Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

جيل من الإنشطار بروتين فلوري في Published: March 4, 2017 doi: 10.3791/55333

Summary

تعديل الجينات بوساطة PCR-يمكن استخدامها لتوليد اندماج بروتين فلوري في أنواع المبيضات، مما يسهل التصور والكميات من خلايا الخميرة والبروتينات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء البروتين الانصهار فلوري (Eno1-FP) في المبيضات المرطية.

Abstract

المبيضات، المستعمرون السائد في مساحات والأمعاء والجهاز البولي التناسلي، هي سبب معظم الأمراض الفطرية الغازية في البشر. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات الجزيئية والجينية لتسهيل دراسة الآليات المرضية الخاصة بهم. تعديل الجينات بوساطة PCR-هو نهج واضحة وسريعة لتوليد البروتينات الموسومة حاتمة لتسهيل الكشف عنها. على وجه الخصوص، البروتين الفلوري (FP) اندماج هي أدوات قوية التي تسمح التصور والكميات من كل من خلايا الخميرة والبروتينات بواسطة المجهر مضان وimmunoblotting، على التوالي. البلازميدات تحتوي FP تسلسل الترميز، جنبا إلى جنب مع الجينات علامة الغذائية التي تسهل التحول من المبيضات، تم إنشاؤها لغرض بناء FP والتعبير في المبيضات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء الانصهار FP في المبيضات. البلازميدات التي تحتوي على المقاومة nourseothricinالامتحانات التنافسية الوطنية الجينات التحول علامة (NAT1) جنبا إلى جنب مع تسلسل إما أخضر، أصفر، أو الكرز ضباط الإتصال (GFP، YFP، mCherry) تستخدم جنبا إلى جنب مع الاشعال التي تشمل تسلسل الجينات المحددة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنشاء كاسيت FP . هذا كاسيت جين معين لديه القدرة على الاندماج في نهاية 3'من مكان الجين المقابل عبر إعادة التركيب مثلي. يتم التحقق من نجاح الانصهار في إطار تسلسل FP في موضع الجينات في المصالح وراثيا، تليها تحليل التعبير انصهار بروتين بواسطة المجهر و / أو الطرق المناعية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، لحالة من البروتينات أعرب للغاية، اندماج ناجحة يمكن فرزهم لفي المقام الأول من خلال تقنيات التصوير مضان.

Introduction

المبيضات والفطريات المتعايشة التي تستعمر مساحات المعوية والجهاز البولي التناسلي من كل البشر. في ظل ظروف من نقص المناعة، مثل التي تحدث مع الولادة المبكرة أو الآثار المثبطة للمناعة من العلاجات لمرض السرطان، فهناك أنواع المبيضات تصبح مسببات الأمراض الانتهازية. من المبيضات، المبيضات البيض هو المستعمر الفطرية الأكثر انتشارا ويتسبب في غالبية الإصابات الفطرية الغازية. الأنواع الأخرى المبيضات مثل C. الجرداء، C. المرطية، C. مداري، وجيم kruseii يسبب أيضا التهابات خطيرة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة، مع بعض واظهار المقاومة الجوهرية ليشيع استخدامها المضادات الحيوية المضادة للفطريات مثل فلوكونازول وأمفوتيريسين B. ومن هنا، يتم مراقبتها العدوى مع بعض من هذه الأنواع أكثر في كثير من الأحيان، وخاصة في المرضى الذين يعالجون قائي مع الأدوية المضادة للفطريات. حتى مع وجود المناسب وفي الوقت المناسبالعلاج المعهد القومي للاتصالات للفطريات، تواصل انتانات المبيضات الغازية لتترافق مع معدلات الاعتلال والوفيات 1 كبير. ونظرا لأهمية المبيضات في صحة الإنسان، وهناك حاجة إلى أدوات الجزيئية متوفرة التي تسمح للدراسة وتوضيح آليات المرضية الخاصة بهم.

واحد أداة هامة تسمح للباحثين لتصور وتحديد الخلايا الميكروبية والبروتينات التي يتم التعبير هي FP تكنولوجيا الانصهار. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تعديل الجينات بوساطة، كما هو موضح في هذه الورقة، يسمح للبناء اندماج بين متواليات FP والبروتين المبيضات الترميز سلسلة من الفائدة في موضع لالجيني. التكامل مستقر للبناء يسهل تحليل تعبير البروتين وكذلك ديناميات البروتين التعريب. البلازميدات تحتوي على تسلسل FP، الأمثل للتعبير في المبيضات البيض والتي يمكن استخدامها في غرام بوساطة PCR-استراتيجية تعديل إيني، وقد تم بناؤها من قبل 5. البلازميدات تحتوي FP التحول "الكاسيت": سلسلة FP ترتبط الجينات علامة الغذائية التي تسهل التحول من C. المبيضة البيضاء وجيم المرطية 7. حاليا البلازميدات المتاحة تحتوي على مجموعة متنوعة من الجينات اختيار الغذائية علامة (URA3، HIS1، ARG4) للتحول من سلالات بعامل نمائي فضلا عن المهيمنة مقاومة المخدرات علامة (NAT1)، مما يسهل التحول من سلالات السريرية التي تفتقر إلى auxotrophies. وبالإضافة إلى ذلك، البلازميدات تحتوي على خيارات لمدة تصل إلى أربع سلاسل FP مختلفة (الأخضر [GFP]، الاصفرث [YFP]، السماوي [CFP]، والكرز [mCherry]) وإما تسلسل إنهاء ADH1 لبناء اندماج بروتين كربوكسي المحطة، أو تسلسل المروج لبناء اندماج البروتين الأمينية النهاية. صممت الاشعال تناظر مع لDNA البلازميد المحيطة كاسيت FP. وبالإضافة إلى ذلك، يحتوي الاشعال أيضا تسلسل 5'تمديد تحمل التماثل إلى الجينات الخميرة التي تهم أن المعلمة، مما يسهل دمج الكاسيت في موضع الجيني عبر إعادة التركيب مثلي (الشكل 1). يتم إنشاء أشرطة FP-جين معين من قبل PCR ثم تتحول إلى خلايا المبيضات جعلت المختصة لامتصاص الحمض النووي عن طريق العلاج مع خلات الليثيوم.

شكل 1
الشكل 1: رسم بياني لكيفية يتم إنشاؤها FP تسلسل اندماج في المبيضات. (A) امب البلازميد الحمض النوويوفاق سلسلة FP والترميز تسلسل nourseothricin المقاومة (NAT1). وتظهر المواقع النسبية للأمام (FWD) وعكس (REV) الاشعال، مع الأجزاء السوداء من الاشعال تشير إلى منطقة تناظر إلى التسلسل البلازميد والأجزاء الأرجواني تدل على المنطقة تماثل الجينات المحددة أو تمديد التمهيدي. يتم تحويل أشرطة (ب) FP إلى المبيضات والاندماج داخل ENO1 موضع الجيني عبر إعادة التركيب مثلي (الخطوط المنقطة). (C) مما أدى FP تسلسل الانصهار في 3'end من ENO1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا، نقدم مثالا للانصهار بروتين (Eno1-FP) الإنشاءات في المبيضات. نحن نستخدم علامات البلازميدات تحتوي على الجين NAT1 التحول علامة جنبا إلى جنب مع تسلسل ترميز GFP، YFP، أوmCherry (الشكل 2). وتستخدم هذه البلازميدات جنبا إلى جنب مع الاشعال في PCR لتوليد أشرطة الجينات المحددة التي تسهل اندماج ضباط الإتصال إلى نهاية 3'من ENO1، مما أدى إلى التعبير عن Eno1 تنصهر لضباط الإتصال في دورته كربوكسي-محطة.

الشكل 2
الشكل 2: خرائط FP البلازميدات التي تحتوي على شريط كاسيت. يشار إلى الأمام (F) وعكس الاشعال (R) المستخدمة لتوليد أشرطة من البلازميدات جنبا إلى جنب مع الموقع النسبي للتناظر لالبلازميدات. تسلسل التمهيدي هي على النحو المبين في الجدول 1. استخدمت F1 و R1 أيضا لتوليد الكاسيت pYFP- NAT1. البلازميد التي تحتوي على كاسيت YFP- NAT1 (pMG2263) مطابق لpMG2120 باستثناء YFP في مكان تسلسل GFP. أحجام الكاسيت: GFP-NAT1، 3.7 KBP. mCherry- NAT1، 3.2 KBP. YFP- NAT1، 3.7 KBP. تم تعديل هذا الرقم من جيرامي نجاد، وآخرون. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عزل قالب البلازميدات من كولاي

  1. تنمو كولاي التي تحتوي على البلازميد قالب بين عشية وضحاها في 10 مرق مل استذابة (LB) + 200 ملغم / لتر الأمبيسلين (AMP) عند 37 درجة مئوية مع الهز.
  2. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  3. صب السائل، عزل وتنقية الحمض النووي من كولاي الخلايا عن طريق طريقة موحدة كما هو موضح سابقا في Ausubel وآخرون. 8.
  4. الحمض النووي Resuspend في تريس، EDTA (TE و 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) في تركيز العمل 50-100 نانوغرام / مل.

2. الاشعال التصميم

كتاب تمهيدي تسلسل التمهيدي
F1 5 " GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 "
R1 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 "
F2 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG
GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 "
R2 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 "

الجدول 1: تسلسل التمهيدي المستخدمة في هذه الدراسة. النص مائل عريض يشير التماثل إلى ENO1 موضع الجيني، مناطق الخط العادية هي مثلي لDNA البلازميد.

    <لى> الاشعال تصميم لتكون مثلي إلى البلازميد تسلسل المطلة على الكاسيت إلى أن تتضخم وكذلك إلى نهاية 3'من الجين المستهدف من الفائدة (على سبيل المثال ENO1) لتسهيل إعادة التركيب في مكان الجيني للجين (الشكل 2 والجدول 1) .
    1. تأكد من أن تسلسل التمهيدي إلى الأمام تطابق مشاركة 70 أزواج قاعدة (بي بي) من الجينات في المصالح، 5'- 3 "، ناقص وقف كودون، إلى الحفاظ على إطار الترميز، بالإضافة إلى أول ما يقرب من 30 سنة مضت من التسلسل البلازميد يكون تضخيمها. كملاحظة، وGGTGGTGGTT في كل التمهيدي هو رابط بولي جليكاين مع عدم وجود تناظر FP. وتجدر الإشارة، في ظل عدم وجود رابط، يمكن أن يكون هناك انصهار المباشر من المجالات الوظيفية، والذي يمكن أن يؤدي نظريا إلى misfolding البروتين، العائد المنخفض في إنتاج البروتين، أو النشاط الحيوي ضعف.
    2. تأكد من أن تسلسل التمهيدي العكسي هي 70 نقطة أساس فقط المصب من الجينات، 3'- 5، وليس بما في ذلك أي تسلسل الجينات، بالإضافة إلى APPRO الماضيximately 30 سنة مضت من علامة الغذائية أو مقاومة العقاقير المستخدمة في البلازميد.
    3. استخدام F1 و R1 لتوليد GFP- NAT1 وYFP- NAT1 أشرطة مع pMG2120 وpMG2263 على التوالي و F2 و R2 لتوليد mCherry- NAT1 مع pMG2343.

3. توليد FP كاسيت بواسطة PCR (يوم 1)

  1. إعداد الكواشف لPCR. جعل مزيج الرئيسي (500 الحجم النهائي ميكرولتر) وذلك بإضافة كميات وتركيزات التالية لأنبوب 1.5 مل: 50 ميكرولتر عازلة PCR (500 ملم كلوريد البوتاسيوم، و 100 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 في الماء)، deoxynucleotides 20 ميكرولتر (dNTPs، خليط الأسهم من النيوكليوتيدات في 10 ملي لكل منهما)، كلوريد المغنيسيوم 40 ميكرولتر 25 ملي و 20 ميكرولتر طهروا البلازميد (من ~ 50-100 نانوغرام / حل سهم ميكرولتر)، 10 ميكرولتر كل الأمام وعكس التمهيدي (من 10 الحلول الأسهم ملم)، 30 طق ميكرولتر البلمرة (عام، 5000 وحدة / مل)، و 320 المياه ميكرولتر.
    1. قسامة 50 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل من 10 PCR-compatibلو 0.5 مل أنابيب.
  2. وضع أنابيب PCR في thermocycler وتشغيل الخطوات التالية: 1 دورة 5 دقائق في 94 درجة مئوية إلى تفسد dsDNA. 40 دورة بالتسلسل من 45 ثانية في 94 درجة مئوية، و 30 ثانية في 55 درجة مئوية للسماح الاشعال ليصلب على البلازميد الحمض النووي القالب، و 4 دقائق عند 68 درجة مئوية لمدة التمديد للمنتجات الحمض النووي. و1 تمديد دورة النهائية لمدة 15 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    قد تحتاج إلى تعديل على أساس البلمرة طق معين يستخدم مزيج الرئيسي PCR والدراجات المعلمات: ملاحظة.
  3. تجمع جميع المنتجات من 10 ردود الفعل PCR في أنبوب 1.5 مل.
    1. الموضوع 5 ميكرولتر من الناتج PCR المجمعة لالكهربائي للهلام الاغاروز للتحقق من حجم amplicon والحصول على تقدير تركيز المنتج على أساس المقارنة إلى سلم الحمض النووي. عموما، استخدام ~ 250 ميكروغرام من الحمض النووي كاسيت في كل مزيج تحول لاحقا.
    2. ترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة خلات 50 ميكرولتر 3 M الصوديوم تليها 750 ميكرولتر الايثانول 95٪ على المنتجات واحتضان 30 دقيقة على الأقلعند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    3. حصاد المنتجات PCR بواسطة الطرد المركزي الأنبوب في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية وتجاهل طاف وتجفيف بيليه بين عشية وضحاها. Resuspend والمجففة الحمض النووي كاسيت بيليه في 40 ميكرولتر TE الرقم الهيدروجيني 8.0 وتخزين في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.

4. تحويل خلايا المبيضات مع FP الحمض النووي كاسيت

  1. في يوم 1، واستعادة الخميرة سلالة أن تتحول من الجلسرين 15٪ المجمدة (-80 درجة مئوية) الأسهم عن طريق تسليط الضوء على عدد قليل من بلورات كشط على سكر العنب الخميرة ببتون مع الأدينين (YPAD) أجار واحتضان عند 30 درجة مئوية. بعد انتعاش النمو مستعمرة، تلقيح مستعمرة واحدة في 2 مل السائل المتوسطة YPAD في أنبوب ثقافة الزجاج مع غطاء للتنفس واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الإثارة.
  2. في يوم 2، وتمييع 300 ميكرولتر من ثقافة خميرة بين عشية وضحاها إلى 50 مل YPAD جديدة (لOD النهائي 600 من ~ 0.2) في 125 مل دورق مخروطي مع وضع حد أقصى للتنفس. هزة في 30 ° Cل~ 3 ساعات (إلى OD النهائي 600 ~ 0،6-0،8).
    1. صب الثقافة بين عشية وضحاها في أنبوب مخروطي 50 مل وبيليه الخلايا من خلال الدوران لمدة 5 دقائق في 500 x ج 1 في أعلى الجدول الطرد المركزي.
    2. تخلصي وتجاهل بشكل صحيح طاف. resuspend الكرية خلية في 5 مل من الماء. إعادة بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 1500 x ج في أعلى الجدول الطرد المركزي.
    3. تخلصي وتجاهل بشكل صحيح طاف. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر TELiAc (TE خلات ليثيوم: 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، 0.1 M الليثيوم خلات)، في حين نقل إلى أنبوب 1.5 مل. أنبوب الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 3000 x ج في microcentrifuge.
    4. Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر TELiAc. يجب أن يكون الحجم الكلي بما في ذلك بيليه ~ 300 ميكرولتر.
  3. ل(أنبوب مختلفة microfuge من في 4.2.4) نظيف، إضافة 5 ميكرولتر الحمض النووي الناقل (10 ملغ / مل) و 150 ميكرولتر من خلايا المبيضات التحضير (من 4.2.4). هذا هو السيطرة السلبية لرransformation.
    1. لأنبوب الثاني microfuge نظيفة، إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل التشويه والتحريف (التي سبق غليه في 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ويتم تبريده الى 4 درجات مئوية)، كل ميكرولتر 40 من الناتج PCR استعداد (من 3.3.1) و 150 ميكرولتر من خلايا المبيضات التحضير (من 4.2.4).
    2. احتضان يمزج التحول اثنين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. إلى كل أنبوب مزيج التحول، إضافة 700 ميكرولتر مزيج لوحة (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، 0.1 M خلات الليثيوم في 50٪ البولي ايثيلين جلايكول 3350). وعكس أنابيب خلط واحتضان لهم بين عشية وضحاها في RT.
  4. في يوم 3، واحتضان التحول يمزج في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (الصدمة الحرارية).
    1. أجهزة الطرد المركزي في التحول يخلط لمدة 30 ثانية في 16000 x ج في microcentrifuge. إزالة والتخلص بشكل صحيح طاف. resuspend كل من الكريات الخلايا في 150 ميكرولتر المياه من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا، وذلك لعدم تلف الخلايا.
    2. لتحولات التحريرilizing الجينات علامة بعامل نمائي (على سبيل المثال URA3)، لوحة كل خليط كامل من قبل pipetting الحلول على أجار وسائل الإعلام الانتقائي المناسب (على سبيل المثال يوريدين تفتقر) وانتشرت الخليط بالتساوي باستخدام الخرز الزجاجي معقمة.
    3. لتحولات الاستفادة من nourseothricin الجينات المقاومة علامة (NAT1)، كما هو موضح هنا، تحول لوحة يخلط أولا على أجار YPAD غير انتقائي واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 6-12 ساعة. يتم تطبيق هذه المساعدات خطوة في الانتعاش الخلية، وبعد الصدمة الحرارية، قبل nourseothricin الإجهاد.
    4. بعد انتعاش النمو جزئي، لوحة نسخة طبق الأصل من خلايا المبيضات على YPAD تحتوي على 400 ميكروغرام / مل nourseothricin. لتحولات استخدام الجينات علامة الغذائية (مثل URA3)، ليست هناك حاجة هذه الخطوة الطلاء المتوسطة والخلايا يمكن مطلي مباشرة على وسائل الاعلام خميرة انتقائي (على سبيل المثال YPAD تفتقر يوريدين) كما هو موضح في 4.4.2.
      ملاحظة: إذا كان التحول ناجحا، العقيدonies يجب أن تظهر ضمن 1-3 أيام (يحتمل أن تصل إلى خمسة أيام من ثمرة للاختيار على أجار التي تحتوي على nourseothricin). يجب أن تظهر أي مستعمرات على لوحات مع انتشار يمزج التحول تحتوي على الحمض النووي الناقل وحده (المراقبة السلبية).
  5. لبعامل نمائي وnourseothricin اختيار علامة، خط transformants المفترضة كما المستعمرات واحد لوحات أجار وسائل الإعلام الانتقائي الطازجة واحتضان عند 30 درجة مئوية إلى نقل خلايا الخميرة التي يمكن فرزهم عن البناء الناجح للاندماج FP.
  6. transformants الشاشة للاندماج الصحيح للكاسيت علامات (انظر ممثل النتائج لمثال تفصيلي). إذا يتم التعبير عن الجينات في المصالح في كميات كافية، قد تحدث كله مستعمرة مضان بحيث بات من الممكن الكشف عن integrants المرشحة المحتملة باستخدام نظام التصوير لوحة مع القدرة الكشف عن مضان.
    1. تحقق integrants المفترضة من قبل PCR باستخدام بادئات مثلي لتسلسل outsid(ه) من منطقة التكامل لتأكيد الاندماج إلى الجين المستهدف.
    2. وبالإضافة إلى ذلك، والنظر في تحليل لطخة غربية لتحديد التعبير وحجم البروتين الانصهار، وكذلك عن طريق الفحص المجهري مضان من الخلايا واحد للتأكيد البصري للتوطين البروتين، إذا كان معروفا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

على سبيل المثال، استخدمنا بروتوكول المذكورة أعلاه لبناء GFP وmCherry اندماج لEno1 في C. سلالة المرطية المختبر. وقد restreaked كل المحولة المفترض في البداية للنمو. في هذا المثال، منذ انصهار بروتين الناتج وأعربت غاية (إينولاز) وضباط الإتصال مشرقة، كنا قادرين على الشاشة transformants بواسطة المجهر مضان قبل إجراء التشخيص PCR (الشكل 3) 6.

الشكل (3)
الشكل (3): مضان مستعمرة التي أظهرتها transformants المبيضات. صور الممثل نمو الخميرة لوحة الحصول عليها باستخدام نظام المسح الضوئي ليزر مجهزة مرشح و Cy3 لصورة سلالة mCherry في التعبير عن ومرشح Cy2 لصورة YFP- والسلالات، معربا عن GFP. غادر لوحة في كل زوج، FP-expressiنانوغرام السلالات. اللوحة اليمنى في كل زوج، غير متحولة سلالة الأم (4175) تصوير مع نفس الفلتر كما في FP، معربا عن سلالة المقابلة. وبعد التصور، والمقلوب الصور وتم تعديل السطوع والتباين مماثل لتنظيم الأسرة، معربا عن وسلالات السيطرة. لقد طبع هذا الرقم بإذن من ركيناوات، وآخرون. 6 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم عزل الحمض النووي الجينوم 9 من كل من هذه transformants المفترضة واستخدامها كقالب الحمض النووي، جنبا إلى جنب مع الاشعال مكملة لتسلسل المرافقة مواقع التكامل كاسيت (أي تسلسل خارج حيث F و R الاشعال يصلب داخل مكان الجيني المراد الكلمات الدلالية) ، في تقارير إتمام المشروعات التشخيص للتحقق التكامل الصحيح للكاسيت FP العلاقات العامة فقطIOR إلى رامزة توقف من الجينات في المصالح. وتجدر الإشارة، لتحولات الليثيوم خلات مع C. المرطية، لاحظنا انخفاض كفاءة (~ 1-2٪ من المستعمرات فحص تحتوي على التكامل الصحيح) بالمقارنة مع تجربتنا مع جيم البيض التحولات.

لتحليل إينولاز توطين، لاحظنا خلايا الخميرة معربا عن Eno1-FP يبني بواسطة المجهر مضان باستخدام مجهر تصويري مجهزة مصباح الزئبق 100 واط والإضاءة epifluorescence مع GFP، YFP وتكساس الأحمر تصفية مجموعات. تم استخدام كاميرا الجهاز المسؤول عن جانب (CCD) لجمع الصور التي تم معالجتها مع برنامج تحليل الصور (الشكل 4A) 6. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن مختلفة FP الألوان كانت مفيدة للتمييز بصريا سلالات الخميرة مختلفة داخل خليط (الشكل 4B) 6. لأن إينولاز وأعربت للغاية وتقع فيجزء كبير من خلايا الخميرة، واندماج FP إلى أنه يمكن استخدامها لتوليد سلالات الخميرة الفلورسنت التي يمكن تصور بسهولة، على سبيل المثال، في تحليل التفاعلات المبيضات -host.

الشكل (4)
الشكل 4: التعبير وتوطين اندماج Eno1-FP بواسطة المجهر مضان. (A) الإسفار (أعلى) وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC، أسفل) وصور لسلالات المبيضات معربا عن Eno1-ضباط الإتصال. Eno1-ضباط الإتصال في C. البيض وجيم المرطية تميل إلى التركيز في النواة، وكذلك في السيتوبلازم، ولكن بدرجة أقل من ذلك بكثير. (ب) وصور مجهرية للثقافة مختلطة من سلالات المبيضات معربا عن Eno1-mCherry وEno1-GFP. اللوحة اليمنى، تكساس مرشح الأحمر. لوحة مركز، مرشح GFP. اللوحة اليمنى، ودمج كل من لوحات نيون مع صورة مدينة دبي للإنترنت. على نطاق والحانات = 10 ميكرون. لقد طبع هذا الرقم بإذن من ركيناوات، وآخرون. 6 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اندماج FP أيضا تسهيل تحليل مستويات بروتين تعبير من قبل الغرب النشاف. باستخدام خلايا الخميرة الناتجة عن بروتوكول المذكورة أعلاه، تم عزل البروتينات من الخلية لست]، مفصولة دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE)، ونقل إلى ثنائي فلوريد متعدد الفينيليدين (PVDF) غشاء 10. تم الكشف عن اندماج Eno1-FP على البقع باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا كما هو موضح سابقا 6. لفترة وجيزة، والماوس مكافحة GFP (1: 2000 تمييع)، تليها الفجل-البيروكسيديز مترافق الماعز المضادة للماوس مفتش (1: 10،000 تمييع) استخدمت الأجسام المضادة للتحقيق لGFP- وYFP تاإينولاز gged. أرنب مكافحة mCherry (1: 2000 تمييع) تليها الفجل-البيروكسيديز مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش: استخدمت (1 10،000 تمييع) الأجسام المضادة للتحقيق لإينولاز mCherry الموسومة. تم الكشف عن البروتينات الانصهار بسهولة من لست] من transformants الناجحة (الشكل 5، الممرات 2 و 5 و 7) (6) وكانت من الحجم المتوقع (~ 75 كيلو دالتون) بالمقارنة مع مستوى البروتين سلم والمعايير جيم البيض إينولاز-FP ( الرقم 5، والممرات 1 و 6) (6). وقد لوحظ عدم وجود إشارة لعلامة عليه سلالة الخميرة الأم (الشكل 5، والممرات 3 و 4) 6.

الرقم 5
الرقم 5: طخة مناعية من الخلية لست] من سلالات الكانديدا. حارة 1، C. المبيضة البيضاء التي تحتوي على الانصهار ENO1 -mCherry (J. بيرمان، جامعة مينيسوتا) (مراقبة إيجابية)؛ 2 لين، C. المرطية تحتوي على ENO1 -mCherry الانصهار. الممرات 3 و 4، هو دون تغيير جيم المرطية سلالة الأم 4175 11 (المراقبة السلبية). حارة 5، C. المرطية تحتوي على ENO1 -YFP الانصهار. حارة 6، C. المبيضة البيضاء التي تحتوي على ENO1 -GFP الانصهار (J. بيرمان، جامعة مينيسوتا) (مراقبة إيجابية)؛ حارة 7، C. المرطية تحتوي على ENO1 -GFP الانصهار. حارة L، سلم البروتين مع 98 و 64 معايير البروتين كيلو دالتون المشار إليها. وحضنت الممرات 1-3 مع مكافحة mCherry الأجسام المضادة والممرات 4-7 وحضنت مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP. لقد طبع هذا الرقم بإذن من ركيناوات، وآخرون. 6 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الصفحة = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
بروتوكول الخطوة / البند تعديل تحسين المحتملين (التحذيرات)
تصميم التمهيدي إطالة الاشعال من قبل بما في ذلك منطقة أطول من التماثل إلى مكان الجيني من الفائدة تحسين كفاءة ملزمة وإعادة التركيب مثلي (تعديل طول التمهيدي قد تتغير درجات الحرارة الصلب المثلى)
PCR (جودة amplicon) استخدام أعلى الإخلاص طق
هلام تنقية المنتج PCR
تقليل مقدمة من أخطاء في تسلسل كاسيت لتحسين استهداف التمهيدي لالجينوم تسلسل وكفاءة التحول (تنقية هلام قد يقلل كمية amplicon وبالتالي كفاءة التحول)
PCR (كمية amplicon) زيادة عدد من ردود الفعل PCR وتجمع المنتجات الزيادهعدد (ه) من الخلايا تحولت (الكثير من amplicon يمكن أيضا أن يؤدي إلى انخفاض كفاءة التحول)
كاسيت هطول الأمطار أداء الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، والحفاظ على جميع الكواشف وأنابيب على الجليد زيادة العائد الحمض النووي، وبالتالي كفاءة التحول
صدمة حرارية اختصار الوقت تحسين قابلية خلايا الخميرة أكد (أقصر الأوقات الصدمة الحرارية ويمكن أيضا أن يؤدي إلى امتصاص انخفضت من كاسيت DNA من الخلايا)
انتعاش النمو 1 السماح للانتعاش أطول على أجار YPAD قبل الطلاء على أجار التي تحتوي على nourseothricin خلايا الخميرة شدد قد تحتاج أوقات الانتعاش أطول عند تعرضها للnourseothricin (مرات حضانة أطول قد تزيد أيضا الملوثات والنمو المحولة إيجابية كاذبة)
مستعمرة ثمرة 1،2 احتضان لوحات لفترات أطول (~ 5 د) شارعخلايا الخميرة ressed قد تحتاج حضانة مرات أطول لنمو مستعمرة (مرات حضانة أطول قد تزيد أيضا الملوثات والنمو المحولة إيجابية كاذبة)
1 خاص لتحولات باستخدام اختيار NAT1 علامة أو 2 تحولات سلالات الخميرة التي تحتوي على الطفرات الجينية التي تؤثر على النمو

الجدول 2: دليل لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسينها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بناء حاتمة الموسومة تسلسل في المبيضات باستخدام استراتيجية تعديل الجينات بوساطة PCR-المذكورة أعلاه يمكن تلخيصها على النحو عملية من ثلاث خطوات. أولا، يتم إجراء كاسيت من قبل PCR الذي يشفر كل من التسلسل المطلوب لتحقيق التكامل والمناطق مثلي إلى موضع الإدراج في الجينوم الخميرة. ثانيا، يتم إجراء خلايا الخميرة إلى أن تتحول المختصة كيميائيا مع خلات الليثيوم وشارك في تحضين مع الكاسيت. ثالثا، ومطلي الخلايا على وسائل الاعلام انتقائية لاسترداد transformants ويتم اختبار الناتجة مستعمرات للاندماج الصحيح من الكاسيت إلى موضع الجيني المطلوب.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول لتحسين معدل النجاح من الحصول على البروتين الانصهار فلوري في C. البيض وجيم المرطية. أولا، استخدام البادئات التي تم تنقيته بواسطة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE، من قبل الشركة المصنعة) هو تفصيل للغايةommended. بغير طهور، وهناك زيادة احتمال الحصول على الاشعال من أطوال غير صحيحة في المنتج النهائي، والتي يمكن أن تقلل من الكفاءة التي الكاسيت يدمج موضع الجيني المقصود من إعادة التركيب مثلي. ثانيا، نحن نعتقد بأن التحقق من أن شريط علامات لدت PCR-هي ذات جودة عالية، من خلال تحليل ~ 5 ميكرولتر من الحمض النووي كاسيت من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز لضمان حجم الصحيح من المنتج PCR. ثالثا، للحصول على خلايا الخميرة التي هي الأمثل للتحول، وينبغي أن تكون الخلايا في مرحلة سجل النمو، مع براعم الخميرة واضحة بواسطة المجهر قبل استخدامها. رابعا، لا بد من استخدام تقنية pipetting لطيف خلال إعادة تعليق من خلايا الخميرة تتحول بعد الصدمة الحرارية وقبل الطلاء على وسائط انتقائية. خامسا، لاختيار المحولة على nourseothricin، وهي سامة للخلايا الخميرة، والسماح لمزيد من الوقت للنمو على أجار YPAD قبل تكرار على المتوسطة التي تحتوي على nourseothricin قد يكون beneficial لتعزيز الانتعاش من transformants. يحدث الماضي، البلازميد سليمة وPCR التكامل كاسيت خارج الموقع الجيني المقصود في الترددات المنخفضة في المبيضات وسوف يؤدي أيضا إلى نمو مستعمرة. وبالتالي، فمن الضروري تحليل جميع المستعمرات تحويلها من قبل PCR باستخدام بادئات خارج تسلسل استخدامها لتحقيق التكامل. لtransformants التي يتم التحقق منها من قبل PCR ولكن لا تظهر مضان بواسطة المجهر، وينبغي النظر في تحليل لطخة غربية من الخلية لست] والتسلسل لمواصلة التحقيق في سبب بناء أو فشل التصور. وبالإضافة إلى هذه الخطوات الحاسمة، هناك العديد من الخطوات في البروتوكول التي يمكن تعديلها، إذا لزم الأمر، لتحسين كفاءة التحويل وزيادة وتيرة التكامل كاسيت الصحيح. ويرد دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 2.

وهناك أوجه القصور المحتملة لهذه التقنية التي يمكن أن يكون الأمثل للتطبيقات المستقبلية. وlithiuطريقة م خلات تستخدم لتحويل نتائج الحمض النووي في أقل كفاءة (~ 1-2٪ من المستعمرات فحص تحتوي على التكامل الصحيح) لC. المرطية 12، بالمقارنة مع جيم البيض. Electroporation للهو نهج بديل لالليثيوم التحول خلات التي قد تحسين كفاءة تحويل 13. استخدام فاصل ADH1، في حين اللازمة لطريقة وضع علامات عالمية، قد يتغير الاستقرار و / أو تنظيم مرنا الناتجة عن تلك التي كانت ستحدث مع تسلسل فاصل الأصلي. وتحتاج هذه مشكلة محتملة لأخذها في الاعتبار عند وظيفة الأم من بروتين مهم لمسألة بحثية محددة. لبروتينات اندماج الفلورسنت التي يتم التعبير عنها في مستويات منخفضة، كلها مستعمرة الفحص المجهري لتحديد أو الشاشة لtransformants ناجحة قد لا يكون خيارا. في هذه الحالة، سوف PCR وتحليلات لطخة غربية تقديم أدلة على نجاح الانصهار البروتين sequسينعقد البناء / البروتين. وجود قيود، مشتركة بين جميع الانشاءات البروتين الانصهار، هو أن علامات حاتمة يمكن أن تتداخل مع وظيفة الأم من البروتين، مما أدى إلى الظواهر متحولة غير مقصودة، بما في ذلك توطين غير طبيعية من البروتين الانصهار. النظر في هذه القضايا مهم وينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة كما هو محدد.

البلازميدات مفيدة لتوليد علامات حاتمة في المبيضات هذا النهج بوساطة PCR، بالإضافة إلى تلك المذكورة هنا، قد سبق ولدت من قبل المجموعات البحثية لدينا، وهي متاحة للباحثين من خلال علم الوراثة مركز اسهم الفطرية (HTTP: //www.fgsc. شبكة). كما يمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول العديد من هذه البلازميدات في (http://www6.tau.ac.il/berman/). البلازميدات المتاحة تحتوي على عدد لا يحصى من مجموعات من علامات المقاومة الغذائية والأدوية، وتسلسل FP لتوليد الخميرة ملونة مختلفة، وغيرها من الخيارات العلامة حاتمة (HA، MYC، V5، HIS9) لتوليد البروتينات التي عالبريد الموسومة في أي تسلسل carboxy- أو الأمينية ترميني، ومروج للتعبير التأسيسية وregulatable من البروتينات. البلازميدات التي تحتوي على علامات مقاومة المخدرات هي مفيدة بشكل خاص في مجال المرضية الفطرية كما تسمح هذه الأداة لتحويل ودراسة سلالات الخميرة السريرية التي أنموذجية التغذي، مما يجعل علامات الغذائية التقليدية غير صالحة للاستعمال. وبناء سلالات المبيضات السريرية أن يتألق في أطوال موجية مختلفة تكون مفيدة لمجموعة متنوعة من المقايسات خلية البيولوجية التي تتطلب القدرة على تصور وتمييز عدة سلالات الخميرة في الثقافة المشتركة.

لا يزال مرض فطري الغازية بسبب المبيضات يشكل تحديا صحة الإنسان الكبير الذي يصعب علاجه ويترافق مع معدلات الاعتلال والوفيات العالية، خاصة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة 14 و 15. وهكذا، والأدوات الجزيئية التي تسمح البحوثالمتطلبات البيئية لأكثر بسرعة وسهولة دراسة المبيضات التفاعلات الأنواع المضيفة هي في غاية الاهمية لتعزيز فهمنا لآليات البيولوجيا والتسبب المبيضات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر N. عميد لتوفير الأصلي تسلسل mCherry FP، M. جيرامي نجاد لبناء البلازميدات، B. لارسون لتقديم المساعدة التقنية، وT. Heisel للحصول على المشورة المفيدة خلال تطوير هذا المشروع. وأيد JB من قبل جائزة الأوروبي مجلس البحوث المتقدمة 340087 (RAPLODAPT). وقدمت أنظمة المجهر والتصوير من جامعة مينيسوتا مؤسسة طب الأطفال ومركز جامعة التصوير ولاية مينيسوتا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 W mercury lamp CHIU Technical Corporation M-100T
95% Ethanol Any NA
Adenine Any NA
Ampicillin Any NA
Carrier DNA Ambion AM9680 Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera Photometrics CoolSNAP HQ
Conical Tube Corning 430828 50 ml
Culture Tube Rotator New Brunswick 2013923 TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade Any NA
Eppendorf Tubes Eppendorf 022363719, 022363212 0.5 ml, 1.5 ml
Erlenmeyer Flask Fisher Scientific 7250089 125 ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any NA
Freezer (-80 °C) Thermo Electron Corporation ULT-1386-9-V Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets Chroma Technology Corporation 49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes Fisher Scientific 1496126 75 mm
HRP goat anti-mouse antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2301
Incubator (30 °C) Any NA
Lithium Acetate Any NA
Lysogeny Broth (LB) Media Any NA
Magnesium Chloride Any NA
Microcentrifuge Eppendorf 5415 D
Microscope Nikon E600 Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody Roche 11814460001
Nourseothricin Fisher Scientific 50997939
PCR Thermocycler Applied Biosystems 9700 GeneAmp PCR System
PCR tubes BioExpress, GeneMate T-3035-1 0.2 ml
Polyethylene Glycol 3350 Any NA
Potassium Chloride Any NA
Rabbit anti-mCherry antibody BioVision 5993-100
Refrigerator (4 °C) Any NA
Sodium Acetate Any NA
Stereomicroscope Nikon SMZ1500
Table Top Centrifuge Labnet Z 400 Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase Any NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Any NA
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media Any NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
  2. Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
  3. Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
  4. Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
  5. Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
  6. Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
  7. Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
  8. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
  9. Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
  10. Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
  11. Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
  12. Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
  13. Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
  14. Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
  15. Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).

Tags

علم الوراثة، العدد 121،
جيل من الإنشطار بروتين فلوري في<em&gt; المبيضات</em&gt; الأنواع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A.More

Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A. Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species. J. Vis. Exp. (121), e55333, doi:10.3791/55333 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter