Summary
PCR בתיווך שינוי גנטי יכול לשמש כדי ליצור תערובות חלבון פלואורסצנטי במיני קנדידה, המאפשר הדמיה לכמת בתאי שמרים וחלבונים. בזאת, אנו מציגים אסטרטגיה לבניית שילוב חלבון פלואורסצנטי (Eno1-FP) ב קנדידה parapsilosis.
Abstract
מיני קנדידה, הקולוניאליסטים רווחים של קטעי מעיים ו מין ושתן, הן הגורם של רוב הזיהומים פטרייתיים פולשניים בבני אדם. לכן, כלים מולקולריים וגנטיים נדרשים כדי להקל על המחקר של המנגנונים בפתוגנזה שלהם. PCR בתיווך שינוי גנטי הוא גישה פשוטה ומהירה ליצור חלבונים מתויג epitope כדי להקל הגילוי שלהן. בפרט, חלבון פלואורסצנטי (FP) התכה הם כלים רבי עוצמה המאפשרים הדמיה לכמת הן בתאי שמרים וחלבונים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו immunoblotting, בהתאמה. פלסמידים המכילים רצפי קידוד FP, יחד עם גני סמן תזונתיים המסייעים טרנספורמציה של מיני קנדידה, נוצרו לצורך בניית הביטוי FP ב קנדידה. בזאת, אנו מציגים אסטרטגיה לבניית היתוך FP בתוך מיני קנדידה. פלסמידים המכילים את עמיד nourseothricinגן סמן טרנספורמציה NCE (NAT1) וכן רצפים לאף ירוק, צהוב, או דובדבן FPS (GFP, YFP, mCherry) משמש יחד עם פריימרים הכוללים רצפים ספציפי גני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי ליצור קלטת FP . יש קלטת גן ספציפי זה יש את היכולת להשתלב סוף 3'של מוקד הגן המקביל באמצעות רקומבינציה הומולוגיים. היתוך בתוך המסגרת מוצלחת של רצף FP לתוך מוקד הגן של עניין מאומת גנטי, ואחריו ניתוח של ביטוי חלבון היתוך על ידי מיקרוסקופ ו / או שיטות איתור חיסוני. בנוסף, במקרה של חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה, יכולים להיות מוקרנים בשילובים מוצלחים בעיקר על ידי שיטות הדמית קרינה.
Introduction
מיני קנדידה הם פטריות commensal כי ליישב את שטחי מעי מין ושתן של כל בני האדם. בתנאים של כשל חיסוני, כגון המתרחשות עם לידה מוקדמת או תופעות מדכאות חיסון מן הטיפולים בסרטן, מיני הקנדידה יכולים להיות פתוגנים אופורטוניסטים. של מיני קנדידה, קנדידה אלביקנס הקולוניאליסט פטרייתי הנפוץ ביותר וגורם רוב הזיהומים פטרייתיים פולשניים. מינים אחרים קנדידה כגון ג glabrata, ג parapsilosis, tropicalis ג, ו- C. kruseii גם לגרום לזיהומים רציניים בחולים מדוכאי חיסון, עם קצת התנגדות פנימית מפגין נפוצים אנטיביוטיקה אנטי פטרייתי כגון fluconazole ו amphotericin B. לפיכך, זיהומים עם כמה מינים אלה הנצפים בתדירות גבוהה יותר, במיוחד בקרב חולי המטופלים מניעתי עם תרופות אנטי פטרייתי. אפילו עם הולם במועדNTI-פטרייתי לטיפול, זיהומי קנדידה פולשניים להמשיך להיות מזוהה עם תחלואה משמעותית ותמותה 1. בגלל המשמעות של מינים הקנדידה לבריאות האדם, יש צורך בכלים מולקולריים זמינים המאפשרים לימוד ובירור מהותה של מנגנוני בפתוגנזה שלהם.
כלי אחד חשוב המאפשר לחוקרים לחזות ולכמת תאים מיקרוביאליים החלבונים שהם מביעים היא טכנולוגיית היתוך FP. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) שינוי גנטי בתיווך, כמתואר במאמר זה, מאפשרת בנייה של התכה, בין רצפי FP לבין חלבון קנדידה קידוד רצף של ריבית מוקד הגנומי שלו. שילוב יציב של המבנה מאפשר ניתוח של ביטוי חלבון כמו גם דינמיקת לוקליזציה חלבון. פלסמידים המכילים רצפי FP, אופטימיזציה עבור ביטוי קנדידה אלביקנס וכי ניתן להשתמש ב- G בתיווך PCRאנרגית אסטרטגית שינוי, נבנתה בעבר 2, 3, 4, 5. פלסמידים המכילים FP טרנספורמציה "קלטות": רצף FP צמוד גן סמן תזונתי המאפשר השינוי של ג אלביקנס ו- C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. נכון לעכשיו פלסמידים זמינים כוללים מגוון של גני סמן תזונתיים לבחירה (URA3, HIS1, ARG4) לחידוש זני auxotrophic גם כסמן עמידות לתרופות דומיננטיות (NAT1), המאפשר שינוי של זנים קליניים חסרי auxotrophies. בנוסף, פלסמידים המכילים אפשרויות עבור עד ארבעה רצפים FP שונים (ירוק [GFP], Yellow [YFP], ציאן [CFP], ודובדבן [mCherry]) ואו רצף סיום ADH1 לבנייה של התכה חלבון carboxy הסופית-, או רצף האמרגן לבנייה של התכה חלבון אמינו הסופית-. Primers נועדו עם הומולוגיה ל- DNA פלסמיד סביב קלטת FP. בנוסף, פריימרים גם כוללים סדרות 5'-רחבת נושאות הומולוגיה לגן שמרי עניין להיות מתויג, המאפשר אינטגרציה של הקלטת לתוך מוקד גנומית באמצעות רקומבינציה הומולוגי (איור 1). גן ספציפי קלטות FP מופקות על ידי PCR ואז להפוך לתאי קנדידה עשו מוסמכת לספיגה של ה- DNA על ידי טיפול עם אצטט ליתיום.
איור 1: תרשים של איך בשילובי רצף FP נוצרים מיני קנדידה. (א) includ DNA פלסמידes רצף FP וכן קידוד רצף nourseothricin התנגדות (NAT1). מיקומים יחסיים של קדימה (FWD) primers ההפוכה (REV) נראים לעין, עם חלקים שחורים של פריימרים המציינים באזור של הומולוגיה לרצף פלסמיד ואת המנות הסגולות המציינות באזור הומולוגית הגן ספציפי או הארכה יחל. (B) קלטות FP הופכות קנדידה ולשלב בתוך מוקד גנומית ENO1 באמצעות רקומבינציה הומולוגי (קווים מקווקווים). (ג) כתוצאה רצף היתוך FP בבית 3'end של ENO1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בזאת, אנו מציגים דוגמא של היתוך חלבון (Eno1-FP) מבנים במיני קנדידה. אנו משתמשים תיוג פלסמידים המכילים את הגן סמן טרנספורמציה NAT1 וכן רצפי קידוד GFP, YFP, אוmCherry (איור 2). פלסמידים אלה משמשים יחד עם פריימרים ב PCR כדי ליצור קלטות גן ספציפי המאפשרים שילוב של FPS כדי 3'-סוף ENO1, וכתוצאה מכך ביטוי Eno1 התמזגו fps ב carboxy הסופית- שלה.
איור 2: מפות של פלסמידים קלטת המכילה FP. קדמי (F) הפוך (R) פריימרים השתמשו כדי ליצור את הקלטות מן פלסמידים מסומנים יחד עם המיקום היחסי של ההומולוגיה שלהם פלסמידים. רצפים פריימר הם כמפורט בטבלה 1. F1 ו- R1 שימשו גם כדי ליצור את קלטת NAT1 pYFP-. הפלסמיד המכיל את הקלטת NAT1 YFP- (pMG2263) זהה pMG2120 למעט YFP במקום של רצף ה- GFP. בגדלים קלטת: GFP-NAT1, 3.7 KBP; mCherry- NAT1, 3.2 KBP; YFP- NAT1, 3.KBP 7. נתון זה יש הבדל בין Gerami-נג'אד, et al. 4 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פלסמידים תבנית לבודד מן החיידק
- לגדול החיידק המכיל את הפלסמיד תבנית לילה 10 מ"ל lysogeny מרק (LB) + 200 מ"ג / L אמפיצילין (AMP) על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
- קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 2 דקות.
- למזוג נוזל, לבודד ולטהר דנ"א E. coli תא על ידי שיטה סטנדרטית כפי שתואר לעיל Ausubel et al. 8.
- Resuspend DNA טריס-EDTA (TE; 10 מ"מ טריס, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0) בריכוז העבודה של 50-100 ng / ml.
2. Primers עיצוב
| תֶחֶל | רצף פריימר |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
טבלה 1: רצפים פריימר השתמשו במחקר זה. טקסט נטוי מודגש מציין הומולוגיה אל מוקד ENO1 גנומית, אזורי גופן נורמלים הם הומולוגיים פלסמיד דנ"א.
- <li> פריימרים עיצוב להיות הומולוגיים פלסמיד רצפים הגובלים קלטת להיות מוגבר וכן 3'-end של הגן היעד של עניין (למשל ENO1) כדי להקל על רקומבינציה לתוך מוקד הגנומי של הגן (איור 2 ולוח 1) .
- ודא כי הרצפים פריימר קדימה להתאים 70 זוגות הבסיסים האחרונים (נ"ב) של הגן של עניין, 5'- 3 ', מינוס קודון העצירה, כדי לשמור על מסגרת הקידוד, בתוספת BP כ -30 הראשונים של רצף פלסמיד להיות מוגבר. בתור הערה, את GGTGGTGGTT בכל פריימר הוא מקשר גליצין-פולי ללא הומולוגיה FP. מן ראוי לציין כי, בהעדר מקשר, לא יכול להיות היתוך ישיר של תחומים פונקציונליים, אשר באופן תיאורטי יכול להוביל misfolding חלבון, תשואה נמוכה בייצור חלבון, או את פעילות ביולוגית של לקוי.
- ודא כי הרצפים פריימר ההפוכים הם 70 נ"ב רק במורד זרם של גן, 3'- 5 ', לא כולל כל רצף גן, בתוספת appro האחרוןximately 30 נ"ב של הסמן התזונתי או סמי התנגדות המשמש את הפלסמיד.
- השתמש F1 ו- R1 כדי ליצור GFP- NAT1 ו YFP- NAT1 קלטות עם pMG2120 ו pMG2263, בהתאמה ו F2 ו R2 כדי ליצור mCherry- NAT1 עם pMG2343.
3. צור FP קלטות ידי PCR (יום 1)
- כן ריאגנטים עבור PCR. הכן תערובת מאסטר (500 נפח סופי μl) על ידי הוספת כמויות וריכוזים הבאים אל צינור 1.5 מ"ל: 50 μl חיץ PCR (אשלגן כלורי 500 מ"מ, 100 מ"מ טריס pH 8.0 במים), 20 deoxynucleotides μl (dNTPs; תערובת המניות של נוקלאוטידים ב- 10 מ"מ כל אחד), 40 מגנזיום כלוריד μl 25 מ"מ, 20 μl מטוהרים פלסמיד (מ ~ 50-100 ng / פתרון מניות μl), 10 μl כל קדימה לאחור תחל (מ -10 פתרונות מניות מ"מ), 30 תקי μl פולימראז (גנריות, 5,000 יחידות / מ"ל), ו 320 מים μl.
- Aliquot 50 μl של תמהיל מאסטר לתוך כל אחד 10 PCR-compatible 0.5 מ"ל צינורות.
- מניחים צינורות PCR ב thermocycler ולהפעיל את השלבים הבאים: 1 מחזור של 5 דק 'ב 94 ° C עד לפגל dsDNA; 40 מחזורים ברצף של 45 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר פריימרים כדי לחשל את תבנית ה- DNA פלסמיד, ו -4 דקות ב 68 מעלות צלזיוס למשך הארכת מוצרי DNA; ו 1 מחזור רחב סופי של 15 דקות ב 72 מעלות צלזיוס.
הערה: מיקס מאסטר PCR ופרמטרים אופניים ייתכן שיהיה צורך לשנות מבוסס על פולימראז תקי מסוים בשימוש. - ברכה כל המוצרים מ -10 תגובות PCR צינור 1.5 מיליליטר.
- נושא 5 μl של מוצר ה- PCR נקווה כדי ג'ל אלקטרופורזה agarose לאמת גודל amplicon ולקבל אומדן של ריכוז המוצר, המבוסס על השוואה סולם DNA. באופן כללי, השתמשו ~ 250 מיקרוגרם של ה- DNA קלטת בכל תמהיל שינוי שלאחר מכן.
- המשקע DNA על ידי הוספת 50 μl 3 נתרן אצטט M ואחריו 750 μl 95% אתנול למוצרים דגירה לפחות 30 דק 'ב -20 ° C.
- קציר את מוצרי ה- PCR על ידי צנטריפוגה את הצינור ב XG 16,000 למשך 10 דקות. מוציאים בזהירות וזורקים supernatant ומייבשים גלולה לילה. Resuspend גלולה קלטת DNA מיובש 40 μl TE pH 8.0 ולאחסן בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
4. משני תאי קנדידה עם FP DNA קלטות
- ביום 1, לשחזר זן שמרים להפוך ממורי גליצרול 15% קפוא (-80 ° C) מניות על ידי מפוספס על כמה גבישים מגורדים על דקסטרוז שמרים peptone עם אדנין (YPAD) אגרתי לדגור על 30 מעלות צלזיוס. לאחר ההתאוששות של צמיחת מושבה, לחסן מושבה אחת לתוך מדיום YPAD נוזל 2 מיליליטר צינור תרבות זכוכית עם מכסה לנשימת דגירת הלילה בשעת 30 ° C עם תסיסה.
- ביום 2, לדלל 300 μl של תרבית שמרים הלילה לתוך 50 מ"ל YPAD טריים (עד OD הסופי 600 של ~ 0.2) בבקבוק Erlenmeyer 125 מ"ל עם מכסה לנשימה. לנער על 30 מעלות צלזיוסעבור ~ 3 שעות (עד OD הסופי 600 ~ 0.6-0.8).
- יוצקים את תרבות הלילה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו גלולה התאים על ידי ספינינג במשך 5 דקות ב 1 XG 500 בצנטריפוגה בראש הטבלה.
- יוצקים מעל כראוי וזורקים supernatant. Resuspend התא גלולה במים מ"ל 5. Re-גלולת התאים על ידי צנטריפוגה שוב במשך 5 דקות ב 1500 XG בצנטריפוגה בראש הטבלה.
- יוצקים מעל כראוי וזורקים supernatant. Resuspend התאים 500 μl TELiAc (אצטט ליתיום TE: 10 מ"מ טריס, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.1 מ 'אצטט ליתיום) בעת העברת לצינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה הצינור במשך 2 דקות ב 3000 XG ב microcentrifuge.
- תאים Resuspend ב 250 TELiAc μl. ההיקף הכולל כולל הגלולה צריך להיות ~ 300 μl.
- כדי נקי (שפופרת microfuge שונה מאשר 4.2.4), להוסיף 5 DNA המוביל μl (10 מ"ג / מ"ל) ו -150 μl של תאים מוכנים קנדידה (מ 4.2.4). זהו בקרה שלילית עבור transformation.
- לצינור microfuge השני נקי, להוסיף 5 μl של ה- DNA המוביל מפוגל (כי כבר מבושל על 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו מקורר 4 ° C), כל 40 μl של מוצר ה- PCR מוכן (מ 3.3.1) ו -150 μl של תאי קנדידה מוכנים (מ 4.2.4).
- דגירה תערובות טרנספורמציה שני למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- צינור אחד לערבב טרנספורמציה, להוסיף 700 תמהיל צלחת μl (10 מ"מ טריס, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.1 מ 'אצטט ליתיום פוליאתילן גליקול 50% 3350). להפוך את הצינורות כדי לערבב דגירה אותם בן לילה ב RT.
- ביום 3, דגירה טרנספורמציה מתערבב על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. (הלם חום).
- צנטריפוגה טרנספורמציה מתערבב במשך 30 שניות XG 16,000 ב microcentrifuge. הסר כראוי וזורקים supernatant. Resuspend כל של כדורי תא מים 150 μl ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי שלא לגרום נזק לתאים.
- עבור טרנספורמציות utilizing גנים סמן auxotrophic (למשל URA3), צלחת כל התערובת כולה על ידי pipetting הפתרונות על אגר התקשורת סלקטיבית המתאימה (uridine למשל חסר) ולהפיץ את התערובת באופן שווה באמצעות חרוזי זכוכית סטרילית.
- עבור טרנספורמציות ניצול גן סמן התנגדות nourseothricin (NAT1), כפי שמתואר כאן, שינוי צלחת המערבב הראשון על אגרת YPAD הלא סלקטיבי לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 6-12 שעות. עזרי צעד זה ב התאוששות תא, הלם חום פוסט, לפני nourseothricin לחץ מוחל.
- לאחר התאוששות הצמיחה חלקית, צלחת העתק התאים קנדידה על YPAD המכיל 400 מיקרוגרם / מ"ל nourseothricin. עבור טרנספורמציות ניצול גנים סמן תזונתיים (למשל URA3), צעד ציפוי ביניים זו אינה נחוצה ותאי יכול להיות מצופה ישירות על גבי מדיה שמרים סלקטיבית (uridine למשל YPAD חסר) כמתואר 4.4.2.
הערה: אם השינוי הוא מוצלח, colonies אמור להופיע, בתוך שלושה ימים (פוטנציאל עד חמישה ימים של תולדה לבחירה על אגרת nourseothricin המכיל). אין מושבות אמורות להופיע על צלחות להתפשט עם תערובות טרנספורמציה המכילות מוביל DNA לבד (שליטה שלילית).
- לבחירת סמן auxotrophic ו nourseothricin, transformants המשוערת פס כמו מושבות אחת צלחות אגרו תקשורת סלקטיבית טריות לדגור על 30 מעלות צלזיוס כדי להפיץ תאים שמרים כי יכול להיות מוקרן לבנייה מוצלחת של התכת FP.
- Transformants מסך לשילוב נכון של קלטת תיוג (ראה נציג תוצאות עבור דוגמה מפורטת). אם הגן של עניין מתבטא בסכומים מספיק, הקרינה המושבה כולה עלולה להתרחש כך אפשר לזהות integrants מועמד פוטנציאלי באמצעות מערכת הדמיה צלחת עם יכולת גילוי הקרינה.
- בדוק integrants המשוערת על ידי PCR באמצעות הומולוגיים פריימרים רצפים outsidדואר של האזור של אינטגרציה לאשר היתוך גן היעד.
- בנוסף, שקול ניתוח כתם המערבי על מנת לקבוע את הביטוי וגודל של החלבון היתוך, כמו גם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים בודדים עבור אישור חזותי של לוקליזציה חלבון, אם הוא ידוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדוגמא, השתמשנו הפרוטוקול שתואר לעיל לבנות בשילובי GFP ו mCherry כדי Eno1 ב זן מעבדת parapsilosis ג. כל transformant המשוערת בתחילה restreaked לצמיחה. בדוגמא זו, שכן חלבון ההיתוך כתוצאה מבוטא בכמות גבוהה (אנולאז) ואת FPS בהיר, הצלחנו להקרין transformants ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני ביצוע אבחון PCR (איור 3) 6.
איור 3: קרינת מושבה שהפגינה קנדידה transformants. נציג תמונות של צמיחה צלחת שמרים שהושגו באמצעות מערכת סריקת לייזר המצוידת במסנן Cy3 לתדמית זן להביע mCherry ומסנן Cy2 לתמונה YFP- וללחצים להביע GFP. פאנל משמאל בכל זוג, FP-expressing זנים; הפאנל הימני בכל צמד, זן ההורה הלא טרנספורמציה (4175) צילמו עם אותו מסנן כמו המתח FP-להביע המקביל. בעקבות ויזואליזציה, התמונות היו הפוכות בהיר והניגודיות הותאמו באופן זהה עבור FP-להביע זנים שליטים. נתון זה נדפס באישור Gonia, et al. 6 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הדנ"א הגנומי היה מבודד 9 מכל אחת transformants המשוערת אלה ושימש את תבנית ה- DNA, יחד עם פריימרים משלים רצפים איגוף באתרי האינטגרציה הקלטת (רצפי כלומר מחוץ כאשר F ו- R פריימרים לחשל בתוך מוקד גנומית אמור להיות מתויג) , ב PCRs אבחון המוודאת אינטגרציה נכונה של הקלטת FP רק יחסי ציבורIOR אל קודון עצירה של הגן של עניין. מן ראוי לציין כי עבור טרנספורמציות יצטטו ליתיום עם C. parapsilosis, צפינו יעילות נמוכה (~ 1-2% של מושבות הוקרן הכיל שילוב נכון) לעומת הניסיון שלנו עם טרנספורמציות ג אלביקנס.
כדי לנתח לוקליזציה אנולאז, צפינו תאי שמרים להביע Eno1-FP בונה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות photomicroscope מצויד מנורה 100 W כספית תאורה epifluorescence עם GFP, YFP וערכות מסנן אדום טקסס. מכשיר תשלום מצמיד (CCD) מצלמה שמשה לאיסוף תמונות שעובדו עם תוכנת ניתוח תמונה (איור 4 א) 6. בנוסף, מצאנו כי בצבעים שונים FP הועילו ויזואלית להבחין זני שמרים שונים בתוך תערובת (איור 4 ב) 6. בגלל אנולאז מבוטא בכמות גבוהה וממוקםחלק גדול של תא שמרים, בשילובים FP כדי שניתן יהיה להשתמש בו כדי ליצור זני שמרים ניאון כי ניתן דמיינו בקלות, למשל, בניתוחים של אינטראקציות -host קנדידה.
איור 4: ביטוי ולוקליזציה של התכת Eno1-FP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. (א) הקרינה (למעלה) התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC, למטה) תמונות עבור זנים קנדידה להביע Eno1-FPS. Eno1-FPS ב ג אלביקנס ו- C. parapsilosis נוטים להתרכז בגרעין וכן בציטופלסמה, אבל במידה נמוכה בהרבה. (ב) תמונות מיקרוסקופיות של תרבות מעורבת של זנים קנדידה להביע Eno1-mCherry ו Eno1-GFP. פנל ימני, מסנן אדום טקסס; לוח אמצעי מסנן GFP; פנל ימני, למזג של הפלואורסנט היא עם תמונת DIC. ברי סולם = 10 מיקרומטר. נתון זה נדפס באישור Gonia, et al. 6 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
התכת FP גם להקל על ניתוח של רמות ביטוי חלבון על ידי מערבי סופג. שימוש בתאי שמרים שנוצרו על ידי הפרוטוקול המתואר לעיל, חלבונים בודדו lysates תא, מופרד על ידי ג'ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE), והועברו קרום polyvinylidene difluoride (PVDF) 10. התכה Eno1-FP אותרו על כתמים באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית כמתואר 6 בעבר. בקצרה, עכבר אנטי GFP (דילול 1: 2,000), ואחריו IgG אנטי עכבר עז peroxidase מצומדות חזרת (1: דילול 10,000) נוגדנים שימשו לחקור עבור GFP- ו YFP-taאנולאז gged. ארנב נגד mCherry (1: 2,000 דילול) ואחריו IgG נגד ארנב עז peroxidase מצומדות חזרת (1: דילול 10,000) נוגדנים שימשו לחקור עבור אנולאז mCherry-tagged. כל חלבוני ההיתוך התגלו בקלות מ lysates של transformants המוצלח (איור 5, נתיבים 2, 5, ו -7) 6 ו היו בגודל צפוי (~ 75 KDA) לעומת סטנדרט סולם חלבון וסטנדרטי ג אלביקנס אנולאז-FP ( איור 5, מסלולים 1 ו -6) 6. אין אות נצפתה עבור זן שמרי הורה המתויג (איור 5, נתיבי 3 ו -4) 6.
איור 5: immunoblot של lysates התא מפני זנים קנדידה. ליין 1, ג אלביקנס המכיל היתוך ENO1 -mCherry (J. ברמן, אוניברסיטת מינסוטה) (בקרה חיובית); מסלול 2, ג parapsilosis המכיל היתוך ENO1 -mCherry; נתיבים 3 ו -4, זן הורה ג parapsilosis untransformed 4175 11 (שליטה שלילית); מסלול 5, ג parapsilosis המכיל ENO1 היתוך -YFP; מסלול 6, ג אלביקנס המכיל היתוך ENO1 -GFP (J. ברמן, אוניברסיטת מינסוטה) (בקרה חיובית); נתיב 7, ג parapsilosis המכיל ENO1 היתוך -GFP; שביל L, סולם חלבון עם 98 ו -64 תקני חלבון kDa מצוינים. Lanes 1-3 הודגרו עם נוגדן אנטי mCherry ו נתיבי 4-7 הודגרו עם נוגדן אנטי- GFP. נתון זה נדפס באישור Gonia, et al. 6 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שלב פרוטוקול / פריט | שינוי | שיפור פוטנציאלי (אזהרות) |
| עיצוב פריימר | להאריך פריימרים על ידי הכללת יותר באזור של הומולוגיה מוקד הגנומי של עניין | שפר את יעילות מחייב הומולוגי (שינוי אורך פריימר עשויה להשתנות חישול בטמפרטורה אופטימלית) |
| PCR (איכות amplicon) | השתמש תקי נאמנות גבוהה ג'ל לטהר מוצר PCR | מנמיך כניסתה של שגיאות לתוך רצפי קלטת לשיפור מיקוד של פריימר לגנום רצף יעילות שינוי (טיהור ג'ל עשויה לקטון כמות amplicon ומכאן, יעילות שינוי) |
| PCR (כמות amplicon) | הגדל את מספר התגובות PCR ומוצרי בריכה | increasמספר דואר של תאי טרנספורמציה (amplicon יותר מדי גם יכול לגרום יעילות שינוי מופחתת) |
| ממטרי קלטת | בצע צנטריפוגה ב 4 ° C, לשמור את כל ריאגנטים הצינורות על הקרח | להגדיל את התשואה דנ"א, ומכאן, יעילות שינוי |
| מכת חום | לקצר את הזמן | שפר כדאיות של תאי שמרים הדגישו (פעמי הלם חום קצרות יכול גם לגרום ספיגת ירידה של קלטת ה- DNA על ידי תאים) |
| שחזור צמיחת 1 | לאפשר התאוששות כבר על אגר YPAD לפני ציפוי כדי nourseothricin אגר המכיל | תאי שמרים הדגיש ייתכן שיהיה צורך זמני ההתאוששות כבר כאשר הם נחשפים nourseothricin (פעמים הדגירה כבר עשוי גם להגדיל מזהמים חיוביות שגויות צמיחה transformant) |
| מושבת תולדת 1,2 | דגירת צלחות לזמנים ארוכים יותר (~ 5 ד) | רחובתאי שמרי ressed עשויים להזדקק פעמי דגירה כבר לצמיחת מושבה (פעמי דגירה כבר עשויות גם להגדיל מזהם וצמיחת transformant חיובית שגויה) |
| 1 ספציפית טרנספורמציות באמצעות סמן בחירת NAT1 או 2 טרנספורמציות של זני שמרים המכילים מוטציות גנטיות המשפיעות צמיחה | ||
טבלה 2: מדריך לפתרון בעיות ואופטימיזציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בניית epitope מתויגת רצפים במיני קנדידה באמצעות אסטרטגיית שינוי הגנטית בתיווך PCR שתוארה לעיל ניתן לסכם כמו תהליך בן שלושה שלבים. ראשית, קלטת נעשית על ידי PCR מקודד הוא הרצף רצוי לשילוב ואזורים הומולוגי אל המוקד להכנסה לתוך הגנום שמרים. שנית, תאי שהמרים חייב להשתנות עשויים מוסמכות כימיות עם מודגרות שיתוף יצטט ליתיום עם הקלטת. שלישית, התאים מצופים על תקשורת סלקטיבית להתאושש transformants ומושבות וכתוצאה מכך נבדקות לשילוב נכון של הקלטת לתוך מוקד גנומית הרצוי.
ישנם מספר צעדים קריטיים בתוך בפרוטוקול זה כדי לשפר את שיעור ההצלחה של קבלת חלבון היתוך ניאון ג אלביקנס ו- C. parapsilosis. ראשית, השימוש פריימרים כי כבר מטוהרים על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד; על ידי היצרן) הוא מאוד recommended. ללא טיהור, קיימת סבירות גבוהה של קבלת פריימרים באורכים שגויים במוצר הסופי, אשר יכול להפחית את היעילות שבה הקלטת משתלבת מוקד גנומית שהתכוון הומולוגי. שנית, מומלץ לוודא כי קלטת התיוג שנוצר PCR היא באיכות גבוהה, על ידי ניתוח ~ 5 μl של ה- DNA קלטת ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose על מנת להבטיח גודל נכון של מוצר PCR. שלישית, כדי להשיג תאים שמרים שמותאמים טרנספורמציה, התאים צריכים להיות בשלב יומן של צמיחה, עם ניצנים שמרים ניכר על ידי מיקרוסקופ לפני השימוש בהם. הרביעית, קיים הכרח להשתמש בטכניקת pipetting עדינה במהלך resuspension של תאי שמרים טרנספורמציה לאחר הלם חום ולפני הציפוי על תקשורת סלקטיבית. חמישית, לבחירה transformant על nourseothricin, שהוא רעיל לתאים שמרים, המאפשר זמן יותר לצמיחה על אגר YPAD לפני משכפלים על מדיום המכיל nourseothricin עשוי להיות beneficial לקדם התאוששות של transformants. לאחרונה, פלסמיד שלם ואינטגרצית קלטת PCR מחוץ למיקום גנומי המיועד מתרחש בתדרים נמוכים ב קנדידה וגם יגרמו לצמיחת מושבה. לפיכך, יש צורך לנתח כל מושבות טרנספורמציה ידי PCR באמצעות פריימרים שמחוץ לרצף המשמש אינטגרציה. עבור transformants כי מאומתים על ידי PCR אבל אינם מציגים הקרינה על ידי מיקרוסקופ, ניתוח כתם המערבי של lysates תא וסדר צריך להיחשב להמשיך לחקור את הסיבה לבנייה או כישלון ויזואליזציה. בנוסף השלבים הקריטיים הללו, ישנם מספר צעדים בפרוטוקול זה יכול להיות שונה, אם יש צורך בכך, כדי לשפר את יעילות שינוי ולהגדיל את תדירות אינטגרצית קלטת נכונה. מדריך פתרון בעיות מובא בלוח 2.
ישנן מגבלות פוטנציאליות של טכניקה זו שאפשר לשפר עבור יישומים עתידיים. lithiuשיטה יצטט מ המשמשת תוצאות טרנספורמציה דנ"א יעילות נמוכה (~ 1-2% של מושבות הוקרן הכילו אינטגרציה נכונה) עבור C. 12 parapsilosis, לעומת ג אלביקנס. Electroporation היא גישה חלופית לליתיום הטרנספורמציה תצטט שעשויה לשפר את יעילות הטרנספורמציה 13. שימוש terminator ADH1, בעוד הכרח שיטת תיוג אוניברסלית, עשוי לשנות את היציבות ו / או תקנה של mRNA שנוצר מזה היה אמור להתרחש עם רצף terminator ילידים. בעיה פוטנציאלית זו צריכה להילקח בחשבון כאשר פונקצית יליד חלבון חשובה על שאלת המחקר הספציפית. עבור חלבוני היתוך ניאון אשר מתבטאים ברמות נמוכות, מיקרוסקופיה מושבה כולה לזהות או מסך עבור transformants המוצלח לא יכול להיות אופציה. במקרה זה, PCR וניתוחים כתמים מערביים יספקו ראיות sequ חלבון היתוך מוצלחבניית ence / חלבון. מגבלה, המשותפות לכל מבני חלבון ההיתוך, הוא כי תגי epitope יכולים להפריע לתפקוד יליד החלבון, וכתוצאה מכך פנוטיפים מוטנטים לא מכוונים, כולל לוקליזציה החריגה של חלבון ההיתוך. בחינת סוגיות אלה חשובה בקרות מתאימות יש לכלול כמצוין.
פלסמידים שימושיים להפקת תגי epitope ב קנדידה ידי גישת PCR בתיווך זו, בנוסף לאלה שהוזכרו כאן, נוצרו בעבר על ידי קבוצות המחקר שלנו זמינים לחוקרים באמצעות מרכז Stock הגנטיקה פטרייתיים (http: //www.fgsc. נֶטוֹ). מידע נוסף על מספר של פלסמידים אלה ניתן למצוא גם ב (http://www6.tau.ac.il/berman/). פלסמידים זמינים כוללים מספר עצום של שילובים של סמני התנגדות תזונתיים וסמים, רצפי FP ליצור שמרים בצבעים שונים, אפשרויות תג epitope אחרות (HA, myc, V5, HIS9) כדי לייצר חלבוני arדואר מתויג בבית או רצפי carboxy- או אמינו-טרמיני, אמרגן לביטוי מכונן regulatable של חלבונים. פלסמידים המכילים סמנים עמידים לתרופות שאינם מועילים במיוחד בתחום בפתוגנזה פטרייתי כמו הכלי הזה מאפשר את השינוי והלימוד של זני שמרים קליניים כי הם prototrophic, טיוח סמנים תזונתיים קונבנציונליים שמישות. בניית הזנים קליניים קנדידה כי לזרוח באורכי גל שונים תהיה שימושית עבור מגוון רחב של מבחני תא ביולוגי הדורשים את היכולת לדמיין ולבדל זני שמרים מרובים שיתוף תרבות.
מחלה פטרייתית פולשנית עקב קנדידה מינים ממשיכה להיות אתגר לבריאות האדם משמעותי שקשה לטפל והיא קשורה עם תחלואה ותמותה גבוהים, בעיקר בחולים מדוכאי חיסון 14, 15. לכן, כלים מולקולריים המאפשרים מחקרERS ליותר במהירות ובקלות ללמוד אינטראקציות בין מאכסן מיני קנדידה חשובות וחיוני לקידום הבנתנו מנגנוני ביולוגית קנדידה בפתוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים נ דין למתן את רצף FP mCherry המקורי, מ 'Gerami-נג'אד לבנייה של פלסמידים, ב לארסון לקבלת סיוע טכני, וט Heisel עבור עצות מועילות במהלך הפיתוח של הפרויקט הזה. JB נתמכה על ידי בפרס מתקדם המועצה האירופית למחקר 340,087 (RAPLODAPT). מערכות מיקרוסקופיה הדמיה נמסרו על ידי אוניברסיטת קרן Pediatrics מינסוטה ואוניברסיטת מרכז הדמיה מינסוטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
- Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
- Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
- Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
- Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
- Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
- Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
- Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
- Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
- Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
- Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
- Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
- Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).
