Summary
PCR aracılı gen modifikasyonu görselleştirme ve maya hücreleri ve proteinleri kantitatif kolaylaştırır Candida türleri, floresan protein füzyonları oluşturmak için de kullanılabilir. Bu yazıda, Candida parapsilosis bir floresan protein füzyon (Eno1-FP) oluşturmak için bir strateji sunmak.
Abstract
Candida türleri, bağırsak ve genitoüriner yolun yaygın sömürgeciler, insanlarda invaziv fungal enfeksiyonların çoğunun nedenidir. Böylece, moleküler ve genetik araçlar Patogenezleri mekanizmalarının çalışmasını kolaylaştırmak için ihtiyaç vardır. PCR aracılı gen modifikasyonu da tespit edilmesi için epitop etiketli proteinlerin üretilmesi için basit ve hızlı bir yöntemdir. Özellikle, floresan proteini (FP) füzyonlar sırasıyla floresan mikroskopi ve immunoblotting, hem maya hücreleri ve protein görselleştirme ve kantitatif sağlayan güçlü araçlardır. Candida türleri dönüşümünü kolaylaştırır beslenme marker genleri ile birlikte, AP kodlama dizileri ihtiva eden plasmidler, Candida AP yapı ve ifade amacıyla oluşturulmuştur. Bu yazıda, bir Candida türlerinin bir AP füzyon oluşturmak için bir strateji sunmak. nourseothricin dayanıklı iş içeren plazmidlerya da yeşil, sarı, veya kiraz FP (GFP, YFP, MCherry) bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 'de gene özel sekansları içerir primerler ile birlikte kullanıldığı bir AP kaseti oluşturmak için dizilerin birlikte ım transformasyon işaretleyici gen (NAT1) . Bu gen spesifik kaseti, homolog rekombinasyon yoluyla, ilgili gen mahalinin 3'-ucuna entegre yeteneğine sahiptir. ilgi konusu gen lokusu içerisine AP dizisinin başarıyla çerçeve füzyonu mikroskopi ve / veya immüno-saptama yöntemleri ile füzyon proteini ifade analizi, ardından genetik doğrulanır. Buna ek olarak, yüksek ölçüde sentezlenen proteinlerin durum için başarılı füzyonlar flüoresan görüntüleme teknikleri ile öncelikli olarak taranabilir.
Introduction
Candida türleri bütün insanların bağırsak ve genitoüriner yolları kolonize ortakçı mantarlardır. Öyle ki erken doğum ya da kanser tedavilerinden immünsupresif etkileri ile ortaya gibi immün yetmezlik koşulları altında, Candida türleri fırsatçı patojenler olabilir. Candida türlerinin, Candida albicans en yaygın mantar kolonize olup invaziv mantar enfeksiyonlarının çoğunluğu neden olur. Böyle C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, ve C. gibi diğer Candida türleri, bazı sergileyen içsel direnç, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ciddi enfeksiyonlara neden kruseii yaygın Dolayısıyla böyle flukonazol ve amfoterisin B gibi anti-mantar kullanılan antibiyotiklere bu türlerin bazı enfeksiyonları özellikle de anti-mantar maddeleri ile profilaktik olarak tedavi edilen hastalarda daha sık rastlanmaktadır. Hatta uygun ve zamanında a ilenti-mantar tedavisi, invaziv Candida enfeksiyonları önemli morbidite ve mortalite 1 ile ilişkili olmaya devam etmektedir. Çünkü İnsan sağlığı Candida türleri önemi, bunların patogenezi düzenekleri ve iyi açıklanması izin hazır moleküler araçlar için bir ihtiyaç vardır.
Araştırmacılar görselleştirmek ve mikrobiyal hücrelerin ve ifade proteinlerin ölçmek için olanak sağlayan bir önemli bir araçtır FP füzyon teknolojisidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aracılık ettiği gen modifikasyonu, bu yazıda tarif edildiği gibi AP dizileri ve genomik ilgilenilen sekansını kodlayan bir Candida proteini arasındaki füzyonlar yapımına izin verir. Yapının istikrarlı entegrasyon protein ifade analizinin yanı sıra protein yerelleştirme dinamikleri kolaylaştırır. AP dizilerini içeren plazmidler, Candida albicans içinde ekspresyon için optimize edilmiş ve PCR aracılı g kullanılabilenen modifikasyonu strateji, daha önce 2, 3, 4, 5, inşa edilmiştir. C. albicans, C. parapsilosis, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tarafından tutulan bir besin marker genine bağlanmış bir AP sekansı: plazmidler AP dönüşüm "kaset" içerir. Şu anda mevcut plazmidler seçilebilir beslenme oksotrofik suşlarının transformasyonu için marker genleri (URA3, HIS1, ARG4) yanı sıra oksotrofilerinin yoksun klinik suşların dönüşmesini kolaylaştırmaktadır baskın bir ilâç rezistans markeri (NAT1), çeşitli içerir. Buna ek olarak, plazmidler yello dört farklı FP dizilerinin (yeşil [GFP], seçenekler içeriyor[YFP] W, mavi [CFP] ve kiraz [MCherry]) ve karboksi-termini, proteinin füzyonlarının inşa, veya amino-terminal protein füzyonları yapımı için bir promotör sekansı için bir ADH1 sonlandırma dizisi ya da. Primerler, AP kaseti çevreleyen plasmid DNA'sına homoloji ile tasarlanmıştır. Buna ek olarak, primerler ayrıca, homolog rekombinasyon (Şekil 1) aracılığı ile genomik lokusuna kaset tümlemeyi kolaylaştırır etiketlenecek olan maya geninin homoloji taşıyan 5'-uzantısı dizilerini ihtiva etmektedir. Gen spesifik AP kasetleri, PCR ile üretilen ve daha sonra, lityum asetat ile işlenmesi suretiyle DNA alımı için, yetkin hale getirilmiştir Candida hücrelerine transforme edilmiştir.
Şekil 1: FP dizisi füzyonları Candida türlerinin oluşturulur nasıl diyagramı. (A) plazmid DNA dahil olmakes bir AP dizisi ve direnç (NAT1) nourseothricin bir dizi kodlama. İleri (FWD) ve ters (REV) primerleri rölatif konumları plazmid dizisinin homoloji bölgesini gösteren primerler ve gene-özel homoloji bölgesini ya da primer uzaması gösteren mor kısımların siyah bölümleri ile gösterilir. (B) AP kasetleri Candida dönüştü ve homolog rekombinasyon (noktalı çizgiler) üzerinden ENO1 genomik içinde entegre edilmiştir. ENO1 3 'ucunda AP füzyon sekansı Elde edilen (C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu yazıda, Candida türlerinin protein füzyon (Eno1-FP) yapıların bir örnek sunuyoruz. Biz GFP, YFP kodlayan diziler ile birlikte NAT1 dönüşüm işaretleyici geni içeren plazmidler etiketleme, ya da kullanmakMCherry (Şekil 2). Bu plazmidler, karboksi-terminalinde FPS kaynaşık Eno1 ekspresyonu ile sonuçlanan ENO1 3'-ucuna FP kaynaşmasını kolaylaştırmak gene özel kasetleri oluşturmak için PCR primerler ile birlikte kullanılmıştır.
Şekil 2: FP kaset içeren plazmid Haritalar. İleri (F) ve plazmidlerden kasetleri oluşturmak için kullanılan geri (R) primerleri plazmidler kendi homoloji göreli konumu ile birlikte gösterilir. Tablo 1 'de gösterildiği gibi olan primer sekanslarıdır. F1 ve R1 de pYFP- NAT1 kasetini oluşturmak için kullanıldı. YFP- NAT1 kaseti (pMG2263) içeren plazmid, GFP dizisinin yerine YFP dışında pMG2120 aynıdır. Kaset boyutları: GFP-NAT1, 3.7 kbp; mCherry- NAT1, 3.2 kbp'lik; YFP- NAT1, 3.7 kbp. Bu rakam, Gerami-Nejad, ve ark modifiye edilmiştir. 4 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
E. coli 1. İzole Şablon Plazmidler
- Çalkalanarak 37 ° C'de 10 mi lizojeni etsuyu (LB) + 200 mg / l ampisilin (amp) 'de bir gece boyunca şablon plazmiti içeren E. coli büyütün.
- 2 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj Hasat hücreleri.
- , Sıvı boşaltacaktır izole etmek ve Ausubel ve diğerleri daha önce tarif edildiği gibi E. standart bir yöntemle coli hücreleri DNA saflaştırılması. 8.
- 50-100 ng / ml çalışma konsantrasyonunda Tris-EDTA (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0 TE) içinde yeniden süspanse DNA.
2. Tasarım Astarlar
| astar boya | primer sekans |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan astar dizilerini sıralamaktadır. Kalın, italik yazı ENO1 genomik homoloji gösterir, normal yazı tipi bölgeler DNA plazmid homologdur.
- <Li> Tasarım primerleri kaseti çevreleyen sekansları genin genomik rekombinasyonu kolaylaştıran ilgi konusu hedef gen (örn ENO1) 3'-ucuna ve amplifiye edilecek olan plazmid homolog olduğu (Şekil 2 ve Tablo 1) .
- İleri primer sekansları, son 70 baz çifti, ilgi konusu genin (bp), 5'-3 ', eksi durdurma kodonu eşleşen kodlama çerçevesini korumak için, ayrıca plazma dizinin ilk yaklaşık 30 bp olması emin olun yükseltilir. Not olarak, her bir primer olarak GGTGGTGGTT Resim AP homolojiye sahip bir poli-glisin bağlayıcıdır. Dikkat çekici bir şekilde, bir bağlayıcının yokluğunda, teorik olarak, protein yanlış katlanması, protein üretimi düşük verimle veya bozulmuş biyo yol fonksiyonel alan, doğrudan füzyonu olabilir.
- Ters primer diziler, genin 70 bp hemen alt emin olun 3'-5 ', herhangi bir gen sekansı, ayrıca, son bir yaklaşımı dahilximately plazmid kullanılan beslenme ya da ilaç direnci marker 30 bp.
- Kullanım F1 ve R1 pMG2343 ile mCherry- NAT1 oluşturmak için pMG2120 ve pMG2263 sırasıyla ve F2 ve R2 ile GFP- NAT1 ve YFP- NAT1 kasetleri üretir.
3. PCR ile FP kasetler oluşturun (Gün 1)
- PCR için reaktifler hazırlayın. 1.5 ml tüp aşağıdaki miktarlar ve konsantrasyonlarda eklenmesi ile ana karışımı (500 ul son hacim) sağlayın: 50 ul PCR tampon maddesi (500 mM potasyum klorür, su içinde 100 mM Tris pH 8.0), 20 ul deoksinükleotidler (dNTP, hazır karışımı, 10 mm), 40 ul 25 mM magnezyum klorür nükleotidlerin, 20 ul), 10 ul her ileri ve 10 mM stok çözeltilerinden primer (ters), 30 ul Taq ~ 50-100 ng / ul stok çözeltisinden plazmid (saflaştırılmıştır polimeraz (genel, 5000 birim / ml) ve 320 ul su.
- 10 PCR compatib her birine ana karışımı Kısım 50 ulle 0.5 ml tüpler.
- aşağıdaki adımları PCR PCR tüpleri yerleştirin ve çalıştırın: 1 devir dk 5 94 ° C'de dsDNA denatüre etmek; 94 ° C'de 45 saniye 40 döngü, ardışık olarak 55 ° C'de 30 saniye primerler plasmid şablonu DNA tavlanmasına izin verecek ve DNA ürünleri uzatılması için 68 ° C'de 4 dak; ve 72 ° C'de 15 dakika için 1 son uzatma döngüsü.
NOT: PCR master mix ve bisiklet parametreleri kullanılan özel Taq polimeraz dayalı modifiye edilmesi gerekebilir. - Havuz 1.5 ml tüp içinde 10 PCR reaksiyonları tüm ürünler.
- agaroz jel elektroforezine toplanmış PCR ürünü konusu 5 ul bir DNA merdiveni mukayesesine dayalı bir amplikon boyutunu doğrulamak ve ürün konsantrasyonunun tahmin elde edildi. Genel olarak, takip eden her bir dönüşüm karışımı kaseti DNA ~ 250 ug kullanımı.
- ürün 750 ul% 95 etanol ile, ardından 50 ul 3 M sodyum asetat eklenerek DNA hızlandırabilir ve en az 30 dakika süreyle inkübe-20 ° C'de
- 10 dakika boyunca 16.000 xg tüp santrifüj edilerek PCR ürünleri hasat. Dikkatle çıkarın ve süpernatantı atmak ve bir gecede pelet kurulayın. 40 ul TE pH 8.0 içinde kurutulmuştur DNA kasetinin pelletini ve kullanılana kadar oda sıcaklığında saklayın.
4. FP DNA kasetleri ile Candida Hücreler Transform
- 1. Günde, maya suşu geri adenin (İpad) agar ile maya Pepton Dekstroz üzerine bir kaç kazınmış kristaller çizgiler ile 30 ° C'de inkübe ile (-80 ° C), hazır dondurulmuş% 15 gliserol transforme edilecek. Koloni büyüme çıktıktan sonra, hava alabilir bir kap ile camdan yapılmış bir kültür tüp içinde 2 ml sıvı İpad ortam içine tek bir koloni inoküle ve ajitasyon ile 30 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edilir.
- 2. günde, hava alabilir bir kapaklı 125 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 50 ml (son OD 600 ~ 0.2), taze İpad gece boyunca maya kültürü 300 ul seyreltilir. 30 ° C 'de çalkalanır(nihai OD ~ 0.6-0.8 600) ~ 3 saat.
- 50 ml'lik konik tüp içine gecede kültür dökün ve bir masa üstü santrifüj 1 500 xg'de 5 dakika boyunca iplik pelet hücreleri.
- dökün ve düzgün süpernatant atın. 5 ml su içinde hücre pelletini. bir masa üstü santrifüjü içinde 1,500 xg'de 5 dakika boyunca yeniden santrifüjlenerek hücreler yeniden pelet.
- dökün ve düzgün süpernatant atın. 1.5 ml tüp aktarma sırasında 500 ul TELiAc (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.1 M lityum asetat TE lityum asetat) 'de tekrar süspansiyon hücreleri. bir mikrosantrifüj içinde 3000 x g'de 2 dakika süre ile boru santrifüjleyin.
- 250 ul TELiAc yeniden süspanse hücreleri. pelet dahil toplam hacim ~ 300 ul olmalıdır.
- Temiz (4.2.4'te farklı mikrofüj tüpüne) için, 5 ul bir taşıyıcı DNA (10 mg / ml) ve (4.2.4 den) hazırlandı Candida hücrelerinin 150 ul ekle. Bu t negatif kontrolütransformasyonu.
- ikinci temiz bir mikrofüj tüpüne, denatüre bir taşıyıcı DNA 5 ul (yani, 10 dakika boyunca 90 ° C'de kaynatıldı ve 4 ° C'ye soğutulmuş), (3.3.1 arasında) hazırlanan PCR ürününün 40 ul ve 150 ekleme (4.2.4 den) hazırlandı Candida hücrelerinin ul.
- Oda sıcaklığında 30 dakika için iki transformasyon karışımları inkübe edin.
- Her bir dönüşüm karışımı tüp, 700 ul LEVHA karışımı (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0,% 50 polietilen glikol 3350 içinde 0.1 M lityum asetat) ekleyin. karıştırın ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe Tüpler haricindekileri.
- Gün 3, dönüşüm 1 saat 42 ° C (ısı şoku) de karışımları kuluçkaya yatmaktadır.
- Santrifüj dönüşümü bir mikrosantrifüj 16.000 xg'de 30 sn karıştırır. Çıkarın ve düzgün süpernatant atın. hücrelere zarar vermemek üzere yavaşça pipetleme 150 ul su içinde hücre peletlerinin her yeniden süspanse edin ve.
- dönüşümler ut içinauxotrophic marker genleri (örneğin URA3) ilizing, uygun seçici ortam agara çözüm pipetle (örneğin eksik üridin) tarafından her bütün karışımı plaka ve eşit steril cam boncuklar kullanarak karışımı yayıldı.
- Burada tarif edildiği gibi nourseothricin direnç marker genini (NAT1) kullanılarak dönüşümleri için, levha dönüşümü seçici olmayan İpad agar üzerine ilk karışımları ve 6-12 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. stres nourseothricin önce hücre kurtarma sonrası ısı şok Bu adım yardımcıları, uygulanır.
- Kısmi büyüme İyileştikten sonra, İpad üzerine kopya plaka Candida hücreleri, 400 ug / ml nourseothricin içeren. Beslenme marker genleri (örneğin, URA3) kullanılarak dönüşümler için, bu ara kaplama adımı gerekli değildir ve hücreler, 4.4.2 tarif edildiği gibi seçici bir maya ortamı (örneğin İpad yoksun üridin) üzerine kaplanabilir.
NOT: dönüşüm başarılı olursa, colonies bir ila üç gün içinde ortaya çıkar (potansiyel olarak nourseothricin içeren agar üzerinde seçim için büyümesinin beş gün kadar) gerekir. Hiçbir koloniler tek başına (negatif kontrol) taşıyıcı DNA içeren dönüşüm karışımları ile yayılan plakalar üzerinde görünmelidir.
- okzotrofik ve nourseothricin işaretçi seçimi, taze seçici ortam agar plakalarına tek koloniler olarak çizgi Putatif transformantlar ve FP füzyonlar kurulmasında taranabilir maya hücreleri yaymak için 30 ° C'de inkübe edin.
- Ekran transformantlar etiketleme kasetinin doğru entegrasyon (ayrıntılı örneğin Örnek sonuçlar). ilgi konusu genin yeterli miktarda ifade edilirse, bütün koloni floresans floresans saptama yeteneğine sahip bir plaka görüntüleme sistemi kullanılarak potansiyel aday entegranlarm tespit etmek mümkün olduğu gibi meydana gelebilir.
- PCR outsid dizileri ile homolog primerler kullanılarak varsayımsal entegranlarm Girişentegrasyon bölgesinin e hedef gen füzyonu teyit etmek için.
- Buna ek olarak, Batı füzyon proteininin ekspresyonu ve boyutunu belirlemek için benek analizi, hem de bilinen durumunda, protein lokalizasyonu görsel doğrulama için, tek hücre floresan mikroskobu düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir örnek olarak, bir C parapsilosis laboratuar suşunda Eno1 GFP ve MCherry füzyonları oluşturmak için yukarıda tarif edilen protokol kullanılmıştır. Her varsayımsal dönüştürücü ilk büyüme için tekrar boyandı edildi. Elde edilen füzyon proteini, yüksek (enolaz) olarak ifade edilir ve Çerçeve parlak olduğundan, bu örnekte, (Şekil 3) daha önceki tanı PCR gerçekleştirmeden floresan mikroskobu ile transformantların taranması mümkün 6.
Şekil 3: Candida transformantların tarafından sergilenen Koloni floresan. maya plaka büyüme Temsilcisi görüntüleri görüntüye bir Cy3 filtresi MCherry ifade eden zorlanma ve görüntü YFP- ve GFP ifade suşları bir Cy2'nin filtresi ile donatılmış bir lazer tarama sistemi kullanılarak elde edilmiştir. Her çiftteki Sol panel, FP-expressisuşları ng; Her çift sağ panel, ilgili FP ifade eden gerginlik aynı filtre ile görüntülenmiş dönüştürülmemiş ebeveyn suş (4175). görselleştirme sonra, resim tersine çevrilmiş ve parlaklık ve kontrast AP-ifade eden ve kontrol suşu için aynı şekilde ayarlanmıştır. Bu rakam ark Gonia, izniyle edilir. 6 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Genomik DNA, bu varsayımsal transformantların her birinden 9 izole edilmiş ve (F ve R amaçlanan genomik olan tavlama etiketlenecek primerleri burada dışında örneğin dizileri) kaset entegrasyon alanlarını yandan kuşatan dizilere tamamlayıcı primerler ile birlikte, DNA şablonu olarak kullanıldı , tanı PCR reaksiyonlarında FP kasetinin doğru entegrasyonunu doğrulamak için sadece prilgi geninin durdurma kodonunun IOR. C lityum asetat dönüşümler için not, bir. C. albicans dönüşümler ile bizim deneyim ile karşılaştırıldığında parapsilosis, biz (~ ekranlı kolonilerin% 1-2 doğru entegrasyon bulunan) alt verimlilik gözlendi.
enolaz lokalizasyonu analiz etmek için Eno1-FP GFP, YFP ve Texas Kırmızı filtre setleri ile 100 W cıva lambası ve Epifloresans aydınlatma ile donatılmış bir Fotomikroskop kullanarak floresan mikroskobu ile inşa ifade maya hücreleri gözlendi. Bir yükle-birleştirilmiş cihaz (CCD) kamera görüntü analizi yazılımı (Şekil 4A) 6 işlenmiş görüntüler toplamak için kullanılmıştır. Ayrıca, görsel olarak bir karışım (Şekil 4B) 6 içinde farklı maya suşları ayırt etmek için farklı AP renk yararlı olduğunu bulmuşlardır. enolaz yüksek ölçüde sentezlenen ve yer aldığı içinmaya hücresi büyük bir kısmı, kendisine AP füzyonları Candida -host etkileşimi analiz kolayca örneğin görselleştirilebilir flüoresan maya suşları, oluşturmak için kullanılabilir.
Şekil 4: İfade ve floresan mikroskobu ile Eno1-FP füzyonlarının lokalizasyonu. (A) Floresans (üst) ve diferansiyel girişim kontrast (DIC, alt) Candida suşları için resim Eno1 FPS eksprese. C. albicans, C. parapsilosis olarak Eno1-FP, ancak daha düşük bir dereceye kadar, çekirdekte ve sitoplazmada konsantre eğilimindedir. (B) Eno1 mCherry ve Eno1-GFP ifade Candida suşlarında karışık bir kültüründe mikroskobik ve görüntüler. Sağ panel, Teksas kırmızı filtre; merkez paneli, GFP filtresi; sağ panel, DIC görüntü ile hem floresan panellerin birleştirme. Ölçek çubukları = 10 um. Bu rakam ark Gonia, izniyle edilir. 6 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
AP füzyonları batı lekeleme ile protein sentezleme seviyeleri analizi kolaylaştırır. Yukarıda tarif edilen protokol ile üretilen maya hücreleri kullanılarak, proteinler, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılmış hücre lizatları, izole edilmiş ve bir poliviniliden difluorür (PVDF) membrana 10 aktarılmıştır. Eno1-AP füzyon önce 6 tarif edildiği gibi, ticari olarak mevcut antikorlar kullanılarak lekeleme tespit edildi. Kısaca, fare anti-GFP (1: 2,000 seyreltme), bayır turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG, ardından (1: 10,000 seyreltme) antikorları GFP- ve YFP-ta problanması için kullanılmıştırgged enolaz. Tavşan anti-MCherry (1: 2,000 seyreltme) yabanturpu peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan IgG, ardından (1: 10,000 seyreltme) antikorları MCherry etiketli enolaz problanması için kullanılmıştır. Tüm füzyon proteinlerinin, hali hazırda başarılı transformantlar (Şekil 5, şerit 2, 5 ve 7), 6 lisatlanndan algılanabilir ve (bir protein merdiveni standardına göre ve C. albicans enolaz-AP standartlar beklenen boyutta (~ 75 kDa) idi Şekil 5, kuşak 1 ve 6) 6. Sinyal etiketsiz üst maya suşu için gözlenen (Şekil 5, kuşak 3 ve 4) ve 6.
Şekil 5: Candida suşlarından hücre lizatları immünoblot. Şerit 1, ENO1 -mCherry füzyon ihtiva eden C. albicans (J. Berman, Minnesota Üniversitesi)(Pozitif kontrol); şerit 2, ENO1 -mCherry füzyon ihtiva eden C. parapsilosis; kuşak 3 ve 4, dönüştürülmemiş C parapsilosis ana suş 4175 11 (negatif kontrol); şerit 5, ENO1 -YFP füzyon ihtiva eden C. parapsilosis; şerit 6, ENO1 GFP füzyon (J. Berman, Minnesota Üniversitesi) (pozitif kontrol) içeren bir C. albicans; şerit 7, ENO1 GFP füzyon ihtiva eden C. parapsilosis; Şerit L gösterilen 98 ve 64 kDa proteini standartları protein merdiveni. Yol 1-3, anti-MCherry antikoru ile inkübe edildi ve 4-7 anti-GFP antikor ile inkübe edildi şeritleri edildi. Bu rakam ark Gonia, izniyle edilir. 6 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Protokol Adım / Ürün | değişiklik | Potansiyel İyileştirme (uyarılar) |
| primer tasarımı | ilgili genomik bölgeye homoloji uzun bölgeyi içerecek şekilde primerler uzatmak | bağlama etkinliği ve homolog rekombinasyon iyileştirmek (astar uzunluğu değiştirerek optimal tavlama sıcaklıkları değişebilir) |
| PCR (amplikon kalitesi) | yüksek sadakat Taq kullanın Jel PCR ürünü saflaştırmak | dizisini ve dönüşüm verimini genom astar hedef geliştirmek için kaset dizileri içine hataların giriş azaltın (jel arıtma dolayısıyla Amplikon miktarı ve dönüşüm verimi azalabilir) |
| PCR (amplikon miktarı) | PCR reaksiyonları ve havuz ürünlerin sayısını artırmak | increasdönüştürülmüş hücrelerin E sayısı (çok fazla amplikon de azaltılmış dönüşüm verimliliği neden olabilir) |
| kaset yağış | , 4 ° C'de santrifüj gerçekleştirin buz üzerinde tüm reaktifler ve tüpler tutmak | DNA verimi ve bu nedenle, dönüşüm etkinliğini artırmak |
| Isı şoku | süresini kısaltacak | vurguladı maya hücrelerinin canlılığını artırmak (daha kısa ısı şoku süreleri de hücreler tarafından DNA kasetinin azalmıştır alımı neden olabilir) |
| Kurtarma Büyüme 1 | Agar içeren nourseothricin için kaplama önce İpad agarda uzun kurtarma için izin | nourseothricin maruz kaldığında vurguladı maya hücreleri uzun iyileşme süreleri gerekebilir (uzun inkübasyon süreleri de kirletici ve yanlış pozitif transformant büyüme artabilir) |
| Koloni büyümesine 1,2 | daha uzun süre inkübe (~ 5 d) | Stsıkıştırıldı maya hücreleri koloni büyümesi için uzun inkübasyon süreleri gerekebilir (uzun inkübasyon süreleri de kirletici ve yanlış pozitif transformant büyüme artabilir) |
| Büyümeyi etkileyen genetik mutasyonları içeren maya suşları NAT1 seçimi kalem kullanarak dönüşümlere Özgü 1 veya 2 dönüşümler | ||
Tablo 2: Sorun giderme ve optimizasyonu için yönlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitopa inşası, yukarıda tarif edilen PCR aracılı gen modifikasyonu stratejisi kullanılarak Candida türleri dizilerin üç aşamalı bir süreç olarak özetlenebilir etiketli. İlk olarak, kaset iki maya genomu içine sokulması lokusuna homolog bütünleşme ve bölgeler için istenen dizisini kodlayan PCR ile yapılır. İkinci olarak, transforme edilecek maya hücreleri lityum asetat ve kaset ile birlikte kuluçkaya kimyasal olarak yetkin yapılır. Üçüncü olarak, hücreler, transformantların kurtarmak için seçici ortam üzerinde plakalanır ve elde edilen koloniler istenen genomik lokusuna kaset doğru entegrasyon için test edilmiştir.
C. albicans ve C. parapsilosis bir floresan füzyon proteini elde başarı oranını artırmak için bu protokol kapsamında birçok kritik adımlar vardır. İlk olarak, poliakrilamid jel elektroforez ile saflaştırılmıştır primerlerin kullanımı (PAGE; üretici tarafından) yüksek recrilir. Arıtma olmadan, kaset homolog rekombinasyon ile amaçlanan genomik entegre ile birlikte etkinliğini azaltabilir son üründe hatalı uzunlukları, primerler elde artmış olasılığı vardır. İkincisi, biz PCR ürününün doğru boyutu sağlamak için agaroz jel elektroforezi ile ~ kaset DNA 5 ul analiz ederek, PCR ile üretilen etiketleme kaset kaliteli olduğunu doğrulayarak öneririz. Üçüncü olarak, transformasyon için optimize edilmiş maya hücreleri elde etmek için, hücreler kullanımdan önce mikroskopi ile belirgin maya tomurcuklar, büyüme log fazında olmalıdır. Dördüncü olarak, ısı şokundan sonra dönüştürülen maya hücrelerinin tabanda sırasında ve seçici ortam üzerine kaplama önce nazik pipetleme tekniğinin kullanılması şarttır. Beşinci olarak, benef olabilir nourseothricin içeren ortam üzerine replike önce İpad agarı üzerinde büyüme için daha fazla zaman izin maya hücreleri için toksik olan nourseothricin ilgili Transformant seçimi içintransformantların kurtarma teşvik etmek icial. Amaçlanan genomik bölgenin dışında son sağlam plasmidi ve PCR kaset entegrasyonu Candida düşük frekanslarda meydana de koloni büyümesine neden olur. Nedenle, entegrasyon için kullanılan sekans dışında primerler kullanılarak PCR ile bütün dönüştürülmüş koloniler analiz için gereklidir. PCR ile doğrulanır ancak mikroskopi ile floresan sergilemeyen transformantlar için hücre lizatlan ve sıralama Western blot analizi daha da inşaat veya görselleştirme başarısızlığın nedeni araştırmak için dikkate alınmalıdır. Bu kritik adımlara ek olarak, transformasyon etkinliğini geliştirmek ve doğru kaseti entegrasyon sıklığını artırmak için gerekirse değiştirilebilir protokolde çeşitli adımlar vardır. Bir sorun giderme kılavuzu Tablo 2'de sunulmuştur.
gelecekteki uygulamalar için optimize edilebilir, bu tekniğin potansiyel sınırlamalar vardır. lithium asetat yöntemi C daha düşük bir verimlilik DNA dönüşüm sonuçları (~ ekranlı kolonilerin% 1-2 doğru entegrasyon bulunan) için kullanılır. parapsilosis 12, C. albicans ile karşılaştırıldığında. Elektroporasyon dönüşüm verimliliği 13 artırabilir asetat dönüşümü lityum alternatif bir yaklaşımdır. ADH1 terminatörü kullanımı, evrensel bir etiketleme yöntemi için ise gerekli olan, nativ terminatör sekansı ile meydana gelmiş olur olandan stabilitesini ve / ya da oluşturulan mRNA düzenlemesini değiştirebilir. Bir proteinin yerli işlev belirli bir araştırma sorusuna önemli olduğunda bu potansiyel sorun olarak kabul edilmelidir. düşük seviyelerde ifade edilir floresan füzyon proteinleri, tüm koloni mikroskopi tanımlamak veya başarılı transformantlar ekranı bir seçenek olmayabilir. Bu durumda, PCR ve Western lekeleme analizleri başarılı bir füzyon proteini dizisine kanıt sağlayacakence / protein yapı. Tüm füzyon proteini yapılar için ortak bir sınırlama, epitop takıları füzyon proteininin anormal lokalizasyonu dahil istenmeyen mutant fenotipleri ile sonuçlanan, protein doğal fonksiyonuna müdahale olmasıdır. Bu sorunlar göz önünde önemlidir ve belirtilen uygun kontroller dahil edilmelidir.
Bu PCR aracılı yaklaşımla Candida epitop etiketleri üretmek için yararlı olan plazmitleri, burada bahsedilen ek olarak, daha önce araştırma grubu tarafından oluşturulan ve Fungal Genetics Stock Center (HTTP yoluyla araştırmacılara kullanılabilir edilmiştir: //www.fgsc. ağ). Bu plazmid birkaç hakkında daha fazla bilgi de (http://www6.tau.ac.il/berman/) bulunabilir. Mevcut plazmidler, AP dizileri farklı renkli maya, diğer epitop etiketi seçeneklerini oluşturmak için besin ve ilaç direnci belirteç kombinasyonlarının sayısız içeren (HA, myc, V5, HIS9) ar proteinleri üretmek içinE proteinlerinin yapısal ve regüle edilebilir ekspresyon için karboksi- veya amino-termini ve hızlandırıcı sekansları, ya da etiketlenmiş. Bu araç, prototropik olan kullanılamaz alışılmış beslenme işaretleri veren klinik Maya türlerinin dönüştürülmesi ve çalışma için izin verdiği ilaç dirençli işaretleyiciler ihtiva eden plasmidler, mantar patojenez alanı ile özellikle yararlıdır. Farklı dalga boyunda floresan klinik Candida suşunun yapımı görselleştirme ve ko-kültür birden fazla maya suşları ayırt etmek için yetenek gerektiren hücre biyolojik tahlillerin çeşitli yararlı olacaktır.
Nedeniyle Candida türlerinin invaziv mantar hastalığı, özellikle immün sistemi baskılanmış hastalarda 14, 15 tedavisi zordur ve yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkili önemli bir insan sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Böylece, bu moleküler araçlar araştırmayı iziners daha hızlı ve kolay bir Candida türleri-konak ilişkileri Candida biyoloji ve patogenezi mekanizmaları anlayışımızı ilerletmek için hayati önem taşımaktadır incelemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz orijinal MCherry FP dizisi sağlamak için N. Dean teşekkür M. Gerami-Nejad plasmidlerin yapımı için, bu projenin geliştirilmesi sırasında yararlı tavsiyeler için teknik yardım B. Larson ve T. Heisel. JB Avrupa Araştırma Konseyi İleri Ödülü 340.087 (RAPLODAPT) tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi ve görüntüleme sistemleri Minnesota Pediatri Vakfı Üniversitesi ve Minnesota Görüntüleme Merkezi Üniversitesi tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
- Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
- Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
- Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
- Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
- Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
- Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
- Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
- Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
- Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
- Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
- Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
- Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).
