной 3 мм с конца предметного стекла микроскопа толщиной 1 мм. Используя клей-кaнaкрилатный клей или двустороннюю клейкую ленту, склейте эти стеклянные полоски приблизительно на 45 мм друг от друга по ширине второго слайда микроскопа ( рис. 1A ). Требуется один слайд на камеру, плюс дополнительные слайды для заливки агаровых плит (один слайд даст 2-3 агаровые плиты). Слайды можно использовать повторно.
- Между стеклянными полосками создайте прокладку одинаковой высоты из газопроницаемой поли (диметилсилоксановой) смолы. Поместите шар из поли (диметилсилоксановой) смолы на предметное стекло ( рис. 1В ), намочите второй слайд с небольшим количеством 100% абсолютного этанола и сплющите шарик жевательной резинки поли (диметилсилоксана) вторым слайдом, пока он не достигнет высоты Стеклянных полосок ( рис. 1С ).
- Если необходимо, обрежьте лишний поли (десять центов)Тизилсилоксан) с помощью лезвия бритвы и повторного сплющивания.
- Используя подходящий резак или лезвие бритвы, смоченные в абсолютном этаноле, удалите внутреннюю часть полидиметилсилоксановой смолы, чтобы создать полость, которая позже удерживает рассаду и агарную плиту ( рис. 1D ).
- Тщательно обрезайте гель лезвием бритвы, чтобы создать прокладку с конечной толщиной стенки около 2 мм ( рис. 1E ). Проницаемость газов через поли (диметилсилаксан) барьер не зависит от толщины выше 50 мкм 11 .
2. Создание затвердевшей агаром плиты среды роста
- На слайде с микроскопом с двумя стеклянными полосками поместите покровное (22 мм х 50 мм) так, чтобы оно лежало на обеих стеклянных полосках.
- Пипетка расплавила половину проростка Мурашиге и Скуга, содержащую 1% мас. / Об. Сахарозы и 1,5% мас. / Об. Агар (½ МС) в полученное пространствоНиже покровного, пока последний полностью не заполнится (примерно 1 мл общего объема) и оставить до тех пор, пока агар не будет установлен (приблизительно 5 мин).
Примечание: Фармакологические соединения могут вводиться через агарную плиту путем добавления соответствующих концентраций к жидкой среде перед тем, как сляб наливается. Это было успешно проверено на дексаметазон 12 , изоксабен, 2,6-дихлорбензонитрил (DCB), оризалин и латрункулин B.
3 . Завершение настройки камеры
- Воздух уравновешивает ПФО путем встряхивания небольшого объема ПФД в трубке 7 . Добавьте небольшое количество (приблизительно 200 мкл) ПФД, уравновешенного воздухом, в лунку гелевой прокладки, но не заполняйте камеру полностью. Это PFD поможет избежать захвата пузырьков воздуха под агаровой плитой, когда она помещается в камеру.
- Снимите покровное стекло с агаровой плиты (на этапе 2.2 выше) и используйте лезвие для обрезания частиРазмера и формы. Затем поместите его в лунку гелевой прокладки ( рис. 1F ). Вокруг уплотнительной прокладки должен быть зазор 2-4 мм.
- Полностью заполните камеру ПФД, уравновешенным воздухом.
- Поместите одну или несколько саженцев A. thaliana (до 3-х сеянцев для визуализации в течение 2-3 дней) на агарную пластинку с семядолями и гипокотилем, висящим над краем, плавающим в ПФО ( рис. 1G ).
- Для получения рассады стерилизуют семена 70% -ным этанолом, растят на среде ½ MS с добавлением 1% сахарозы и 0,8% агара, расслаивают в течение 2-4 дней при 4 ° С и растут на вертикально ориентированных планшетах при 22 ° С в 16 Ч свет / 8 ч темный режим. Для визуализации боковых корней расти растения в течение 7-10 дней перед переносом в камеры формирования изображения.
- Чтобы закрыть камеру, нанесите покровное стекло, соответствующее оптике объектива, аккуратно надавив на нее острием стеклянного микроскопа до покровного стеклаЛежит на обеих стеклянных полосках ( рисунок 1Н ).
- Закрепите покровное стекло полосками шириной 1,25 см с микропорной хирургической лентой, разрезанной пополам по длине на каждом конце, если это желательно ( рис. 1I ). Дайте образчику остыть в течение примерно 30 мин до получения изображения. Это минимизирует перемещение образца во время изображения.
- Выполняйте визуализацию с помощью вертикального микроскопа, чтобы сохранить контролируемый субстрат для роста. Используйте цели 20X / 0.7NA или 63X / 1.2NA CS2.
Representative Results
Боковые корни растут с физиологической скоростью в камерах формирования изображения.
Длина боковых корней растений в камерах формирования изображения измерялась с почасовыми интервалами ( рис. 2А , слева, фильм 1, n = 23), а темпы роста сравнивались с таковыми у боковых корней, выращенных на стандартных чашках Петри, содержащих ту же отвержденную агаром среду ( рис. 2A , справа, фильм 2, n = 23). Темпы роста могут значительно варьировать между боковыми корнями, причем длина корня является одним определяющим фактором из-за все более длинных зон роста и пролиферации 13 . Поэтому наборы боковых корней выбирали так, чтобы они представляли корни различной начальной длины (от 50 мкм до 1150 мкм) как в камере формирования изображения, так и в агаровой пластине. Средняя длина боковых корней в начале экспериментаБыла одинаковой в каждом наборе (439 и 442 мкм для камер формирования изображения и пластин соответственно). В анализируемом интервале времени 27 часов рост боковых корней был приблизительно линейным как в камерах формирования изображения, так и на планшетах со средней скоростью роста 52 мкм / ч (R 2 = 0,997) на пластинах и 51 мкм / ч в камерах формирования изображения ( R 2 = 0,993) ( фиг. 2B ). Темпы роста отдельных боковых корней сильно варьируют как на пластинках, так и в камерах формирования изображения ( рис. 2С ), в диапазоне от 17 мкм до 82 мкм / ч в камерах формирования изображения и от 13 мкм / ч до 87 мкм / ч на пластинах. Хотя темпы роста обычно увеличивались с длиной корня, темпы роста по-прежнему существенно различались между корнями одинаковой длины, но дисперсия была аналогичной в камерах формирования изображения и на пластинах.
Боковые корни пролиферируют в камерах формирования изображения и могут быть отображены с помощью hiGh численно-апертурные цели.
Латеральные корни, совместно экспрессирующие маркер плазматической мембраны NPSN12-YFP 14 и маркер микротрубочек UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15, были отображены CLSM 10 с интервалом 1 ч для документирования поведения микротрубочек во время пролиферации клеток в камерах формирования изображения ( Рис. 2D , фильм 3). В этих камерах боковые корни были очень стабильны в своем положении по осям x, y и z, что позволяло получать непрерывные конфокальные стеки с интервалом в несколько часов. Меристемные клетки непрерывно пролиферируются, что видно из формирования полос препрофазы ( рис. 2D , зеленые стрелки), митотических веретен ( рис. 2D , белые стрелки) и фрагмопластов ( рис. 2D , синие стрелки). Как с рассадой на чашках Петри,Полностью удлиненные корневые клетки в камерах формирования изображения инициировали корневые волоски ( фиг. 2А , фиг. 2D , стрелки-головки), указывая далее, что разработка продолжалась, как ожидалось, в камерах формирования изображения. Для обеспечения широкого поля обзора изображения на рисунке 2D были получены с объективом 20x / 0.7 NA. Также было возможно получить изображения боковых корней с высоким разрешением, используя объектив с высокой численной апертурой 63x / 1.2 NA ( рис. 2E ).
Рост боковых корней поддерживается в камерах формирования изображения до трех дней.
Для изучения того, как долго камеры формирования изображения могут поддерживать рост боковых корней с физиологической скоростью, длину латеральных корней в камерах формирования изображения (n = 27) и на пластинах (n = 33) определяли количественно через 0, 24, 48 и 72 часа. Корни чоСена были короче 200 мкм при 0 ч, со средней длиной латеральных корней 117 мкм в камерах формирования изображения и 121 мкм на пластинах. Так как более короткие корни растут в среднем медленнее ( рис. 2С ), они реже растут по краю агаровой плиты, и их легче изобразить. Средний рост всех боковых корней не отличался существенно в камерах формирования изображения по сравнению с чашками Петри в первые 48 ч ( фиг. 3А ). Однако средний рост был значительно снижен между 48 ч и 72 ч ( рисунок 3А ). Хотя темпы роста, как правило, замедляются в камерах формирования изображения через 48 часов, темпы роста между индивидуумами остаются весьма различными ( рис. 3B , 3C ), что означает, что имеется значительная часть боковых корней, которые растут с сопоставимыми скоростями на пластинах и в камерах В течение всего 72-часового периода роста. 23 из 33 выращенных боковых корнейНа пластинах (69,7%) достигают длины в пределах одного стандартного отклонения средней длины в 72 часа (между 927 и 3163 мкм, фигура 3В , красная). 10 из 27 (37,0%) боковых корней в камерах формирования изображения достигают длины в этом интервале ( рис. 3B , красный).
Камеры для визуализации легко адаптируются к более старым боковым корням, первичным корням и гипокотилям .
Одно из ограничений оригинальной конструкции камеры формирования изображения состояло в том, что, в то время как жесткая агаровая плита обеспечивала некоторое механическое сопротивление, гравитропически растущие корни в конечном счете проникали в агарную плиту, что приводило к потере качества изображения ( рисунок 4B ) и росту за пределами рабочего диапазона высоких NA Линзы даже относительно длинного рабочего расстояния (0,3 мм) 63X / 1,3 NA CS2 объектива. Молодым боковым корням не хватает статолитовColumella, необходимых для гравитропизма 17, поэтому они первоначально росли параллельно покровному стеклу в камерах формирования изображения ( рисунок 2E ). По мере того как они растут дольше и образуются колумеллы и статолиты, боковые корни проявляют возрастающий положительный гравитропизм, тогда как первичные корни проявляют сильный гравитропный ответ от прорастания. Это ограничивает до нескольких часов период, в течение которого первичные корни могут быть визуализированы, и это сильно ограничивает начальную длину боковых корней, которые могут отображаться непрерывно в течение 48 ч или более. Чтобы преодолеть это ограничение, камеру модифицировали таким образом, чтобы рост поддерживался параллельно покровному слою целлюлозной целлофановой мембраной, которая действует как барьер проникновения на поверхность агаровой плиты ( рис. 4А ). Первоначальные попытки использования 1,5% агаровой плиты приводили к уменьшению роста корня в течение первых 24 ч из-за, возможно, механического напряжения. Концентрации нижнего агара в слябе испытывалиD было обнаружено, что в камерах со слябом, содержащим 0,8% агара и пленку целлюлозы, скорости роста молодых боковых корней не отличались существенно от темпов роста в обычных камерах в течение первых 48 часов. В течение 0-24 ч средний рост корней в целлюлозных камерах и обычных камерах составлял соответственно 242 и 262 мкм (p = 0,78 t-критерия Стьюдента) и в течение 24-48 ч составлял 330 мкм и 355 мкм 1 соответственно (р = 0,67. т-тест); N = 12 и n = 11, соответственно. Это устройство эффективно предотвращало рост боковых корней от покровного стекла, агара, а также позволяло визуализировать первичные корни в течение 48 ч ( фиг.4С ).
Чтобы проверить , могут ли камеры формирования изображения быть адаптированы к органам, отличным от корней, были выбраны гипокотилы Arabidopsis. Гипокотилы существенно толще, чем корни, поэтому в обычной камере для визуализации верхний слой cElls были сжаты против покровного стекла, что привело к деформации. Альтернативный дизайн был разработан с использованием полостных слайдов, которые содержат овальную впадину в центре ( рис. 4D ). В этой конфигурации плита агара толщиной 1 мм (приготовленная, как указано в п. 2.2 выше) располагалась с одним концом, выступающим на несколько миллиметров в полость скольжения ( фиг.4D ). Гипокотилии располагались над полостью на слайде, в то время как корень располагался над горизонтальной частью. Это гарантировало, что рассада фиксировалась в пространстве корнем, но гипокотиль не раздавливался. Хотя темпы роста в камерах по сравнению с планшетами систематически не определялись, в гипокотилях в камерах формирования изображения наблюдалась хорошо описанная волна продольного роста, мигрирующая вверх по гипокотилю ( рис. 4E , 4F ) 16 .
Рисунок 1 : Сборка камеры формирования изображения. Все детали описаны в тексте. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Боковые корни растут в физиологических условиях в камерах формирования изображения. ( A ) Развитие боковых корней Arabidopsis в камере формирования изображения (слева) и на пластине (справа) в течение 25 часов (постоянный свет, горизонтальная инкубация, одновременная визуализация). Масштабы шкалы = 200 мкм. ( B ) График, показывающий длину боковых корней в течение 27 часов (измеренный с интервалом 1 час), боковых корней, как показано в ( A ). Индивид(N = 23 для тарелок и камер для визуализации), средняя длина - в виде красных кругов. Бары ошибки = 1 SD. Красная линия - линейная посадка по средней длине. ( C ) график, показывающий средний темп роста для всех боковых корней, показанных в ( B ), относительно их начальной длины. ( D ) Максимальные проекции интенсивности 3D конфокальных стеков, полученных из боковых корней, экспрессирующих NPSN12-YFP и RFP-TUB6 в последовательные моменты времени. Вставка: увеличение области в коробке. Зеленые стрелки: полосы препрофазы; Белые стрелки: митотические веретено; Синие стрелки: фрагмопласты; Наконечники стрелок: корневые волоски. ( E ) Максимальные проекции интенсивности изображений с высоким разрешением, полученные из молодого латерального корня трансгенной линии, показанной на ( D ), с использованием объектива 63Х / 1.2 NA и выборки Найквиста (размеры пикселей 77 нм x 77 нм) в течение 0 ч и 16 час; Звездочки располагают одинаковые ячейки в каждый момент времени; Стрелка указывает ячейку, которая делит между 0h и 16 h.Шкала шкалы = 50 мкм (AC); 20 мкм (E). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Долгосрочное развитие боковых корней в камерах формирования изображения. ( A ) график, показывающий средний абсолютный рост корня за три последовательных 24-часовых интервала в камерах формирования изображения по сравнению с планшетами. Ns указывает p> 0,05; *** означает p <0,001 (t-критерий для учащихся). N = 33 (пластины) и n = 27 (камеры формирования изображения). ( B ) График, показывающий длину боковых корней в последовательные моменты времени на всех корнях, используемых в (A). Красный: все боковые корни с конечной длиной в пределах 1 SD от среднего числа всех боковых корней, выращенных на пластинах (от 927 до 3163 мкм). ( C ) Максимум вПроекции плотности репрезентативных трехмерных конфокальных стопок маркера плазматической мембраны NPSN12-YFP в боковых корнях, полученных в последовательные моменты времени более 72 часов. Масштабы шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Камеры визуализации могут быть адаптированы для других органов растений. ( A - C ) Адаптация камеры формирования изображения для первичных корней. ( A ) Схема конструкции камеры формирования изображения. Это идентично стандартной конструкции ( рис. 1 ), за исключением двух модификаций: средняя плита MS содержит 0,8% агара вместо 1,5% агара и целлюлозную пленку (красную) помещают между агаром и растением для предотвращения ростаВ агар. ( B ) проекции максимальной интенсивности XY (верхняя) и XZ (нижняя) типичных 3D конфокальных стопок маркера NPSN12-YFP плазматической мембраны в первичном корне семидневного сеянца, отображаемого через 0 часов и 48 часов при обычной визуализации камера. Обратите внимание, что корень вырастает в агар из-за его гравитропного ответа. ( C ) XY (верхняя) и XZ (нижняя) проекции максимальной интенсивности типичных 3D конфокальных стопок маркера NPSN12-YFP плазматической мембраны в первичном корне семидневного сеянца, отображаемого через 0 ч и 48 ч при визуализации Камера с целлюлозной пленкой. Перед применением пленку целлюлозы стерилизуют в 80% этаноле и вымачивают в жидкой среде ½ MS. Обратите внимание, что гравитропный рост корня в агар предотвращается. ( D - F ) Адаптация камеры отображения для гипокотилей. ( D ) Схема, показывающая конструкцию камеры гипокотиля. Полипропилен (диметилсилоксановая) прокладка (серый) является manufactuКрасный на полости слайд между двумя стеклянными полосками (желтый). Плита 1,5% агара равномерной толщины (бежевый) помещается на предметное стекло, частично попадая в полость. Камера заполнена PFD (синий). Рассаду помещают на агарную плиту так, чтобы гипокотиль занимал наклонно-наклоненную область агаровой плиты в полости, в то время как корень располагался горизонтальной частью агара. Камера закрывается покровным стеклом. ( E ) Максимальные проекции интенсивности типичных 3D конфокальных стопок маркера NPSN12-YFP плазматической мембраны в гипокотиле двухдневного сеянца, отображаемого в течение 48 часов в последовательные моменты времени. ( F ) Продольный рост в двух последовательных временных интервалах отдельных клеток вдоль базисной-апикальной оси (относительное положение в 0 ч вдоль оси, показанной на рис. Е) гипокотиля показано в ( Е ). Обратите внимание на ранее описанную волну роста, мигрирующую вверх по гипокотилю 16 . Шкала шкалы = 100 μм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Фильм 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 3: Пожалуйста, cЛизать здесь, чтобы скачать этот фильм.
Discussion
Представленный здесь метод представляет собой простую стратегию для конфокальной визуализации высокого разрешения развивающихся боковых корней в течение двух и до трех дней. Для периодов до 48 ч не наблюдалось отрицательных эффектов системы формирования изображения на развитие боковых корней. Через 48 часов средний рост боковых корней начал замедляться, хотя значительное количество корней (37%) продолжало расти со скоростью, сопоставимой со средним ростом корня на пластинах. Поэтому при визуализации достаточно большого количества корней можно исключить корни, рост которых замедляется через 48 часов. Систематические тесты камер визуализации не проводились в течение более чем 72 часов, но рекомендуются альтернативные стратегии, если желательны длительные периоды визуализации. Камеры отображения могут оставаться на стадии микроскопа непрерывно, если имеются подходящие условия окружающей среды, или удаляться в средство роста и периодически возвращаться в микроскоп. Это позволяет отображать многочисленные камеры параллельно. </ Р>
Одно из преимуществ описанных здесь камер состоит в том, что боковые корни фиксируются в их положении и могут быть отображены с использованием линз с погружением в воду с высоким разрешением. Пространственная стабильность критически зависит от концентрации агара, используемой в плите опорного агара. Сначала тестировали диапазон различных концентраций от 0,8% агара до 2% агара, показав, что высокие концентрации в этом диапазоне стабильно фиксируют корни в пространстве, но рост корней замедляется быстрее, а некоторые корни проявляют признаки механического напряжения, в том числе уменьшенное удлинение клетки. Напротив, низкие концентрации агара не обеспечивали необходимую поддержку, и корни дрейфовали по x, y и z во время получения изображения. Оптимальная 1,5% агаровая плита фиксирует положение образца без неблагоприятных механических воздействий. В этих условиях после оседания в первые 30 мин или около того корни стабильны в течение многих часов, что позволяет получать данные за ночь. Во время сбора 4D-данных диапазоны z-стека обычно были bРэкетом еще на 5-10 мкм, но это было главным образом для обеспечения внеплоскостного роста боковых корней, а не z-дрейфа или колебания. Хотя стандартная концентрация агара обеспечивает некоторое сопротивление проникновению, гравитропно растущие корни, в конечном счете, проникают в агар. Тем не менее, благодаря незначительной модификации камеры формирования изображения, рост корня можно поддерживать параллельно покровному стеклу, позволяя визуализировать более старые боковые корни и первичные корни. Кроме того, базовую камеру формирования изображения можно легко настроить для гипокотилей. Гипокотилы более свободно плавают в этой системе, поэтому скобка для оси Z для получения изображения обычно увеличивается примерно до 20 мкм. В этом исследовании по всему периметру использовался вертикальный микроскоп, который позволял контролировать свойства субстрата. Камера формирования изображения может быть адаптирована к конфигурации инвертированного микроскопа, но необходимо будет оценить зависящее от времени влияние жесткого покровного стекла на перехватывающие органы. Литлджон и коллеги указали, что сам ПФО не легко растворяет биологические молекулы, а значит, он не может быть использован непосредственно для доставки фармакологических соединений 7 . Эта проблема была решена путем подачи таких соединений через плиту затвердевшей питательной среды, на которой лежит агарная плита. В то время как перфузионные системы остаются методом выбора для экспериментов по промыванию, камера формирования изображения успешно использовалась для введения дексаметазона 12 и других соединений. Одно замечание, в то время как эта статья была в стадии подготовки, фон Вагенхайм и его коллеги [ 18] описали камеру для визуализации развития боковых корней с использованием микроскопа с использованием листа.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Джеффри Вастенайса, Университет Британской Колумбии, за семена, выражающего RFP-TUB6, и анонимного рецензента за полезные исправления. Мы благодарны профессору Хью Дикинсону за то, что он предупредил нас об использовании целлюлозной пленки в качестве механической опоры и Джона Бейкера для фотографии. Эта работа была поддержана исследовательскими грантами BBSRC BB / G013993 / 1 и BB / D004055 / 1 для IM, и Докторантурой обучения BBSRC и Стипендией Кларендона в CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
