Summary
PCR 매개 유전자 변형은 시각화 및 효모 세포 및 단백질의 정량을 용이 칸디다 종의 형광 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 칸디다에서 형광 단백질 융합 (Eno1-FP)을 구축하기위한 전략을 제시한다.
Abstract
칸디다 종, 장 및 비뇨 생식기 책자의 유행 식민지 개척자는, 인간의 침습성 진균 감염의 대부분의 원인이다. 따라서, 분자 유전 도구들은 발병 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기 위해 필요하다. PCR 매개 유전자 변형은 검출을 용이하게하기 위해 에피토프 태그 된 단백질을 생성하는 간단하고 빠른 방법이다. 특히, 형광 단백질 (FP) 융합은 각각 형광 현미경 및 면역에 의해 모두 효모 세포와 단백질의 시각화 및 정량 분석을 할 수있는 강력한 도구입니다. 칸디다 종의 형질 전환을 용이하게 영양 마커 유전자와 함께 FP 인코딩 서열을 포함하는 플라스미드, 칸디다 FP의 구축 및 발현을 목적으로 생성되었다. 여기서, 우리는 칸디다 종의 FP 융합을 구성하기위한 전략을 제시한다. nourseothricin resista를 포함하는 플라스미드어느 녹색, 황색, 또는 체리 FPS (GFP, YFP, mCherry)는 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)의 유전자 - 특이 서열을 포함하는 프라이머와 함께 사용되는 FP 카세트를 생성하기위한 서열과 함께 NCE 변환 마커 유전자 (NAT1) . 이 유전자 특이 카세트를 상동 재조합을 통해 대응 유전자좌의 3'- 말단에 통합 할 수있는 능력을 갖는다. 관심의 유전자 유전자좌에 FP 서열의 성공적인 프레임 내 융합 현미경 및 / 또는 면역 검출 방법에 의한 융합 단백질의 발현을 분석 한 후, 유전자가 확인되어있다. 또한, 고도로 발현 된 단백질의 경우에 성공적인 융합체 형광 이미징 기술에 의해 주로 대해 스크리닝 할 수있다.
Introduction
칸디다 종은 모든 인간의 장 및 비뇨 생식기 책자를 식민지 공생 균이다. 그러한 즉 조산 또는 암 치료에서 면역 억제 효과 발생과 같은 면역 결핍의 조건에서, 칸디다 종은 기회 병원균이 될 수 있습니다. 칸디다 종, 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)가 가장 널리 진균 식민이며 침습성 진균 감염의 대부분을 야기한다. 이러한 C. 글라 브라, C.의 실로 시스, C.의 tropicalis 및 C와 같은 다른 칸디다 종, 일부 나타내는 고유 저항, 면역 저하 환자에서 심각한 감염을 일으킬 kruseii 일반적 따라서 이러한 플루코나졸과 암포 테리 신 B와 항진균 항생제를 사용하는 이 종의 일부와 감염은 특히 항 곰팡이 제와 예방 치료를 받고있는 환자에서 더 자주 관찰되고있다. 심지어 적절하고 적시에NTI 곰팡이 처리, 침략 칸디다 감염은 상당한 이환율과 사망률 1과 연관 될 것을 계속한다. 이 때문에 인체의 칸디다 종의 중요성, 그 병인 기전 연구 및 해명 있도록 쉽게 구할 분자 도구에 대한 요구가있다.
연구진은 시각화하고 미생물 세포와 그들이 표현하는 단백질을 정량화 할 수 있습니다 하나의 중요한 도구는 FP 융합 기술입니다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) - 매개 유전자 변형이 논문에 기재된 바와 같이, FP 서열 및 게놈 유전자좌 관심 서열을 코딩 칸디다 단백질 간의 융합의 구성을 허용한다. 구조물의 안정적 통합은 단백질 발현의 분석뿐만 아니라 단백질 현지화 역학을 용이하게한다. FP 서열을 함유하는 플라스미드는, 칸디다 알비 칸스의 발현을 최적화하고는 PCR 매개 g 사용될 수있다엔 변형 전략은 이전에 2, 3, 4, 5를 구성 하였다. C. 알비 칸스 및 C. 실로 시스 2, 3, 4, 5, 6, 7의 변환을 용이하게하는 영양 마커 유전자에 연결된 FP 서열 플라스미드 FP 변환 "카세트"을 포함한다. 현재 사용 가능한 플라스미드를 선택 영양 영양 요 구성 균주의 변환을위한 마커 유전자 (URA3, HIS1, ARG4)뿐만 아니라 auxotrophies이 결여 된 임상 균주의 변환을 용이하게하는 지배적 인 약물 내성 마커 (NAT1)의 다양한 포함되어 있습니다. 또한, 플라스미드 여보 쇼 최대 네 개의 다른 FP 시퀀스 (녹색 [GFP]에 대한 옵션을 포함[YFP] w, 시안 [CFP], 체리 [mCherry]) 및 카르복시 말단 단백질 융합의 건설, 또는 아미노 말단 단백질 융합의 건설을위한 프로모터 서열에 대한 ADH1 종결 서열 중 하나. 프라이머는 FP 카세트를 둘러싼 플라스미드 DNA에 동성으로 설계되었습니다. 또한, 프라이머는 상동 재조합 (그림 1)를 통해 게놈 궤적에 카세트의 통합을 용이하게 태그 할 관심있는 효모 유전자에 상 동성을 베어링 5'-확장 시퀀스가 포함되어 있습니다. 유전자 특이 FP 카세트를 PCR에 의해 생성 된 리튬 아세테이트로 처리하여 DNA의 흡수를위한 제작 능력 칸디다 세포로 형질 전환된다.
그림 1 : FP 시퀀스 융합은 칸디다 종에서 생성하는 방법의 다이어그램. (A) 플라스미드 DNA를 포함하여에스 FP 순서 및 저항 (NAT1) nourseothricin 시퀀스 인코딩. 앞으로 (FWD) 및 역방향 (REV) 프라이머의 상대 위치는 플라스미드 서열 상 동성의 영역을 나타내는 프라이머 및 유전자 고유 동성 영역 또는 프라이머 확장을 나타내는 보라색 부분의 검은 부분으로 표시됩니다. (B) FP 카세트는 칸디다로 변환 및 상동 재조합 (점선)를 통해 ENO1 게놈 궤적 내에 통합되어있다. ENO1의 말단에 FP 융합 시퀀스를 생성 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기서, 우리는 칸디다 단백질 융합 (Eno1-FP) 구조의 일례를 제시한다. 우리는 GFP, YFP를 코딩하는 서열과 함께 NAT1 변환 마커 유전자를 포함하는 플라스미드에 태그 또는 사용mCherry (그림 2). 이러한 플라스미드의 카르복시 말단에 융합 FPS Eno1 발현 결과 ENO1의 3'- 말단에 FPS의 융합을 촉진 유전자 특이 카세트를 생성하기 위해 PCR에서 프라이머와 함께 사용된다.
그림 2 : FP 카세트 함유 플라스미드의지도. 앞으로 (F) 및 플라스미드에서 카세트를 생성하는 데 사용 역 (R) 프라이머는 플라스미드에 자신의 동성의 상대 위치와 함께 표시됩니다. 표 1에 열거 된 프라이머 서열이다. F1과 R1은 또한 pYFP- NAT1 카세트를 생성 하였다. YFP- NAT1 카세트 (pMG2263)를 함유하는 플라스미드 GFP 서열 대신 YFP 제외한 pMG2120 동일하다. 카세트 크기 : GFP-NAT1, 3.7 KBP; mCherry- NAT1, 3.2 KBP; YFP- NAT1, 3.7 KBP. 이 그림은 Gerami-Nejad, 등에서 수정되었습니다. 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
대장균 1. 격리 템플릿 플라스미드
- 진탕 37 ° C에서 10 ml의 원성 국물 (LB) + 200 ㎎ / ℓ의 암피실린 (AMP)에서 하룻밤 템플릿 플라스미드를 포함하는 대장균 성장.
- 2 분 동안 6,000 XG에 원심 분리하여 수확 세포.
- 액체를 가만히 따르다 분리 및 문헌 [Ausubel 등 이전에 설명 된대로 E. 표준 방법에 의해 세포를 대장균에서 DNA를 정화. 8.
- 50 ~ 100 ng를 / ㎖의 작업 농도, 트리스 - EDTA (10 mM 트리스, 산도 8.0, 1 mM의 EDTA, pH가 8.0 TE)에 재현 탁의 DNA.
2. 디자인 프라이머
| 뇌관 | 프라이머 시퀀스 |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
표 1 : 본 연구에 사용 된 프라이머 서열. 굵은 이탤릭체 텍스트가 ENO1 게놈 유전자좌에 상 동성을 나타내고, 정상 폰트 영역 DNA 플라스미드 상동이다.
- <리> 설계 프라이머 카세트 경계 서열이 유전자의 게놈 유전자좌로 재결합을 용이하게하기 위해 관심있는 표적 유전자 (예 ENO1)의 3'- 말단뿐만 아니라 증폭하는 플라스미드 상동 될 (도 2 및 표 1) .
- 정방향 프라이머 서열은 지난 70 염기쌍 관심 유전자 (BP), 5'-3 '을 뺀 종결 코돈과 일치하는 부호화 프레임을 유지하기 위해, 플러스 플라스미드 서열의 처음 약 30 염기쌍이되고 있는지 확인 증폭. 참고로, 각 프라이머의 GGTGGTGGTT없이 FP 상 동성을 가진 폴리 글리신 링커입니다. 참고로, 링커가없는 경우에, 이론적으로 단백질 미스 폴딩 단백질 생산 수율이 낮거나 손상된 생체 활성을 초래할 수 기능적 도메인을 직접 융합있을 수있다.
- 역방향 프라이머 서열이 유전자의 70 bp의 하류 있는지 확인 3'- 5 ', 어떤 유전자 서열, 플러스 마지막 아프로을 포함하지 않는ximately 플라스미드에서 사용되는 영양 또는 약물 내성 마커의 30 염기쌍.
- 사용 F1과 R1은 pMG2343와 mCherry- NAT1를 생성하는 pMG2120 및 pMG2263, 각각 및 F2와 R2와 GFP- NAT1 및 YFP- NAT1 카세트를 생성합니다.
3. PCR에 의해 FP 카세트를 생성 (1 일)
- PCR 용 시약을 준비합니다. 1.5 ㎖의 튜브에 다음의 양과 농도를 첨가하여 마스터 믹스 (500 ㎕의 최종 부피) 확인 : 50 ㎕의 PCR 완충액 (500 mM의 염화칼륨, 물 100 mM 트리스 pH를 8.0) 20 μL의 데 옥시 뉴클레오티드 (dNTPs를 단계; 스톡 혼합물 10 mM의 각), 40 ㎕의 25 mM의 염화 마그네슘에서 뉴클레오티드의 20 μL는) 10 μl를 앞으로 각각 10 mM의 스톡 솔루션에서 프라이머 (역방향), 30 ㎕의 DNA 형성 촉매를 ~ 50 ~ 100 NG / μL 원액에서 플라스미드 (정제 중합 효소 (일반, 5,000 단위 / ㎖) 320 ㎕를 물.
- 10 PCR-compatib 각각에 마스터 믹스의 분취 액 50 μL제작 : 0.5 ml의 튜브.
- 다음 단계를 열 순환기에 PCR 튜브를 놓고 실행 : 1주기 분 (5)의 94 ° C에서 dsDNA를 변성; 94 ° C에서 45 초 40주기를 순차적으로, 55 ° C에서 30 초 프라이머 플라스미드 템플릿 DNA에 어닐링 할 수 있도록하고, DNA 제품의 확장을위한 68 ° C에서 4 분하는 단계; 72 ° C에서 15 분의 1 최종 확장 사이클.
참고 : PCR 마스터 믹스와 자전거 매개 변수가 사용되는 특정 Taq 중합 효소에 따라 수정해야 할 수도 있습니다. - 풀 1.5 ML 튜브에서 10 PCR 반응에서 모든 제품.
- 아가 로스 겔 전기 풀링 된 PCR 산물의 제목 5 μL은 DNA 사다리 비교에 기초하여, 앰플 리콘의 크기를 확인하고 제품 농도의 추정치를 얻었다. 일반적으로, 각각의 후속 변환 믹스에 카세트 DNA의 ~ 250 μg의를 사용합니다.
- 제품을 750 ㎕의 95 % 에탄올에 이어 50 ㎕의 3 M 아세트산 나트륨을 첨가하여 DNA를 침전 적어도 30 분 부화-20 ℃에서
- 10 분 동안 16,000 XG에서 튜브를 원심 분리하여 PCR 산물 수확. 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버리고 밤새 펠렛을 건조. 40 ㎕의 TE의 pH 8.0에서 건조 DNA 카세트 펠렛을 재현 탁하고 사용할 때까지 실온에서 저장합니다.
4. FP DNA 카세트와 칸디다 셀 변환
- 1 일에, 효모 균주를 복구하는 아데닌 (YPAD) 한천과 효모 펩톤 덱 스트로스 상에 약간의 긁힌 결정을 질주하고 30 ° C에서 부화하여 (-80 ° C) 주식 냉동 15 % 글리세롤에서 변환 할 수 있습니다. 콜로니의 성장을 회수 한 후, 통기성 캡 유리 배양 관에 2 ㎖의 액체 YPAD 매체에 단일 콜로니를 접종하고 교반하면서 30 ℃에서 밤새 배양한다.
- 제 2 일에, 통기성 캡 125 ㎖의 삼각 플라스크에 50 ㎖에 (최종 OD 600 ~ 0.2) 신선한 YPAD 밤새 효모 배양 300 μl를 희석. 30 ° C에서 흔들어(최종 OD ~ 0.6-0.8 600) ~ 3 시간 동안.
- 50 ML 원뿔 튜브에 하룻밤 문화를 붓고 테이블 위에 원심 분리기 1 500 XG에서 5 분 동안 회전시켜 세포 펠렛.
- 붓고 제대로 상층 액을 버린다. 5 ㎖의 물에서 세포 펠렛을 재현 탁. 테이블 탑 원심 분리기에서 1,500 XG에서 5 분간 다시 원심 분리하여 세포를 다시하는 것은-펠렛.
- 붓고 제대로 상층 액을 버린다. 1.5 ㎖의 튜브에 전송하는 동안 500 μL TELiAc (10 mM 트리스, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, pH가 8.0, 0.1 M 아세트산 리튬 TE 리튬 아세테이트)에 세포를 재현 탁. 미세 원심에서 3,000 XG에서 2 분 동안 튜브를 원심 분리기.
- 250 μL TELiAc에 재현 탁 세포. 펠렛을 포함하여 총 부피는 ~ 300 ㎕를해야한다.
- 클린 (4.2.4에서 다른 미세 원심 분리 튜브)에 5 μL 캐리어 DNA (10 ㎎ / ㎖)과 (4.2.4)에서 제조 된 칸디다 세포 150 μl를 추가합니다. 이 t에 대한 부정적인 컨트롤입니다ransformation.
- 제 깨끗한 미세 원심 분리 관에 변성 캐리어 DNA의 5 μL (즉, 10 분간 90 ℃에서 비등하고 4 ℃로 냉각되었다) (3.3.1)에서 준비된 PCR 산물의 모든 40 μL, 150을 추가 (4.2.4)에서 제조 칸디다 셀 μL.
- 실온에서 30 분 동안 두 변환 믹스 부화.
- 각 변환 믹스 튜브에 700 μL PLATE 믹스 (10 mM 트리스, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, pH가 8.0, 50 % 폴리에틸렌 글리콜 3350 0.1 M 리튬 아세테이트)를 추가한다. 혼합 RT에서 하룻밤을 배양하기 위해 튜브를 반전.
- 3 일에, 변환 1 시간 동안 42 ° C (열 충격)에서 혼합 배양한다.
- 원심 분리기 변환은 마이크로 원심에서 16,000 XG에 30 초 동안 혼합합니다. 제거하고 제대로 상층 액을 버린다. 세포를 손상시키지 않도록하기 위해서 아래로 부드럽게 피펫 팅하여 150 ㎕의 물에서 세포 펠렛을 각각 재현 탁하고.
- 변환의 유타에 대한영양 요 구성 마커 유전자 (예를 들어 URA3)을 ilizing 적절한 선택 배지에 한천 용액을 피펫 팅 (예를 들어 결여 딘)에 의해 각 전 혼합 접시에 균일하게 멸균 유리 비드를 사용하여 혼합물을 분산.
- 여기에 설명 된 바와 같이 nourseothricin 저항 마커 유전자 (NAT1)를 이용한 변환의 경우, 변환 판은 비 선택적 YPAD 한천 상에 제 혼합물 및 6-12 시간 동안 30 ℃에서 배양한다. 스트레스를 nourseothricin 전에 세포 복구, 후 열 충격이 단계 에이즈가 적용된다.
- 부분적인 성장 복구 후 YPAD 상에 복제 판 칸디다 세포는 400 μg의가 / ㎖ nourseothricin 포함. 영양 마커 유전자 (예를 들어 URA3)를 이용한 변환의 경우,이 중간 도금 단계가 필요하지 않은 세포를 직접적 4.4.2에 기술 된 바와 같이 선택적 효모 매체 (예 YPAD 결여 딘) 상에 도금 될 수있다.
주 : 변환이 성공적이면, COLonies은 1 ~ 3 일 내에 표시 (잠재적 nourseothricin 함유 한천에 선택에 대한 파생물 5 일까지)한다. 어떤 식민지 단독 (대조군)을 캐리어 DNA를 포함하는 변환 믹스와 확산 판에 표시되지 않아야합니다.
- 영양 요 구성 및 nourseothricin 마커 선택, 신선한 선택적 매체 한천 플레이트에 하나의 식민지로 행진 추정 형질 전환 및 들어 FP 융합의 성공적인 건설을위한 검사를 할 수 있습니다 효모 세포를 전파하기 위해 30 ° C에서 품어.
- 화면 형질 전환 체는 태그 카세트의 올바른 통합 (자세한 예를 들어 대표 결과를 참조). 관심의 유전자를 충분한 양으로 발현되는 경우, 콜로니 전체의 형광은 형광 검출 능력 판 촬상 시스템을 이용하여 잠재적 인 후보 통합 체를 검출 할 수 있도록 발생할 수있다.
- PCR은 outsid 시퀀스 프라이머 동성을 사용하여 추정 통합 체를 확인통합의 영역의 전자는 표적 유전자에 융합을 확인한다.
- 또한, 웨스턴 융합 단백질의 발현 및 크기를 결정하기 위해 오점 분석뿐만 아니라 알려진 경우 단백질 지역화 시각적 확인을 위해 단 전지의 형광 현미경을 고려한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
예를 들어, 우리는 C. 실로 시스 실험실 균주에 Eno1하는 GFP 및 mCherry 융합을 구성하기 위해 위에서 설명한 프로토콜을 사용했다. 각각의 추정 형질 전환 초기 성장 restreaked했다. 생성 된 융합 단백질이 높은 (에 놀라 제)를 표현하고, FPS 밝은 때문에이 예에서, 우리는 (도 3) 종래의 진단 PCR 수행을 형광 현미경에 의해 형질 전환 체를 선별 할 수 있었다 (6).
그림 3 : 칸디다 형질 전환에 의해 전시 식민지 형광. 효모 판 성장의 대표적인 이미지는 이미지에 Cy3에 필터 mCherry 발현 균주 및 이미지 YFP- 및 GFP를 발현하는 균주로 CY2 필터를 구비 한 레이저 스캐닝 시스템을 사용하여 수득. 각 쌍의 패널을 왼쪽, FP-expressi균주를 ng를; 각 쌍의 오른쪽 패널, 해당 FP-표현 변형과 같은 필터를 이미지화 비 형질 전환 된 모 균주 (4175). 시각화에 따라, 이미지가 반전하고, 밝기 및 대비는 FP가 발현 제어 계통에 대해 동일하게 조정 하였다. 이 수치는 등 Gonia에서 허가 재판된다. (6) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
게놈 DNA는이 추정되는 형질 전환 체 각각에서 9 단리 (F 및 R이 의도 게놈 유전자좌 내의 어닐링에 태그 될 프라이머 여기서 외부 즉 시퀀스) 카세트 통합 부위를 플 랭킹 서열에 상보적인 프라이머와 함께 DNA를 주형으로 진단 PCR들에 FP 카세트의 올바른 통합을 확인하기 위해 단지 홍보관심의 유전자의 종결 코돈을 IOR. C 리튬 아세테이트 변환에 대한 음의. C. albicans에 변환의 경험에 비해 실로 시스, 우리는 (~ 상영 식민지의 1 ~ 2 %는 올바른 통합을 포함) 낮은 효율을 관찰했다.
놀라 현지화를 분석하기 위해 Eno1-FP는 GFP, YFP 텍사스 레드 필터 세트와 100 W 수은 램프 및 표면 형광 조명 구비 한 photomicroscope를 이용하여 형광 현미경으로 구축 발현하는 효모 세포를 관찰 하였다. 전하 결합 소자 (CCD) 카메라는 이미지 분석 소프트웨어 (도 4a) (6) 처리 된 이미지를 수집 하였다. 또한, 우리는 시각적으로 혼합 (그림 4B) (6) 내에서 서로 다른 효모 균주를 구별에 다른 FP 색상이 유용한 것으로 나타났다. 놀라는 고도의 표현에 위치하고 있기 때문에효모 세포의 많은 부분은 그것에 FP 융합체는 칸디다 -host 상호 작용 분석에 용이하게 예를 들면, 가시화 될 수있는 형광 효모 균주를 생성하는데 사용될 수있다.
그림 4 : 발현과 형광 현미경에 의해 Eno1-FP 융합의 현지화. (A) 형광 (위)과 미분 간섭 대비 (DIC는, 아래) 칸디다 균주에 대한 이미지가 Eno1 - FPS를 표현. C. 알비 칸스 및 C. 파라 프 실로 시스의 Eno1-FPS하지만 훨씬 낮은 정도 핵뿐만 아니라 세포질에 집중하는 경향이있다. (B) Eno1-mCherry 및 Eno1-GFP를 표현 칸디다 균주의 혼합 문화의 현미경 이미지. 오른쪽 패널, 텍사스 빨간색 필터; 센터 패널, GFP 필터; 오른쪽 패널은 DIC 이미지 모두 형광 패널로 병합합니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 수치는 등 Gonia에서 허가 재판된다. 6 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FP 융합체는 또한 웨스턴 블 롯팅에 의한 단백질 발현 수준의 분석을 용이하게한다. 전술 한 프로토콜에 의해 생성 된 효모 세포를 이용한 단백질은 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리 된 세포 용 해물로부터 단리하고, 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 막 (10)에 옮겼다. Eno1-FP 융합체는 이전 6 바와 같이 상업적으로 이용 가능한 항체를 이용하여 블롯에서 검출 하였다. 요약하면, 마우스 항 GFP (1 : 000 희석), 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 컨쥬 게이트 된 염소 항 - 마우스 IgG 하였다 (1 : 10,000 희석) 항체 및 GFP- YFP-TA위한 프로브를 사용 하였다gged에 놀라. 토끼 항 mCherry (1 : 2000 희석) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 하였다 (1 : 10,000 희석) 항체 mCherry 표지 된에 놀라 제를위한 프로브를 사용 하였다. 모든 융합 단백질이 용이 성공적인 형질 전환 체 (도 5, 레인 2, 5, 7) (6)의 용 해물로부터 검출하고 (단백질 래더 표준 비교 C. 알비 칸스에 놀라-FP 기준으로 예상 크기 (~ 75 kDa의)로했다했다 도 5, 레인 1, 6) 6. 어떤 신호는 태그가없는 부모 효모 관찰되지 (그림 5, 레인 3, 4) 하였다 (6).
그림 5 : 칸디다 균주에서 세포 용 해물의 면역 블롯. 레인 1, ENO1의 -mCherry 융합을 포함하는 C. albicans에 (J. 버먼, 미네소타 대학)(양성 대조군); 레인 2, ENO1 -mCherry 융합을 포함 C. 파라 프 실로 시스; 레인 3 및 4, 비 형질 C. 파라 프 실로 시스의 친주 4175 11 (대조군); 레인 5, ENO1에게 -YFP 융합을 포함 C. 파라 프 실로 시스; 레인 6, ENO1의 -GFP 융합 (J. 버먼, 미네소타 대학) (양성 대조군)를 포함 C. albicans에; 레인 7, ENO1에게 -GFP 융합을 포함 C. 파라 프 실로 시스; 차선 L, 표시된 98 및 64 kDa 단백질 표준 단백질 사다리. 레인 1-3은 반 mCherry 항체와 함께 배양 4-7는 항 GFP 항체로 인큐베이션 하였다 레인 하였다. 이 수치는 등 Gonia에서 허가 재판된다. 6 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프로토콜 단계로 / 상품 | 가감 | 잠재적 인 개선 (주의) |
| 프라이머 디자인 | 관심의 게놈 궤적에 동성의 이상 지역을 포함하여 프라이머를 길게 | 결합의 효율성과 상동 재조합을 개선 (프라이머의 길이를 수정하면 최적의 열처리 온도를 변경할 수 있습니다) |
| PCR (앰플 리콘 품질) | 높은 충실도 DNA 형성 촉매를 사용하여 젤 PCR 생성물을 정제 | 순서 및 변환 효율을 게놈 프라이머의 표적 개선하기 위해 카세트 시퀀스에 오류의 소개를 줄입니다 (겔 정제 따라서 앰플 리콘의 수량과, 변환 효율이 저하 될 수 있습니다) |
| PCR (앰플 리콘 수량) | PCR 반응 수영장 제품의 수를 증가 | Increas형질 전환 된 세포의 수는 전자 (너무 많은 앰플 리콘은 변환 효율이 감소 될 수 있음) |
| 카세트 침전 | 4 ℃에서 원심 분리를 수행 얼음의 모든 시약 및 튜브를 유지 | DNA 수율과, 따라서, 변환 효율을 증가 |
| 열 충격 | 시간을 단축 | 스트레스 효모 세포의 생존 능력을 향상 (짧은 열 쇼크 기간은 또한 세포의 DNA 카세트의 흡수 감소 될 수 있음) |
| 복구 성장 1 | 한천 포함 nourseothricin에 도금하기 전에 YPAD 한천에 이상 복구 할 수 | nourseothricin에 노출 될 때 스트레스 효모 긴 복구 시간을 필요로 할 수있다 (장기간 배양 시간은 오염물과 위양성 형질 전환 성장을 증가시킬 수있다) |
| 식민지 파생물 1, 2 | 이상 번 번호판을 품어 (5 ~ D) | 성ressed 효모 세포는 식민지의 성장을위한 이상 배양 시간이 필요할 수 있습니다 (이상 배양 시간은 오염 물질과 거짓 양성 형질 전환 성장을 증가시킬 수있다) |
| 성장에 영향을 미치는 유전 적 변이를 포함하는 효모 균주의 NAT1 선택 마커를 사용하여 변환에 별 1 개 또는 2 개의 변환 | ||
표 2 : 문제 해결 및 최적화를위한 가이드.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
에피토프의 구조는 상술 한 PCR 매개 유전자 변형 전략을 사용하는 칸디다 종의 서열은 세 단계로 요약 될 수있다 태그. 먼저, 카세트 모두 효모 게놈 내로 삽입 궤적 상동 통합 영역에 대해 원하는 서열을 코딩하는 PCR에 의해 이루어진다. 둘째로, 변환 될 수있는 효모 세포 리튬 아세테이트 카세트가 공동 인큐베이션 화학적 능력 만들어진다. 셋째, 세포 형질 전환 체를 복구하는 선택 배지 상에 플레이 팅하고 얻어진 콜로니 원하는 게놈 로커스에 카세트의 정확한 통합 시험된다.
C. 알비 칸스 및 C. 파라 프 실로 시스의 형광 융합 단백질을 얻는 성공률을 향상시키기 위해 이러한 프로토콜 내에서 여러 가지 중요한 단계가있다. 우선, 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 정제 된 프라이머의 이용 (PAGE, 제조자에 의해)이 높은 촬영 인ommended. 정제하지 않고, 카세트를 상동 재조합에 의해 목적 유전자 유전자좌에 통합되는 효율을 줄일 수있는 최종 제품의 잘못된 길이의 프라이머를 얻는 증가 할 가능성이있다. 둘째, PCR 산물의 정확한 크기를 보장하기 위해 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 DNA 카세트 ~ 5 μL를 분석함으로써, PCR 생성 태깅 카세트 고품질 인 것을 확인 바랍니다. 셋째, 변화에 최적화 된 효모 세포를 얻기 위해, 셀은 사용 전에 현미경 분명 효모 싹 성장의 로그 상에 있어야한다. 넷째, 열 쇼크 후 형질 전환 효모 세포의 부유 중에 선택적 매체 상 도금 전에 부드럽게 피펫 팅 기법을 사용하는 것이 필수적이다. 다섯째, benef 수있다 nourseothricin 함유 매체에 복제하기 전에 YPAD 한천에 성장을 위해 더 많은 시간을 허용, 효모 세포에 독성 nourseothricin에 형질 전환 선택에 대한형질 전환 체의 회복을 촉진하기 위해 icial. 의도 된 게놈 위치의 외부 성, 그대로 플라스미드 및 PCR 카세트 통합은 칸디다 낮은 주파수에서 발생 않으며, 또한 식민지의 성장에 발생합니다. 따라서, 통합을 위해 사용되는 시퀀스의 외부 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 변환 된 모든 콜로니를 분석 할 필요가있다. PCR에 의해 확인되지만 현미경으로 형광을 나타내지 않는다 형질 전환 체를 들어, 세포 용 해물과 염기 서열의 웨스턴 블롯 분석을 추가로 건설 또는 시각화 실패의 원인을 조사하기 위해 고려되어야한다. 이러한 중요한 단계에 더하여, 변환 효율의 향상 및 정확한 카세트 통합 빈도를 높이기 위해 필요한 경우 변경 될 수있는 프로토콜의 몇 가지 단계가있다. 문제 해결 가이드는 표 2에 제시되어있다.
미래의 애플리케이션에 최적화 될 수있는이 기술의 잠재적 인 제한이 있습니다. lithium 아세테이트 방법은 C에 대한 낮은 효율 DNA 변환 결과 (~ 상영 식민지의 1 ~ 2 %는 올바른 통합을 포함)에 사용됩니다. 실로 시스 12, C. 알비 칸스에 비해. 전기 변환 효율은 13을 향상시킬 수를 리튬 아세테이트 형질 전환하는 다른 방법이다. ADH1 터미네이터의 사용, 보편적 태깅 방법 동안 필요는 기본 터미네이터 순서로 발생한 것이다 것과 안정성 및 / 또는 생성 된 mRNA의 규제를 변경할 수 있습니다. 단백질의 고유 함수는 특정 연구 문제에 중요 할 때 잠재적 문제가 고려 될 필요가있다. 낮은 수준으로 발현되는 형광 융합 단백질, 전체 식민지 현미경 식별하거나 성공적인 형질 전환을위한 화면 옵션이 될 수 없습니다. 이 경우, PCR 및 웨스턴 블롯 분석은 성공적인 융합 단백질 sequ의 증거를 제공 할 것입니다줬어 / 단백질 구조. 모든 융합 단백질의 구조에 공통 인 한계는, 에피토프 태그 융합 단백질의 비정상적인 위치 파악을 포함 의도 돌연변이 표현형 결과, 단백질의 고유 기능을 방해 할 수 있다는 것이다. 이러한 문제의 고려가 중요하고 지시 된 바와 같이 적절한 컨트롤이 포함되어야한다.
이 PCR 매개 방식으로 칸디다의 에피토프 태그를 생성하기위한 유용한 플라스미드는, 여기에 언급 된 것들뿐만 아니라, 이전에 연구 그룹에 의해 생성 진균 유전학 스톡 센터 (HTTP를 통한 연구에 사용할 수있다 : //www.fgsc. 그물). 이 플라스미드의 몇 가지에 대한 자세한 정보는 (http://www6.tau.ac.il/berman/)에서 확인할 수있다. 사용 가능한 플라스미드, FP 시퀀스는 다른 색깔 효모, 다른 에피토프 태그 옵션을 생성하기 위해 영양 및 약물 내성 마커의 조합의 무수를 포함 (HA는 myc의는, V5, HIS9는) 아칸소 단백질을 생성하는전자는 단백질의 구성 적 및 조절 가능한 표현의 카르복시 또는 아미노 - 말단 및 프로모터 시퀀스 중 하나에 태그. 이 도구는 prototrophic 있습니다 사용할 수없는 기존의 영양 마커를 렌더링 임상 효모 균주의 변화와 연구를 위해 허용하는 약물 내성 마커를 포함하는 플라스미드는 곰팡이 병인의 분야에 특히 유용합니다. 다른 파장에서 형광을 임상 칸디다 균주의 구성을 시각화하고 공 배양 여러 효모 균주를 구별 할 수있는 능력을 필요로 세포 생물학적 검정의 다양한 유용 할 것이다.
때문에 칸디다 종 침습성 진균 질환, 특히 면역 저하 환자 14, 15 치료하기 어려운 높은 이환율과 사망률과 관련되는 중요한 인간의 건강 문제가되고 있습니다. 따라서, 그 분자 도구는 연구를 허용ERS는 더 빠르고 쉽게 칸디다 종 - 호스트 상호 작용이 칸디다 생물학 및 병인 기전에 대한 우리의 이해를 발전을 위해 매우 중요하다 공부합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 원래 mCherry FP 순서를 제공 N. 딘 감사, M. Gerami-Nejad 플라스미드의 건설이 프로젝트의 개발 기간 동안 도움이되는 조언을 기술 지원 B. 라슨, 그리고 T. Heisel. JB는 유럽 연구위원회 고급 상 340087 (RAPLODAPT)에 의해 지원되었다. 현미경 및 이미징 시스템은 미네소타 소아 과학 재단의 대학과 미네소타 이미징 센터의 대학에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
- Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
- Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
- Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
- Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
- Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
- Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
- Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
- Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
- Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
- Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
- Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
- Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).
