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Genetics

Generación de fusiones de proteínas fluorescentes en Published: March 4, 2017 doi: 10.3791/55333

Summary

La modificación genética mediada por PCR se puede utilizar para generar fusiones de proteínas fluorescentes en especies de Candida, lo que facilita la visualización y cuantificación de células de levadura y las proteínas. Aquí, se presenta una estrategia para la construcción de una fusión proteína fluorescente (Eno1-FP) en Candida parapsilosis.

Abstract

Las especies de Candida, colonizadores frecuentes de los tractos intestinal y genitourinario, son la causa de la mayoría de las infecciones fúngicas invasivas en seres humanos. Por lo tanto, se necesitan herramientas moleculares y genéticos para facilitar el estudio de sus mecanismos de la patogénesis. la modificación genética mediada por PCR es un método sencillo y rápido para generar proteínas etiquetadas con epítopo para facilitar su detección. En particular, la proteína fluorescente (FP) fusiones son herramientas poderosas que permiten la visualización y cuantificación de ambas células de levadura y las proteínas por microscopía de fluorescencia y la inmunotransferencia, respectivamente. Los plásmidos que contienen secuencias de codificación de PF, junto con los genes marcadores nutricionales que facilitan la transformación de las especies Candida, se han generado con el propósito de la construcción FP y expresión en Candida. Aquí, se presenta una estrategia para la construcción de una fusión FP en una especie de Candida. Los plásmidos que contienen el sold nourseothricinna vez que el gen marcador de transformación (NAT1) junto con secuencias para cualquiera verde, amarillo, o de cerezas FPS (GFP, YFP, mCherry) se utilizan junto con los cebadores que incluyen secuencias de genes específicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar un módulo de FP . Este casete de genes específicos tiene la capacidad de integrar en el extremo 3 'del locus del gen correspondiente a través de recombinación homóloga. El éxito de fusión en el marco de la secuencia de FP en el locus de gen de interés se verifica genéticamente, seguido por el análisis de la expresión de proteína de fusión por microscopía y / o métodos de inmunodetección. Además, para el caso de proteínas altamente expresados, fusiones exitosas pueden ser examinados para principalmente por técnicas de imagen de fluorescencia.

Introduction

Las especies de Candida son comensales hongos que colonizan el tracto intestinal y genitourinario de todos los seres humanos. En condiciones de inmunodeficiencia, tales como que se producen con el nacimiento prematuro o efectos inmunosupresores de los tratamientos para el cáncer, las especies de Candida pueden llegar a ser patógenos oportunistas. De las especies de Candida, Candida albicans es el colonizador fúngica más frecuente y causa la mayoría de las infecciones fúngicas invasivas. Otras especies de Candida, como C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. También kruseii causan infecciones graves en pacientes inmunocomprometidos, con alguna resistencia intrínseca que presenta a los antibióticos comúnmente utilizados antifúngicos como fluconazol y anfotericina B. Por lo tanto, las infecciones con algunas de estas especies están siendo observados con mayor frecuencia, especialmente en pacientes que están siendo tratados profilácticamente con agentes anti-hongos. Incluso con una apropiada y oportunanti tratamiento de las infecciones fúngicas, infecciones invasivas por Candida continúan siendo asociado con morbilidad y mortalidad significativa 1. Debido a la importancia de especies de Candida en la salud humana, existe una necesidad de herramientas moleculares fácilmente disponibles que permiten el estudio y la elucidación de sus mecanismos de la patogénesis.

Una herramienta importante que permite a los investigadores visualizar y cuantificar las células microbianas y las proteínas que se expresan es la tecnología de fusión FP. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la modificación genética mediada, tal como se describe en este documento, permite la construcción de fusiones, entre las secuencias de PF y una proteína de Candida secuencia codificante de interés en su locus genómico. La integración estable de la construcción facilita el análisis de la expresión de proteínas, así como la dinámica de localización de proteínas. Los plásmidos que contienen secuencias de PF, optimizados para la expresión en Candida albicans y que se pueden utilizar en la g mediada por PCRestrategia de modificación eno, se han construido previamente 2, 3, 4, 5. Los plásmidos contienen FP transformación "casetes": una secuencia FP ligado a un gen marcador nutricional que facilita la transformación de C. albicans y C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. Actualmente plásmidos disponibles contienen una variedad de genes marcadores seleccionables nutricionales (URA3, His1, ARG4) para la transformación de las cepas auxotróficas, así como un marcador de resistencia dominante fármaco (NAT1), que facilita la transformación de cepas clínicas que carecen de auxotrophies. Además, los plásmidos que contienen opciones para hasta cuatro secuencias diferentes (FP verde [GFP], yellow [YFP], cian [PPC], y cereza [mCherry]) y, o bien una secuencia de terminación de ADH1 para la construcción de fusiones de proteínas carboxi-terminal, o una secuencia promotora para la construcción de fusiones de proteína amino-terminal. Los cebadores están diseñados con homología con el plásmido de ADN que rodea a la casete de FP. Además, los cebadores también contienen secuencias 5 'de extensión que llevan homología con el gen de levadura de interés para ser marcados, lo que facilita la integración del casete en el locus genómico mediante recombinación homóloga (Figura 1). Cassettes de PF de genes específicos son generados por PCR y luego se transformaron en células de Candida hechas competentes para la captación de ADN por tratamiento con acetato de litio.

Figura 1
Figura 1: Diagrama de cómo FP fusiones de secuencia se generan en las especies de Candida. (A) El ADN del plásmido INCLUYENDOes una secuencia FP y una secuencia que codifica resistencia nourseothricin (NAT1). ubicaciones relativas de Forward (FWD) y atrás primers (REV) se muestran, con partes negras de los cebadores que indica la región de homología con la secuencia del plásmido y las porciones de color púrpura que denotan la región de homología con el gen específico o extensión del cebador. Casetes (B) de PF se transforman en Candida y se integran dentro del locus genómico ENO1 mediante recombinación homóloga (líneas de puntos). (C) resultante secuencia de fusión FP al extremo 3 'de ENO1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, se presenta un ejemplo de construcciones de proteínas de fusión (Eno1-FP) en especies de Candida. Nos utilizan referencia de plásmidos que contienen el gen marcador de la transformación NAT1 junto con secuencias que codifican GFP, YFP, omCherry (Figura 2). Estos plásmidos se utilizan junto con cebadores en PCR para generar casetes de genes específicos que facilitan la fusión de los programas marco para el extremo 3 'de ENO1, lo que resulta en la expresión de Eno1 fusionado a programas marco en su extremo carboxi-terminal.

Figura 2
Figura 2: Mapas de los plásmidos que contienen cassettes-PF. Forward (F) y atrás primers (R) utilizados para generar los casetes de los plásmidos se indican junto con la ubicación relativa de su homología con los plásmidos. Las secuencias de cebador son como se indica en la Tabla 1. F1 y R1 también se utilizaron para generar el casete pYFP- NAT1. El plásmido que contiene el casete YFP- NAT1 (pMG2263) es idéntica a pMG2120 con la excepción de YFP en lugar de la secuencia de GFP. Los tamaños de casete: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kpb; YFP- NAT1, 3.7 kpb. Esta cifra ha sido modificado a partir de Gerami-Nejad, et al. 4 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. Aislar Plantilla plásmidos de E. coli

  1. Crecer E. coli que contiene el plásmido de plantilla durante la noche en 10 ml de caldo de lysogeny (LB) + 200 mg / l de ampicilina (AMP) a 37 ° C con agitación.
  2. Cosecha células por centrifugación a 6.000 xg durante 2 min.
  3. Decantar líquido, aislar y purificar el ADN de células de E. coli por un método estándar como se describe anteriormente en Ausubel et al. 8.
  4. ADN resuspender en Tris-EDTA (TE; Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0) a una concentración de trabajo de 50-100 ng / ml.

2. diseñar cebadores

Cebador Secuencia Primer
F1 5 ' GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 '
R1 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 '
F2 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG
GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 '
R2 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 '

Tabla 1: Primer secuencias utilizadas en este estudio. Negrita texto en cursiva indica homología con el locus genómico ENO1, las regiones de fuente normal son homólogas al plásmido ADN.

    <li> cebadores diseño sea homóloga al plásmido secuencias que bordean el casete a amplificar, así como para el extremo 3 'del gen diana de interés (por ejemplo, ENO1) para facilitar la recombinación en el locus genómico del gen (Figura 2 y Tabla 1) .
    1. Asegúrese de que las secuencias de cebador directo se ajustan a los últimos 70 pares de bases (pb) del gen de interés, 5'-3 ', menos el codón de parada, para mantener el marco de codificación, además de la primera de aproximadamente 30 pb de la secuencia del plásmido sean amplificado. Como nota, la GGTGGTGGTT en cada cebador es un enlazador de poli-glicina con ninguna homología FP. Es de destacar que, en ausencia de un enlazador, no puede haber fusión directa de los dominios funcionales, que pueden conducir teóricamente a un mal plegamiento de proteínas, bajo rendimiento en la producción de proteínas, o alteración de la bioactividad.
    2. Asegúrese de que las secuencias de los cebadores inversos son 70 pb justo aguas abajo del gen, 3'-5 ', sin incluir cualquier secuencia de genes, además de la última aproximadamente 30 pb del marcador nutricional o resistencia a los medicamentos utilizados en el plásmido.
    3. Use F1 y R1 para generar casetes GFP NAT1 y YFP- NAT1 con pMG2120 y pMG2263, respectivamente, y F2 y R2 para generar mCherry- NAT1 con pMG2343.

3. Generar FP Cassettes por PCR (Día 1)

  1. Preparar los reactivos para la PCR. Hacer una mezcla maestra (500 l de volumen final) mediante la adición de los siguientes volúmenes y concentraciones a un tubo de 1.5 ml: 50 l de tampón de PCR (mM cloruro 500 de potasio, 100 mM Tris pH 8,0 en agua), desoxinucleótidos 20 l (dNTPs; mezcla madre de nucleótidos en 10 mM de cada uno), cloruro de magnesio 40 l 25 mM, 20 l purificados plásmido (de ~ 50-100 ng solución madre / l), 10 l cada uno hacia adelante y el cebador (de 10 mM de soluciones madre reversa), 30 l de Taq la polimerasa (genérico, 5.000 unidades / ml), y 320 l de agua.
    1. Alícuota de 50 l de mezcla maestra en cada uno de 10 PCR-compatiLe tubos de 0,5 ml.
  2. Coloque los tubos de PCR en el termociclador y ejecute los siguientes pasos: 1 ciclo de 5 min a 94 ° C para desnaturalizar ADN de doble cadena; 40 ciclos secuencialmente de 45 segundos a 94 ° C, 30 seg a 55 ° C para permitir que los cebadores hibriden a la plantilla de ADN plásmido, y 4 min a 68 ° C para la extensión de los productos de ADN; y 1 ciclo de extensión final de 15 min a 72 ° C.
    pueden necesitar ser modificado en base a la polimerasa Taq particular, se utiliza la mezcla maestra de PCR y ciclismo parámetros: NOTA.
  3. Piscina todos los productos de las 10 reacciones de PCR en un tubo de 1,5 ml.
    1. Asunto 5 l de producto de PCR agrupada a electroforesis en gel de agarosa para verificar tamaño de amplificación y obtener una estimación de la concentración del producto, basada en la comparación a una escalera de ADN. Generalmente, se utiliza ~ 250 g de ADN de casete en cada mezcla de transformación posterior.
    2. Precipitado de ADN mediante la adición de acetato de 50 l de sodio 3 M, seguido de 750 l 95% de etanol a los productos y se incuba al menos 30 mina -20 ° C.
    3. Cosecha de los productos de PCR mediante la centrifugación el tubo a 16.000 xg durante 10 min. Con cuidado, retirar y desechar el sobrenadante y secar el pellet durante la noche. Resuspender el precipitado casete de ADN se secó en 40 l de TE pH 8,0 y se almacena a temperatura ambiente hasta su uso.

4. transformar células de Candida con FP ADN Casetes

  1. En el Día 1, recuperar cepa de levadura que se transformó de un 15% de glicerol congelado (-80 ° C) de stock de rayas unos pocos cristales raspadas Onto dextrosa de levadura peptona agar con adenina (YPAD) y se incuba a 30 ° C. Después de la recuperación de crecimiento de la colonia, inocular una única colonia en 2 ml de medio YPAD líquido en un tubo de cultivo de vidrio con una tapa transpirable e incubar durante la noche a 30 ° C con agitación.
  2. En el Día 2, diluir a 300 l de cultivo de levadura durante la noche en 50 ml YPAD fresco (a una DO final 600 de ~ 0,2) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con una tapa transpirable. Se agita a 30 ° Cpara ~ 3 horas (a una DO final 600 ~ 0,6-0,8).
    1. Verter el cultivo de una noche en un tubo cónico de 50 ml y sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 1 500 xg en una centrífuga de mesa.
    2. Retirar y desechar adecuadamente el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 5 ml de agua. Re-sedimentar las células por centrifugación de nuevo durante 5 min a 1.500 xg en una centrífuga de mesa.
    3. Retirar y desechar adecuadamente el sobrenadante. Resuspender las células en 500 l TELiAc (TE acetato de litio: 10 mM Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, 0,1 M de acetato de litio) durante la transferencia a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar el tubo durante 2 min a 3.000 xg en una microcentrífuga.
    4. Resuspender las células en 250 l TELiAc. El volumen total incluyendo el sedimento debe ser ~ 300 l.
  3. Para un (diferente tubo de microcentrífuga que en 4.2.4) limpio, añadir 5 l de ADN portador (10 mg / ml) y 150 ml de células de Candida preparados (desde 4.2.4). Este es el control negativo para transformación.
    1. A un segundo tubo de microcentrífuga limpio, añadir 5 l de ADN portador desnaturalizado (que ha sido hervida a 90 ° C durante 10 minutos y se enfrió a 4 ° C), los 40 l de producto de PCR (preparado a partir de 3.3.1) y 150 l de células de Candida preparados (de 4.2.4).
    2. Se incuban las dos mezclas de transformación para 30 min a temperatura ambiente.
    3. A cada tubo mezcla de transformación, añadir 700 l de la mezcla de placa (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, 0,1 M de acetato de litio en 50% de polietilenglicol 3350). Invertir los tubos para mezclar e incubar durante la noche a TA.
  4. En el día 3, se incuba la transformación se mezcla a 42 ° C durante 1 hora (choque térmico).
    1. Se centrifuga la transformación se mezcla durante 30 segundos a 16.000 xg en una microcentrífuga. Retire y deseche adecuadamente el sobrenadante. Resuspender cada uno de los sedimentos de células en 150 l de agua pipeteando suavemente arriba y abajo con el fin de no dañar las células.
    2. Para las transformaciones utilizing genes marcadores auxotróficos (por ejemplo URA3), la placa de cada mezcla todo con la pipeta las soluciones sobre el agar medios selectivos apropiados (por ejemplo, carece de uridina) y extender la mezcla uniformemente con perlas de vidrio estériles.
    3. Para las transformaciones que utilizan el gen marcador de resistencia a nourseothricin (NAT1), como se describe aquí, la transformación placa se mezcla primero en agar YPAD no selectivo y se incuba a 30 ° C durante 6-12 h. Este paso permite la recuperación celular, choque térmico posterior, antes de nourseothricin se aplica esfuerzo.
    4. Después de la recuperación parcial del crecimiento, réplica de la placa las células de Candida Onto YPAD que contiene 400 mg / ml nourseothricin. Para las transformaciones que utilizan genes marcadores nutricionales (por ejemplo, URA3), este paso de recubrimiento intermedio no es necesario y las células puede ser plateado directamente sobre medios selectivos de levadura (por ejemplo YPAD que carece de uridina) como se describe en 4.4.2.
      NOTA: Si la transformación se realiza correctamente, colOnies debería aparecer dentro de uno a tres días (potencialmente hasta cinco días de derivación para la selección en agar que contiene nourseothricin). No hay colonias deben aparecer en placas untadas con mezclas de transformación que contienen ADN portador solo (control negativo).
  5. Para la selección de marcador auxotrófico y nourseothricin, racha transformantes putativos como colonias individuales a placas de agar selectivo de los medios frescos y se incuba a 30 ° C para propagar células de levadura que pueden ser seleccionados para la construcción con éxito de fusiones de PF.
  6. Transformantes de pantalla para la correcta integración de la casete de marcado (ver resultados representativos para un ejemplo detallado). Si el gen de interés se expresa en cantidades suficientes, toda la fluorescencia colonia se puede producir de tal manera que es posible detectar potenciales integrantes candidatos utilizando un sistema de imagen de placa con capacidad de detección de fluorescencia.
    1. Compruebe integrantes putativos mediante PCR utilizando cebadores homólogos a las secuencias outside de la región de integración para confirmar la fusión al gen diana.
    2. Además, tener en cuenta el análisis de transferencia Western para determinar la expresión y el tamaño de la proteína de fusión, así como mediante microscopía de fluorescencia de células individuales para la confirmación visual de la localización de proteínas, si se conoce.

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Representative Results

Como ejemplo, se utilizó el protocolo descrito anteriormente para la construcción de GFP y mCherry fusiones a Eno1 en una cepa de C. parapsilosis laboratorio. Cada transformante putativo se volvieron a sembrar inicialmente para el crecimiento. En este ejemplo, ya que la proteína de fusión resultante es altamente expresado (enolasa) y los programas marco son brillantes, hemos sido capaces de detectar transformantes por microscopía de fluorescencia antes de realizar el diagnóstico de PCR (Figura 3) 6.

figura 3
Figura 3: fluorescencia Colonia exhibida por los transformantes de Candida. Imágenes representativas de la placa de crecimiento de la levadura obtuvieron usando un sistema de barrido láser equipada con un filtro de Cy3 a la imagen de la cepa mCherry que expresan y un filtro a la imagen de Cy2 YFP- y cepas que expresan GFP. Panel de la izquierda en cada par, FP-expressing cepas; panel de la derecha de cada par, cepa parental no transformada (4175) reflejado con el mismo filtro como la cepa FP-expresión correspondiente. Después de la visualización, las imágenes se invirtieron y brillo y el contraste se ajustaron de forma idéntica para FP-expresar y cepas de control. Esta cifra es reimpreso con el permiso de Gonia, et al. 6 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se aisló el ADN genómico 9 de cada uno de estos transformantes putativos y se utiliza como el molde de ADN, junto con cebadores complementarios a secuencias que flanquean los sitios de integración de casete (es decir, secuencias fuera de donde F y R cebadores recocido dentro del locus genómico destinada a ser marcado) , en las PCR de diagnóstico para verificar la correcta integración de la casete de FP solo prIOR al codón de parada del gen de interés. Es de destacar que para las transformaciones de acetato de litio con C. parapsilosis, se observó una menor eficiencia (~ 1-2% de las colonias examinadas contenía una correcta integración) en comparación con nuestra experiencia con C. albicans transformaciones.

Para analizar la localización enolasa, observamos células de levadura que expresan Eno1-FP construye por microscopía de fluorescencia utilizando un fotomicroscopio equipado con una lámpara de mercurio de 100 W y la iluminación de epifluorescencia con GFP, YFP y conjuntos de filtros de Texas Red. Una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) se utilizó para recoger las imágenes que se procesaron con el software de análisis de imágenes (Figura 4A) 6. Además, se encontró que los diferentes colores de PF eran útiles para distinguir visualmente diferentes cepas de levadura dentro de una mezcla (Figura 4B) 6. Debido a que es altamente expresado enolasa y ubicado enuna gran parte de la célula de levadura, FP fusiones a que puede ser utilizado para generar cepas de levadura fluorescentes que pueden ser fácilmente visualizados, por ejemplo, en los análisis de las interacciones de Candida -host.

Figura 4
Figura 4: Expresión y localización de fusiones de Eno1-FP por microscopía de fluorescencia. (A) Fluorescencia (arriba) y el contraste de interferencia diferencial (DIC, parte inferior) imágenes por cepas de Candida expresar Eno1-MF. Eno1-FF en C. albicans y C. parapsilosis tienden a concentrarse en el núcleo como en el citoplasma, pero en un grado mucho menor. (B) Las imágenes microscópicas de un cultivo mixto de las cepas de Candida que expresan Eno1-mCherry y Eno1-GFP. Panel derecho, filtro rojo de Texas; panel central, filtro de GFP; panel de la derecha, fusión de ambos paneles fluorescentes con la imagen DIC. Barras de escala = 10 m. Esta cifra es reimpreso con el permiso de Gonia, et al. 6 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las fusiones de PF también facilitan el análisis de los niveles de expresión de proteínas por Western Blot. El uso de células de levadura generados por el protocolo descrito anteriormente, las proteínas se aislaron a partir de lisados de células, separadas por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) 10. Fusiones Eno1-FP fueron detectados en las transferencias utilizando anticuerpos disponibles comercialmente como se describió previamente 6. En pocas palabras, de ratón anti-GFP (dilución 1: 2000), seguido de peroxidasa de rábano conjugada de cabra anti-IgG de ratón (dilución 1: 10000) anticuerpos se utilizaron para sondear para GFP y YFP-taenolasa gged. Rabbit anti-mCherry (1: 2000 dilución), seguido de rábano picante de IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa (dilución 1: 10000) anticuerpos se utilizaron para sondear para enolasa mCherry-tagged. Todas las proteínas de fusión se detectaron fácilmente a partir de lisados de transformantes de éxito (Figura 5, carriles 2, 5, y 7) 6 y eran del tamaño esperado (~ 75 kDa), en comparación con un estándar de escala de proteínas y las normas de C. albicans enolasa-FP ( Figura 5, carriles 1 y 6) 6. No se observó señal para la cepa de levadura padre sin etiquetar (Figura 5, carriles 3 y 4) 6.

Figura 5
Figura 5: inmunotransferencia de lisados celulares de las cepas de Candida. Carril 1, C. albicans que contienen fusión ENO1 -mCherry (J. Berman, Universidad de Minnesota)(control positivo); carril 2, C. parapsilosis contiene fusión ENO1 -mCherry; carriles 3 y 4, no transformada C. parapsilosis cepa parental 4175 11 (control negativo); carril 5, C. parapsilosis contiene ENO1-YFP fusión; carril 6, C. albicans que contienen fusión ENO1-GFP (J. Berman, Universidad de Minnesota) (control positivo); carril 7, C. parapsilosis que contiene ENO1-GFP fusión; carril L, escalera de proteína con 98 y 64 kDa estándares de proteína indicadas. Los carriles 1-3 se incubaron con anticuerpo anti-mCherry y los carriles 4-7 se incubaron con anticuerpo anti-GFP. Esta cifra es reimpreso con el permiso de Gonia, et al. 6 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo Paso / artículo Modificación Mejora Potencial (precauciones)
diseño de cebadores Alargar cebadores mediante la inclusión de la región más larga de homología con el locus genómico de interés Mejorar la eficacia de unión y la recombinación homóloga (modificación de la longitud del cebador puede cambiar la temperatura óptima de recocido)
PCR (calidad amplicón) Utilice más alta fidelidad Taq
Gel purificar producto de PCR
Reducir la introducción de errores en las secuencias de cassette para mejorar la focalización de imprimación de la secuencia del genoma y la eficiencia de transformación (gel de purificación puede disminuir la cantidad de amplificación y, por tanto, la eficiencia de transformación)
PCR (cantidad de amplicón) Aumentar el número de reacciones de PCR y productos para piscinas Increase número de células transformadas (demasiado amplicón también puede resultar en la reducción de la eficiencia de transformación)
la precipitación de cassette Realizar centrifugación a 4 ° C, mantener todos los reactivos y los tubos en hielo Incrementar el rendimiento del ADN y, por lo tanto, la eficiencia de transformación
Golpe de calor Acortar el tiempo Mejorar la viabilidad de células de levadura estresados ​​(reducción de los tiempos de choque térmico también podrían dar lugar a la absorción disminuida de casete de ADN por las células)
Crecimiento Recuperación 1 Permitir la recuperación más largo en agar YPAD antes de chapado de agar que contiene nourseothricin células de levadura estresados ​​pueden necesitar tiempos de recuperación más largos cuando se expone a nourseothricin (tiempos de incubación más largos también pueden aumentar contaminante y el crecimiento transformante falsos positivos)
Colonia excrecencia 1,2 Incubar las placas durante tiempos más largos (~ 5 d) Stcélulas de levadura ressed pueden necesitar tiempos de incubación más largos para el crecimiento de colonias (tiempos de incubación más largos también pueden aumentar contaminante y el crecimiento transformante falsos positivos)
1 específica de transformaciones usando marcador de selección NAT1 o 2 transformaciones de cepas de levadura que contienen mutaciones genéticas que afectan el crecimiento

Tabla 2: Guía para la solución de problemas y optimización.

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Discussion

Construcción de epítopo etiquetado secuencias en las especies de Candida utilizando la estrategia de modificación del gen mediada por PCR descrito anteriormente se pueden resumir como un proceso de tres pasos. En primer lugar, un casete se hace por PCR que codifica tanto la secuencia deseada para la integración y regiones homólogas al locus de la inserción en el genoma de la levadura. En segundo lugar, las células de levadura para ser transformadas se hacen químicamente competente con acetato de litio y co-incubaron con el cassette. En tercer lugar, las células se extendieron en placas sobre medios selectivos para recuperar los transformantes y las colonias resultantes se prueban para la correcta integración de la casete en el locus genómico deseado.

Hay varios pasos críticos dentro de este protocolo para mejorar la tasa de éxito de obtener una proteína de fusión fluorescente en C. albicans y C. parapsilosis. En primer lugar, el uso de cebadores que han sido purificados por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; por el fabricante) es altamente recendados. Sin purificación, hay una mayor probabilidad de obtener cebadores de longitudes incorrectas en el producto final, lo que podría disminuir la eficacia con la que el casete se integra en el locus genómico previsto por recombinación homóloga. En segundo lugar, te recomendamos comprobar que el casete de etiquetado generado por PCR es de alta calidad, mediante el análisis de ~ 5 l de ADN de cassette mediante electroforesis en gel de agarosa para asegurar tamaño correcto del producto de PCR. En tercer lugar, para obtener células de levadura que están optimizados para la transformación, las células deben estar en la fase logarítmica de crecimiento, con los brotes de levadura evidentes por microscopía antes de su uso. En cuarto lugar, es imperativo el uso de la técnica de pipeteo suave durante la resuspensión de las células de levadura transformadas después de choque térmico y antes de placas en medios selectivos. En quinto lugar, para la selección del transformante en nourseothricin, que es tóxico para las células de levadura, lo que permite más tiempo para el crecimiento en agar YPAD antes de replicar en un medio que contiene nourseothricin-puede ser benefcial para promover la recuperación de transformantes. Por último, el plásmido intacto y la integración casete de PCR fuera de la localización genómica prevista se produce a bajas frecuencias en Candida y también darán como resultado el crecimiento de colonias. Por lo tanto, es necesario analizar todos colonias transformadas por PCR utilizando cebadores externos de la secuencia utilizada para la integración. Para los transformantes que se verifican por PCR pero no exhiben fluorescencia por microscopía, el análisis de transferencia Western de lisados ​​de células y la secuencia se debe considerar que investigar más a fondo la razón de la construcción o el fracaso de visualización. Además de estos pasos críticos, hay varios pasos en el protocolo que se pueden modificar, si es necesario, para mejorar la eficiencia de transformación y aumentar la frecuencia de integración de cassette correcta. Una guía de solución de problemas se presenta en la Tabla 2.

Hay posibles limitaciones de esta técnica que podría ser optimizado para aplicaciones futuras. el lithiuMétodo M de acetato utiliza para resultados de la transformación de ADN en una menor eficiencia (~ 1-2% de las colonias seleccionadas contenía una correcta integración) para C. parapsilosis 12, en comparación con C. albicans. La electroporación es un enfoque alternativo al litio transformación con acetato de que puede mejorar la eficiencia de transformación 13. El uso del terminador ADH1, si bien es necesaria para un método de marcado universal, puede cambiar la estabilidad y / o la regulación del ARNm generado a partir de la que se habría producido con la secuencia de terminación nativo. Este problema potencial debe tenerse en cuenta cuando la función nativa de una proteína es importante para la pregunta de investigación específica. Para las proteínas de fusión fluorescentes que se expresan en niveles bajos, toda la microscopía de colonias para identificar o evaluar si los transformantes exitosos puede que no sea una opción. En este caso, la PCR y Western blot análisis proporcionarán evidencia de la fusión exitosa secuenciadores de proteínasConstrucción / proteína cia. Una limitación, común a todas las construcciones de proteína de fusión, es que las etiquetas de epítopo podrían interferir con la función nativa de la proteína, lo que resulta en fenotipos mutantes no deseados, incluyendo la localización anormal de la proteína de fusión. La consideración de estos temas es importante y controles apropiados debe ser incluida como se indica.

Los plásmidos útiles para la generación de etiquetas de epítopo en Candida por este enfoque PCR mediada, además de los mencionados aquí, han sido previamente generado por nuestros grupos de investigación y están disponibles para los investigadores a través de la Genética de Hongos Stock Center (http: //www.fgsc. red). Más información acerca de varios de estos plásmidos también se puede encontrar en (http://www6.tau.ac.il/berman/). Los plásmidos disponibles contienen una gran variedad de combinaciones de marcadores de resistencia a los medicamentos y nutricionales, secuencias de PF para generar diferentes de levadura de color, otras opciones de etiqueta epítopo (HA, myc, V5, HIS9) para generar proteínas que la RAe etiquetada en cualquiera de las secuencias carboxi o amino-terminales y promotoras para la expresión constitutiva y regulable de proteínas. Los plásmidos que contienen marcadores de resistencia a fármacos son especialmente beneficiosas para el campo de la patogénesis de hongos ya que esta herramienta permite la transformación y el estudio de cepas de levadura que son clínicos prototrophic, representación marcadores nutricionales convencionales inutilizable. La construcción de cepas clínicas de Candida que emiten fluorescencia a diferentes longitudes de onda será útil para una variedad de ensayos de células biológica que requieren la capacidad de visualizar y diferenciar múltiples cepas de levadura en el co-cultivo.

Enfermedad fúngica invasora por especies de Candida sigue siendo un reto importante de salud humana que es difícil de tratar y se asocia con una alta morbilidad y mortalidad, especialmente en pacientes inmunodeprimidos 14, 15. Por lo tanto, las herramientas moleculares que permiten la investigaciónERS para estudiar con mayor rapidez y facilidad Candida interacciones especies hospedadoras son de vital importancia para la promoción de nuestra comprensión de los mecanismos de la biología y la patogénesis de Candida.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a N. Dean para proporcionar la secuencia original mCherry FP, M. Gerami-Nejad para la construcción de plásmidos, B. Larson para la asistencia técnica, y T. Heisel útil para el asesoramiento durante el desarrollo de este proyecto. JB fue apoyado por el Premio del Consejo Europeo de Investigación Avanzada 340087 (RAPLODAPT). sistemas de microscopía e imagen fueron proporcionados por la Fundación Universidad de Minnesota Pediatría y la Universidad de Minnesota Centro de Imagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 W mercury lamp CHIU Technical Corporation M-100T
95% Ethanol Any NA
Adenine Any NA
Ampicillin Any NA
Carrier DNA Ambion AM9680 Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera Photometrics CoolSNAP HQ
Conical Tube Corning 430828 50 ml
Culture Tube Rotator New Brunswick 2013923 TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade Any NA
Eppendorf Tubes Eppendorf 022363719, 022363212 0.5 ml, 1.5 ml
Erlenmeyer Flask Fisher Scientific 7250089 125 ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any NA
Freezer (-80 °C) Thermo Electron Corporation ULT-1386-9-V Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets Chroma Technology Corporation 49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes Fisher Scientific 1496126 75 mm
HRP goat anti-mouse antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2301
Incubator (30 °C) Any NA
Lithium Acetate Any NA
Lysogeny Broth (LB) Media Any NA
Magnesium Chloride Any NA
Microcentrifuge Eppendorf 5415 D
Microscope Nikon E600 Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody Roche 11814460001
Nourseothricin Fisher Scientific 50997939
PCR Thermocycler Applied Biosystems 9700 GeneAmp PCR System
PCR tubes BioExpress, GeneMate T-3035-1 0.2 ml
Polyethylene Glycol 3350 Any NA
Potassium Chloride Any NA
Rabbit anti-mCherry antibody BioVision 5993-100
Refrigerator (4 °C) Any NA
Sodium Acetate Any NA
Stereomicroscope Nikon SMZ1500
Table Top Centrifuge Labnet Z 400 Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase Any NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Any NA
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media Any NA

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References

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Genética No. 121, La modificación de genes mediada por PCR proteína fluorescente, Transformación con acetato de litio,
Generación de fusiones de proteínas fluorescentes en<em&gt; Candida</em&gt; Especies
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Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A.More

Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A. Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species. J. Vis. Exp. (121), e55333, doi:10.3791/55333 (2017).

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