Summary
PCR-gemedieerde genetische modificatie kan worden gebruikt voor fluorescent proteïne fusies in Candida soorten die visualisatie en kwantificering van gistcellen en eiwitten vergemakkelijkt genereren. Hierin presenteren we een strategie voor het construeren van een fluorescerend eiwit fusie (Eno1-FP) Candida parapsilosis.
Abstract
Candida species, gangbare kolonisators van de darmen en urogenitalis, de oorzaak van de meeste invasieve schimmelinfecties bij mensen. Aldus worden moleculaire en genetische instrumenten om de studie van de pathogenese mechanismen te vergemakkelijken. PCR-gemedieerde gen modificatie een eenvoudige en snelle manier van epitoop-gemerkte eiwitten te genereren om detectie te vergemakkelijken. In het bijzonder, fluorescerend eiwit (FP) fusies zijn krachtige instrumenten die visualisatie en kwantificering van zowel gistcellen en eiwitten mogelijk met behulp van fluorescentie microscopie en immunoblotting, respectievelijk. Plasmiden die FP coderende sequenties, samen met nutritionele merker genen dat de transformatie van Candida species te vergemakkelijken, zijn gegenereerd ten behoeve van FP constructie en expressie in Candida. Hierin presenteren we een strategie voor het construeren van een fusie-FP in een Candida species. Plasmiden die de nourseothricin resistantnce transformatie markergen (NAT1) samen met sequenties voor zowel groen, geel of kersen FP (GFP, YFP, mCherry) worden gebruikt tezamen met primers die genspecifieke sequenties in een polymerasekettingreactie (PCR) worden uitgevoerd, om FP cassette genereren . Deze genspecifieke cassette in staat om te integreren in het 3'-uiteinde van het corresponderende gen-locus via homologe recombinatie. Succesvolle in-frame fusie van het KP sequentie in het gen locus van belang genetisch gecontroleerd, gevolgd door analyse van fusie-eiwit expressie door microscopie en / of immuno-detectiemethoden. Bovendien, in het geval van sterk tot expressie gebrachte eiwitten, succesvolle fusies kunnen worden gescreend op de eerste plaats door fluorescentie beeldvorming technieken.
Introduction
Candida species zijn commensaal schimmels die de darm- en genito-urinaire stukken alle mensen koloniseren. Onder omstandigheden van immunodeficiëntie, zoals die optreden bij vroeggeboorte of immunosuppressieve effecten van behandelingen voor kanker, kan Candida species opportunistische pathogenen worden. Van de Candida species, Candida albicans is de meest voorkomende schimmel kolonisator en doet de meerderheid van invasieve schimmelinfecties. Andere Candida soorten zoals C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis en C. kruseii ook leiden tot ernstige infecties bij immuungecompromitteerde patiënten, met enkele vertonen intrinsieke weerstand tegen veelgebruikte anti-schimmel antibiotica zoals fluconazol en amfotericine B. Vandaar infecties met sommige van deze soorten worden vaker waargenomen, vooral bij patiënten die profylactisch behandeld met anti-schimmelmiddelen. Zelfs met de juiste en tijdige eennti-schimmel behandeling, invasieve Candida infecties blijven geassocieerd met significante morbiditeit en mortaliteit 1. Gezien het belang van Candida soorten menselijke gezondheid, is er een behoefte aan direct beschikbare moleculaire hulpmiddelen die de studie en onderzoek naar hun pathogenese mechanismen mogelijk.
Een belangrijk instrument waarmee onderzoekers te visualiseren en te kwantificeren microbiële cellen en de eiwitten die ze uiten is FP fusietechnologie. Polymerase kettingreactie (PCR) gemedieerde genetische modificatie, zoals beschreven in dit document, kan de constructie van fusies tussen FP sequenties en Candida eiwit coderende sequentie van belang in de genomische locus. Stabiele integratie van het construct vergemakkelijkt de analyse van eiwitexpressie en eiwit lokalisatie dynamiek. Plasmiden die FP sequenties geoptimaliseerd voor expressie in Candida albicans en die kunnen worden gebruikt in de PCR-gemedieerde gene modificatie strategie eerder geconstrueerd 2, 3, 4, 5. Plasmiden FP transformatie "cassettes": een FP-sequentie gekoppeld aan een nutritionele merker gen dat de transformatie van C. albicans en C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7 vergemakkelijkt. Momenteel verkrijgbare plasmiden bevatten verschillende selecteerbare merkergenen voeding (URA3, HIS1, ARG4) voor transformatie van auxotrofe stammen en dominante resistentie merker (NAT1), die transformatie van klinische stammen ontbreekt auxotrophies vergemakkelijkt. Bovendien plasmiden opties voor maximaal vier verschillende FP sequenties (groen [GFP], yellow [YFP], cyaan [GVB] en kersen [mCherry]) en ofwel een ADH1 terminatiesequentie voor de bouw van carboxy-terminus eiwitfusies of een promotersequentie voor de bouw van amino-terminus eiwitfusies. Primers zijn ontworpen met homologie met het plasmide-DNA rond de FP cassette. Bovendien, de primers bevatten ook 5'-extensie sequenties waarop homologie met het gist-gen van belang te hebben, wat de integratie van de cassette vergemakkelijkt in de genomische locus via homologe recombinatie (Figuur 1). Genspecifieke FP cassettes worden gegenereerd door PCR en vervolgens getransformeerd in Candida cellen die voor opname van DNA door behandeling met lithium acetaat.
Figuur 1: Diagram van hoe FP reeks fusies worden gegenereerd in Candida soorten. (A) Plasmide DNA includes een FP-sequentie en een sequentie die codeert nourseothricin weerstand (NAT1). Relatieve locaties van de Vooruit (FWD) en achteruit (REV) primers worden getoond, met zwarte delen van de primers met vermelding van het gebied van homologie op het plasmide sequentie en de paarse delen aanduiding van de gen-specifieke homologie regio of primer extensie. (B) FP cassettes worden omgezet in Candida en te integreren binnen de ENO1 genomische locus via homologe recombinatie (stippellijnen). (C) Resulterend FP fusie sequentie aan het 3'-uiteinde van ENO1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hierin geven we een voorbeeld van eiwitfusie (Eno1-FP) constructies in Candida species. We maken gebruik van tagging plasmiden die de NAT1 transformatie marker-gen, samen met sequenties die coderen voor GFP, YFP, ofmCherry (Figuur 2). Deze plasmiden worden gebruikt in combinatie met primers in PCR te genspecifieke cassettes die fusie van KP vergemakkelijken het 3'-einde van ENO1 ontwikkeld, waardoor expressie van Eno1 gefuseerd aan KP bij de carboxy-terminus.
Figuur 2: Kaarten van FP-cassette die plasmiden. Voorwaartse (F) en reverse (R) primers gebruikt om de cassettes van de plasmiden worden aangeduid met de relatieve locatie van hun homologie met de plasmiden. Primer sequenties zoals vermeld in tabel 1. F1 en R1 werden gebruikt om de pYFP- NAT1 cassette genereren. Het plasmide dat de YFP- NAT1 cassette (pMG2263) is identiek aan pMG2120 behalve YFP in plaats van de GFP sequentie. Cassette maten: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kbp; YFP- NAT1, 3.7 kbp. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Gerami-Nejad, et al. 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoleer Template plasmiden uit E. coli
- Kweek E. coli die het plasmide template nacht in 10 ml lysogenie bouillon (LB) + 200 mg / L ampicilline (AMP) bij 37 ° C onder schudden.
- Oogst cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 2 minuten.
- Decanteren vloeistof, isoleren en zuiveren van DNA uit E. coli cellen door een standaard werkwijze zoals eerder beschreven in Ausubel et al. 8.
- Resuspendeer DNA in Tris-EDTA (TE; 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) bij een werkende concentratie van 50-100 ng / ml.
2. Design Primers
| grondverf | primer Sequence |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
Tabel 1: Primersequenties gebruikt in deze studie. Gewaagde cursieve tekst geeft homologie met de ENO1 genoomplaats, normaal lettertype gebieden homoloog aan plasmide DNA.
- <li> Design primers homoloog aan plasmide sequenties grenzend aan de cassette en wordt versterkt tot het 3'-uiteinde van het doelwitgen van belang (bijvoorbeeld ENO1) om recombinatie in genomische locus van het gen te vergemakkelijken (Figuur 2 en Tabel 1) .
- Zorgen dat de voorwaartse primer sequenties overeenkomen met de laatste 70 basenparen (bp) van het gen van belang, 5'-3 ', minus het stopcodon, de coderende lijst handhaven, plus de eerste ongeveer 30 bp van het plasmide sequentie te geamplificeerd. Als een opmerking, de GGTGGTGGTT in elke primer is een poly-glycine verbinder zonder FP homologie. Opmerkelijk, in afwezigheid van een linker, kan er directe fusie van functionele domeinen, wat theoretisch kan leiden tot eiwit misfolding, lage opbrengst in eiwitproductie of verminderde bioactiviteit zijn.
- Zorg ervoor dat de reverse primer sequenties zijn 70 bp net stroomafwaarts van gen, 3'-5 ', niet met inbegrip van alle gensequentie, plus de laatste voorkomendbatterijvak ongeveer 30 bp van nutritionele of geneesmiddelresistentie marker gebruikt in het plasmide.
- Gebruik F1 en R1 om GFP NAT1 en YFP- NAT1 cassettes met pMG2120 en pMG2263, respectievelijk F2 en R2 genereren om mCherry- NAT1 met pMG2343 genereren.
3. Genereer FP Cassettes door PCR (dag 1)
- Bereid reagentia voor PCR. Voeg een master mix (500 ui eindvolume) door toevoeging van de volgende hoeveelheden en concentraties aan een 1,5 ml buis: 50 ui PCR buffer (500 mM kaliumchloride, 100 mM Tris pH 8,0 in water), 20 gl deoxynucleotiden (dNTPs; stock mengsel nucleotiden bij 10 mM elk), 40 ui 25 mM magnesiumchloride, 20 pl gezuiverd plasmide (van ~ 50-100 ng / ul voorraad-oplossing), 10 ul elke voorwaartse en achterwaartse primer (van 10 mM stock oplossingen), 30 ul Taq polymerase (generiek, 5000 eenheden / ml) en 320 gl water.
- Aliquot 50 ul van de master mix in elk van de 10 PCR-Passendle 0,5 ml buizen.
- Plaats PCR buizen in thermocycler en voer de volgende stappen: 1 cyclus van 5 min bij 94 ° C denatureert dsDNA; 40 cycli achtereenvolgens van 45 sec bij 94 ° C, 30 sec bij 55 ° C om primers te hybridiseren plasmide matrijs-DNA, en 4 min bij 68 ° C om verlenging van DNA-producten; en 1 cyclus laatste verlenging van 15 minuten bij 72 ° C.
OPMERKING: De PCR master mix en cyclusparameters moet mogelijk worden aangepast op basis van de specifieke Taq polymerase. - Pool alle producten uit de 10 PCR-reacties in een 1,5 ml buis.
- Betreft 5 pl gepoolde PCR product aan agarosegelelektroforese amplicongrootte verifiëren en een schatting van productconcentratie verkrijgen, op basis van vergelijking met een DNA ladder. Algemeen Gebruik ~ 250 ug cassette DNA in elke volgende transformatiemengsel.
- DNA precipiteren door toevoeging van 50 pl 3 M natriumacetaat, gevolgd door 750 pl 95% ethanol aan de producten en incubeer ten minste 30 minbij -20 ° C
- Oogst de PCR producten door centrifugeren van de buis bij 16.000 xg gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig en gooi de supernatant en 's nachts droog de pellet. Resuspendeer de gedroogde DNA-cassette pellet in 40 ul TE pH 8,0 en bewaard bij kamertemperatuur tot gebruik.
4. Transformeer Candida Cellen met FP DNA Cassettes
- Op dag 1, herstellen giststam te transformeren van een 15% glycerol ingevroren (-80 ° C) voorraad door uitstrijken enkele geschraapt kristallen op gist pepton dextrose met adenine (YPAD) agar en incubeer bij 30 ° C. Na herstel van koloniegroei Inoculeer een enkele kolonie in 2 ml vloeibaar YPAD medium in een glazen kweekbuis met een ademende cap en incubeer overnacht bij 30 ° C onder roeren.
- Op dag 2, verdun 300 gl overnacht gistcultuur in 50 ml vers YPAD (tot een uiteindelijke OD600 van ~ 0,2) in een 125 ml Erlenmeyer kolf met een ademende cap. Schud bij 30 ° Cvoor ~ 3 uur (tot een uiteindelijke OD 600 ~ 0,6-0,8).
- Giet de overnachtcultuur in een 50 ml conische buis en pellet van de cellen door het draaien gedurende 5 min bij 500 xg 1 in een tafelblad centrifuge.
- Giet af en de bovenstaande vloeistof op de juiste weg te gooien. Resuspendeer de celpellet in 5 ml water. Re-pellet van de cellen door opnieuw centrifugeren gedurende 5 min bij 1500 xg in een tafelblad centrifuge.
- Giet af en de bovenstaande vloeistof op de juiste weg te gooien. Resuspendeer de cellen in 500 pl TELiAc (TE lithiumacetaat: 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M lithium acetaat) tijdens het overbrengen naar een 1,5 ml buis. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 3000 xg in een microcentrifuge.
- Resuspendeer cellen in 250 ul TELiAc. Het totale volume inclusief de pellet moet ~ 300 pi zijn.
- Een schone (verschillende microfugebuis dan in 4.2.4), voeg 5 ul drager-DNA (10 mg / ml) en 150 pi bereid Candida cellen (van 4.2.4). Dit is de negatieve controle voor ttransformatie en.
- Een tweede schone microfugebuis, voeg 5 ul van gedenatureerd drager-DNA (dat is gekookt bij 90 ° C gedurende 10 minuten en afgekoeld tot 4 ° C), alle 40 pl van de bereide PCR product (van 3.3.1) en 150 pi bereid Candida cellen (van 4.2.4).
- Incubeer de twee mengsels voor transformatie 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Aan elk transformatiemengsel buis, voeg 700 ul PLAAT mix (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M lithium acetaat in 50% polyethyleenglycol 3350). Inverteer de buizen te mengen en incubeer ze een nacht bij kamertemperatuur.
- Op dag 3, incubeer de transformatie mengsels bij 42 ° C gedurende 1 uur (heat shock).
- Centrifugeer de transformatie mengsels gedurende 30 seconden bij 16.000 xg in een microcentrifuge. Verwijder de bovenstaande vloeistof op de juiste weg te gooien. Resuspendeer elk van de celpellets in 150 pl water door voorzichtig pipetteren en neer om niet aan de cellen beschadigen.
- Voor transformaties utilizing auxotrofe marker genen (bijv URA3), de plaat elk gehele mengsel door pipetteren de oplossingen op het geschikte selectieve media agar (bv zonder uridine) en verdeel het mengsel gelijkmatig met steriele glazen kralen.
- Voor transformaties gebruikmaking van de nourseothricin resistentiemarkergen (NAT1), zoals hier beschreven, plaat transformatie mengt eerst op non-selectieve YPAD agar en incubeer bij 30 ° C gedurende 6-12 uur. Deze stap helpt in cel herstel, na de heat shock, voordat nourseothricin spanning wordt toegepast.
- Na gedeeltelijke groeiherstel, replica plaat de Candida cellen op YPAD met 400 ug / ml nourseothricin. Voor transformaties gebruik voedings-markers (bijv URA3) Dit tussenproduct plating stap niet noodzakelijk en cellen direct uitgeplaat op selectieve media gist (bv YPAD zonder uridine) zoals beschreven in 4.4.2.
LET OP: Als de transformatie succesvol is, colOnies verschijnt binnen 1-3 dagen (potentieel tot vijf dagen van uitgroei van selectie op nourseothricin bevattende agar). Geen kolonies moeten verschijnen op platen te verspreiden met de transformatie mengsels bevattende drager DNA alleen (negatieve controle).
- Voor auxotrofe en nourseothricin merkerselectie, strook vermoedelijke transformanten als enkele kolonies op verse selectieve media agarplaten en geïncubeerd bij 30 ° C gistcellen die kunnen worden gescreend op succesvolle bouw van FP fusies propageren.
- Screen transformanten voor de juiste integratie van de tagging cassette (zie Representatieve resultaten voor een gedetailleerd voorbeeld). Als het gen van belang tot expressie wordt gebracht in voldoende hoeveelheden kunnen hele kolonie fluorescentie zodanig plaatsvinden dat er potentiële kandidaat integranten onder toepassing van een plaat beeldvormingssysteem met fluorescentiedetectie vermogen te detecteren.
- Raadpleeg vermoedelijke integranten met PCR met gebruik van primers die homoloog zijn aan sequenties outside van de regio integratie fusie met het doelwitgen te bevestigen.
- Overweeg daarnaast Western blot analyse om de expressie en de grootte van het fusie-eiwit te bepalen, en door fluorescentie microscopie van enkelvoudige cellen voor visuele bevestiging van eiwit lokalisatie, indien bekend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als voorbeeld gebruikten we de hierboven beschreven protocol voor GFP en mCherry fusies construeren Eno1 in C. parapsilosis laboratoriumstam. Elke vermoedelijke transformant werd initieel opnieuw uitgestreken voor groei. In dit voorbeeld, omdat de resulterende fusieproteïne hoog tot expressie (enolase) en KP zijn licht, konden we transformanten door fluorescentie microscopie screenen voor het uitvoeren van diagnostische PCR (figuur 3) 6.
Figuur 3: Colony fluorescentie tentoongesteld door Candida transformanten. Representatieve beelden van gist plaat groei verkregen met behulp van een laser scanning systeem uitgerust met een Cy3 filter het imago van de mCherry expressie stam en een Cy2 filter om het beeld van de YFP- en GFP tot expressie stammen. Linkerpaneel in elk paar, FP-expressing stammen; rechterpaneel in elk paar, niet-getransformeerde ouderlijke stam (4175) afgebeeld met hetzelfde filter als de overeenkomstige FP-expressie brengende stam. Na visualisatie werden de beelden omgekeerd en de helderheid en het contrast zijn identiek voor FP expressie en controle stammen aangepast. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van Gonia, et al. 6 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Genomisch DNA werd geïsoleerd 9 van elk van deze vermeende transformanten en gebruikt als het DNA-matrijs, met primers die complementair zijn aan sequenties die de gebieden van cassette integratie (dwz sequenties buiten waar F en R primers hybridiseren binnen het beoogde genomische locus te hebben) , in diagnostische PCR's om de juiste integratie van de FP cassette te controleren gewoon prIOR het stopcodon van het gen van belang. Van de nota, voor lithium acetaat transformaties met C. parapsilosis zagen we lagere efficiëntie (~ 1-2% van de gescreende kolonies bevatte een correcte integratie) vergeleken met onze ervaring met C. albicans transformaties.
Om enolase lokalisatie analyseren, zagen we gistcellen tot expressie Eno1-FP bouwt met behulp van fluorescentie microscopie met behulp van een fotomicroscoop uitgerust met een 100 W kwiklamp en epifluorescentie belichting met GFP, YFP en Texas Red filter sets. Een ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera werd gebruikt om beelden die zijn bewerkt met beeldanalyse software (figuur 4A) 6 verzamelen. Bovendien vonden we dat verschillende FP kleuren waren zeer handig zijn onderscheiden verschillende giststammen bij een mengsel (figuur 4B) 6. Omdat enolase hoog tot expressie en ineen groot deel van de gistcel kan FP fusies aan het worden gebruikt om fluorescerende giststammen die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd, bijvoorbeeld bij analyses van Candida -host interacties te genereren.
Figuur 4: Expressie en lokalisatie van Eno1-FP fusies met behulp van fluorescentie microscopie. (A) Fluorescentie (boven) en differentiële interferentie contrast (DIC, onder) opnamen Candida stammen die Eno1-KP. Eno1-KP C. albicans en C. parapsilosis neiging zich te concentreren in de kern als in het cytoplasma, maar in veel mindere mate. (B) microscopische beelden van een gemengde cultuur van Candida stammen die Eno1-mCherry en Eno1-GFP. Rechter paneel, Texas rood filter; middenpaneel, GFP filter; rechter paneel, samenvoegen van beide fluorescerende panelen beeld DIC met. Schaalbalken = 10 urn. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van Gonia, et al. 6 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FP fusies ook de analyse van eiwit expressie levels door Western blotting te vergemakkelijken. Gebruik gistcellen geproduceerd door de hierboven beschreven protocol werden eiwitten geïsoleerd uit cellysaten, gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en overgebracht naar een polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan 10. Eno1 FP-fusies werden gedetecteerd op de blots met in de handel verkrijgbare antilichamen zoals eerder beschreven 6. Kort samengevat, muis anti-GFP (1: 2000 verdunning), gevolgd door mierikswortelperoxidase-geconjugeerd geit anti-muis IgG (1: 10.000 verdunning) antilichamen werden gebruikt voor het sonderen GFP en YFP-tagged enolase. Konijn anti-mCherry (1: 2000 verdunning) gevolgd door mierikswortelperoxidase-geconjugeerd geit anti-konijn IgG (1: 10.000 verdunning) antilichamen werden gebruikt voor het sonderen mCherry-gelabelde enolase. Alle fusie-eiwitten werden gemakkelijk gedetecteerd in lysaten van succesvolle transformanten (Figuur 5, lanen 2, 5 en 7) en 6 waren van de verwachte grootte (~ 75 kDa) in vergelijking met een standaard proteïneladder en C. albicans enolase-FP standaarden ( figuur 5, lanen 1 en 6) 6. Geen signaal werd waargenomen voor de ongecodeerde ouder giststam (Figuur 5, lanen 3 en 4) 6.
Figuur 5: Immunoblot van cellysaten uit Candida-stammen. Baan 1, C. albicans bevatten ENO1 -mCherry fusie (J. Berman, Universiteit van Minnesota)(positieve controle); baan 2, C. parapsilosis met ENO1 -mCherry fusie; lanen 3 en 4, ongetransformeerde C. parapsilosis moederstam 4175 11 (negatieve controle); baan 5, C. parapsilosis met ENO1 -YFP fusie; baan 6, C. albicans bevatten ENO1 GFP fusie (J. Berman, University of Minnesota) (positieve controle); baan 7, C. parapsilosis met ENO1 GFP fusie; lane L, eiwit ladder met 98 en 64 kDa eiwit normen aangegeven. Lanen 1-3 werden geïncubeerd met anti-mCherry antilichaam en lanen 4-7 werden geïncubeerd met anti-GFP antilichaam. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van Gonia, et al. 6 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Protocol Step / Item | Wijziging | Potentiële Improvement (waarschuwingen) |
| primer ontwerp | Verleng primers door oa langere gebied van homologie aan genomische locus van belang | Verbeter de binding efficiency en homologe recombinatie (modificeren primer lengte optimale gloeien temperaturen veranderen) |
| PCR (amplicon kwaliteit) | Gebruik hogere fidelity Taq Gel zuiveren PCR-product | Verminder introductie van fouten in de cassette sequenties gerichter inspelen primer sequentie en transformatie-efficiëntie genoom (gel zuivering kan amplicon hoeveelheid en dus transformatie-efficiëntie te verlagen) |
| PCR (amplicon hoeveelheid) | Verhoog aantal PCR-reacties en het zwembad producten | Increase aantal getransformeerde cellen (teveel amplicon kan ook resulteren in verminderde transformatie-efficiëntie) |
| cassette neerslag | Voer centrifugeren bij 4 ° C, houdt alle reagentia en buizen op ijs | Verhogen DNA opbrengst en daarmee transformatie-efficiëntie |
| Zonnesteek | Verkorten van de tijd | Verbeter de levensvatbaarheid van beklemtoonde gistcellen (kortere heat shock tijden zou ook kunnen leiden tot een verminderde opname van DNA-cassette door cellen) |
| Recovery groei 1 | Zorg voor langere hersteltijd op YPAD agar voordat plating aan agar met nourseothricin | Stressed gistcellen kan langere hersteltijd nodig hebben bij blootstelling aan nourseothricin (langere incubatietijd kan ook verontreiniging en vals-positieve transformant groei verhogen) |
| Kolonie uitgroei 1,2 | Incubeer platen voor langere tijd (~ 5 d) | Stressed gistcellen kan langer incubatietijden voor kolonie groei nodig heeft (langere incubatietijd kan ook verontreiniging en vals-positieve transformant groei verhogen) |
| 1 Specifiek voor transformaties met behulp van NAT1 selectie marker of 2 transformaties van giststammen met genetische mutaties die de groei beïnvloeden | ||
Tabel 2: Gids voor het oplossen van problemen en optimalisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Constructie van epitoop-gemerkte sequenties in Candida soort, volgens de PCR-gemedieerde genmodifcatie strategie hierboven beschreven kan worden samengevat als een drie-stappen. Eerst wordt een cassette door PCR dat codeert voor zowel de gewenste integratie en gebieden homoloog aan de plaats van insertie in het gist genoom. Ten tweede worden de gistcellen te transformeren chemisch competente met lithium acetaat en co-geïncubeerd met de cassette uit. Ten derde worden de cellen uitgeplaat op selectieve media om transformanten te herstellen en resulterende kolonies worden getest op correcte integratie van de cassette in de gewenste genomische locus.
Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol om de slaagkans van het verkrijgen van een fluorescerende fusie-eiwit in C. albicans en C. parapsilosis verbeteren. Eerste gebruik van primers die zijn gezuiverd door polyacrylamide gelelektroforese (PAGE, door de fabrikant) zeer recbevolen. Zonder zuivering, is er een verhoogde kans op het verkrijgen van primers onjuiste lengte in het eindproduct, die de efficiëntie waarmee de cassette geïntegreerd in het beoogde genomische locus door homologe recombinatie kunnen afnemen. Ten tweede, raden we dat het PCR-gegenereerde tagging cassette van hoge kwaliteit, door analyse ~ 5 pl cassette DNA door agarose gelelektroforese om een correcte grootte van het PCR-product. Ten derde, gistcellen die zijn geoptimaliseerd voor transformatie te verkrijgen, moeten cellen in de log-groeifase gist met knoppen duidelijk door microscopie voorafgaand aan het gebruik. Ten vierde, is het noodzakelijk om zachte pipetteertechniek gebruiken tijdens resuspensie van getransformeerde gistcellen na heat shock en voor het uitplaten op selectieve media. Ten vijfde, voor selectie op transformanten nourseothricin, dat toxisch is voor gistcellen, waardoor meer tijd op groei op agar YPAD voor repliceren op nourseothricin-bevattend medium kan worden beneficial om het herstel van de transformanten te promoten. Laatste intacte plasmide en PCR integratie cassette buiten het beoogde genomische locatie optreedt bij lage frequenties Candida en zal ook leiden tot koloniegroei. Zo moeten alle getransformeerde kolonies met PCR met gebruik van primers buiten de sequentie geanalyseerd voor integratie. Voor transformanten die worden gecontroleerd door PCR maar fluorescentie vertonen door microscopie moet Western blot analyse van cellysaten en sequencing geacht verder de reden voor de bouw of visualisatie falen. Naast deze kritische stappen, zijn er verschillende stappen in het protocol dat kan worden gewijzigd indien nodig, transformatie efficiëntie en de frequentie van de juiste cassette integratie. Een gids voor probleemoplossing wordt weergegeven in tabel 2.
Er potentiële beperkingen van deze techniek die kan worden geoptimaliseerd voor toekomstige toepassingen. de lithium acetaat methode voor DNA-transformatie leidt tot een lagere efficiëntie (~ 1-2% van de gescreende kolonies bevatte een correcte integratie) voor C. parapsilosis 12, in vergelijking met C. albicans. Elektroporatie is een alternatieve benadering van acetaat transformatie die de transformatie-efficiëntie 13 verhogen door lithium. Gebruik van de ADH1 terminator, terwijl die voor een universele tagging werkwijze kan de stabiliteit en / of regelen van de gegenereerde mRNA dat zou zijn opgetreden met de natieve terminator sequentie veranderen. Dit potentieel probleem moet worden beschouwd als de natieve functies van eiwitten is belangrijk voor de specifieke vraagstelling. Voor fluorescerende fusie-eiwitten die worden uitgedrukt op een laag niveau, hele kolonie microscopie te identificeren of het scherm voor een succesvolle transformanten geen optie kunnen zijn. In dit geval zal PCR en Western blot analyses bewijs van succesvolle fusieproteïne lovert biedenlingen / eiwit constructie. Een beperking voor alle fusieproteïne constructies is dat epitooplabels kunnen interfereren met de natuurlijke functie van het eiwit, die onbedoelde mutante fenotypen, zoals abnormale lokalisatie van het fusie-eiwit. De behandeling van deze zaken is belangrijk en passende controles moeten worden opgenomen, zoals aangegeven.
Plasmiden nuttig om epitooplabels Candida in deze PCR-gemedieerde benadering, naast de hier genoemde, eerder verkregen door onderzoeksgroepen en zijn beschikbaar voor onderzoekers via de Fungal Genetics Stock Center (http: //www.fgsc. netto). Meer informatie over een aantal van deze plasmiden zijn ook te vinden op (http://www6.tau.ac.il/berman/). De beschikbare plasmiden bevatten een groot aantal combinaties van voedings- en geneesmiddelen resistentie markers, FP sequenties verschillende gekleurde gist, andere epitooplabel opties te genereren (HA, myc, V5, HIS9) naar eiwitten die ar genererene hebben op ofwel de carboxy- of amino-termini en promotersequenties voor constitutieve en reguleerbare expressie van eiwitten. Plasmiden die resistentie markers zijn bijzonder gunstig op het gebied van fungale pathogenese zoals dit hulpmiddel maakt voor de transformatie en studie van klinische giststammen die zijn prototroof, waardoor conventionele nutritionele markers onbruikbaar. De constructie van klinische Candida stammen die fluoresceren bij verschillende golflengten zal nuttig zijn voor verschillende celbiologische assays die het vermogen te visualiseren en te differentiëren verschillende giststammen in co-kweek vereisen.
Invasieve schimmelziekte door Candida soorten blijft een belangrijke uitdaging volksgezondheid die moeilijk te behandelen en gaat gepaard met hoge morbiditeit en mortaliteit, vooral bij immunogecompromitteerde patiënten 14, 15 zijn. Zo moleculaire technieken die het mogelijk maken onderzoekers om sneller en gemakkelijker te bestuderen Candida species-gastheer interacties zijn van vitaal belang voor een beter inzicht in Candida biologie en pathogenese mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken N. Dean voor het verstrekken van de oorspronkelijke mCherry FP-sequentie, M. Gerami-Nejad voor de constructie van plasmiden, B. Larson voor technische ondersteuning, en T. Heisel voor nuttig advies bij de ontwikkeling van dit project. JB werd gesteund door de European Research Council Geavanceerde Award 340.087 (RAPLODAPT). Microscopie en imaging systemen werden verstrekt door de Universiteit van Minnesota Kindergeneeskunde Stichting en de Universiteit van Minnesota Imaging Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
- Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
- Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
- Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
- Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
- Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
- Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
- Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
- Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
- Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
- Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
- Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
- Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).
