Summary
PCR-medieret gen modifikation kan anvendes til at danne fluorescerende protein fusioner i Candida arter, hvilket letter visualisering og kvantificering af gærceller og proteiner. Heri præsenterer vi en strategi for at konstruere en fluorescerende protein fusion (Eno1-FP) i Candida parapsilosis.
Abstract
Candida-arter, fremherskende kolonisatorer af intestinale og urogenitale kanaler, er årsag til hovedparten af invasive svampeinfektioner hos mennesker. Således er der behov molekylære og genetiske værktøjer til at lette undersøgelsen af deres sygdomsfremkaldende mekanismer. PCR-medieret gen modifikation er en enkel og hurtig fremgangsmåde til at generere epitopmærkede proteiner for at lette deres detektion. Navnlig fluorescerende protein (FP) fusioner er kraftfulde værktøjer, der giver visualisering og kvantificering af både gærceller og proteiner ved fluorescensmikroskopi og immunoblotting hhv. Plasmider indeholdende FP-kodende sekvenser, sammen med ernæringsmæssige markørgener, som letter omdannelsen af Candida arter, der er blevet genereret i forbindelse med FP konstruktion og ekspression i Candida. Heri præsenterer vi en strategi til at konstruere en FP fusion i en Candida-arter. Plasmider indeholdende nourseothricin Resistance transformation markørgen (Nat1) sammen med sekvenser for enten grøn, gul eller kirsebær RP'er (GFP, YFP, mCherry) anvendes sammen med primere, der omfatter genspecifikke sekvenser i en polymerasekædereaktion (PCR) til at generere en FP kassette . Dette gen-specifik kassette har evnen til at blive integreret i 3'-enden af det tilsvarende gen locus ved homolog rekombination. Vellykket i ramme fusion af FP-sekvensen i genet locus af interesse er verificeret genetisk, efterfulgt af analyse af fusionsprotein-ekspression ved mikroskopi og / eller immuno-detektionsmetoder. Endvidere i tilfælde af højt udtrykte proteiner, succesrige fusioner kan screenes for primært ved fluorescens billeddannelsesteknikker.
Introduction
Candida-arter er kommensale svampe, der koloniserer tarmen og urogenitale kanaler for alle mennesker. Under forhold med immundefekt, såsom at forekomme med for tidlig fødsel eller immunosuppressive virkninger fra behandlinger for kræft, kan Candida arter blive opportunistiske patogener. De Candida arter, Candida albicans er den mest udbredte svampe colonizer og forårsager størstedelen af invasive svampeinfektioner. Andre Candida arter såsom C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis og C. kruseii også forårsage alvorlige infektioner hos immunkompromitterede patienter, med nogle udstiller iboende modstand mod almindeligt anvendte anti-svampe antibiotika såsom fluconazol og amphotericin B. Derfor infektioner med nogle af disse arter er ved at blive hyppigere, især hos patienter, der behandles profylaktisk med anti-svampe agenter. Selv med passende og rettidig enNTI-fungal behandling, invasive Candida-infektioner fortsat forbundet med betydelig morbiditet og mortalitet 1. På grund af betydningen af Candida-arter i menneskers sundhed, er der behov for let tilgængelige molekylære værktøjer, der giver undersøgelse og belysning af deres sygdomsfremkaldende mekanismer.
Et vigtigt værktøj, der giver forskerne at visualisere og kvantificere mikrobielle celler, og de proteiner, som de udtrykker er FP fusionsteknologi. Polymerasekædereaktion (PCR) -medieret genetiske modifikation, som beskrevet i dette dokument, muliggør konstruktionen af fusioner mellem FP-sekvenser og en Candida-protein kodende sekvens af interesse ved dens genomiske locus. Stabil integration af konstruktionen letter analyse af proteinekspression samt proteinlokalisering dynamik. Plasmider indeholdende FP-sekvenser, der er optimeret til ekspression i Candida albicans, og som kan anvendes i PCR-medieret gene modifikation strategi, er tidligere blevet konstrueret 2, 3, 4, 5. Plasmider indeholder FP transformation "kassetter": en FP-sekvens bundet til en ernæringsmæssig markør-gen, der letter omdannelse af C. albicans og C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. Øjeblikket tilgængelige plasmider indeholde forskellige selekterbare ernæringsmæssige markørgener (URA3, His1, ARG4) til transformation af auxotrofe stammer samt en dominerende lægemiddelresistensmarkør (Nat1), hvilket letter omdannelsen af kliniske stammer mangler auxotrofier. Hertil kommer, plasmider indeholder muligheder for op til fire forskellige FP sekvenser (grøn [GFP] yellow [YFP], cyan [FFP], og kirsebær [mCherry]) og enten en ADH1 termineringssekvens til konstruktion af carboxyterminus proteinfusioner, eller en promotorsekvens til konstruktion af aminoterminal proteinfusioner. Primere er designet med homologi til plasmid-DNA'et omkring FP kassetten. Desuden primerne indeholder også 5'-forlængelse sekvenser bærer homologi med gær genet af interesse, der skal mærkes, hvilket letter integration af kassetten i det genomiske locus via homolog rekombination (figur 1). Genspecifikke FP kassetter genereres ved PCR og derefter transformeret ind i Candida celler gjort kompetente til optagelse af DNA ved behandling med lithiumacetat.
Figur 1: Diagram over hvordan FP sekvens-fusioner genereres i Candida-arter. (A) Plasmid DNA herundes en FP og en sekvens, der koder nourseothricin resistens (Nat1). Relative placeringer af Forward (FWD) og reverse (REV) primere er vist, med sorte dele af primerne angiver regionen af homologi til plasmidet sekvensen og den lilla dele der angiver genspecifikke homologi region eller primerforlængelse. (B) FP kassetter omdannes til Candida og integrere i ENO1 genomiske locus via homolog rekombination (stiplede linjer). (C) Resulterende FP fusion sekvens i 3'-enden af ENO1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Heri præsenterer vi et eksempel på protein fusion (Eno1-FP) konstruktioner i Candida arter. Vi bruger tagging plasmider indeholdende Nat1 transformation markørgenet sammen med sekvenser, der koder GFP, YFP, ellermCherry (figur 2). Disse plasmider anvendes sammen med primere i PCR til at generere genspecifikke kassetter, der letter fusion af rammeprogrammerne til 3'-enden af ENO1, hvilket resulterer i ekspression af Eno1 fusioneret til fps ved dets carboxyterminal.
Figur 2: Kort over FP kassette-holdige plasmider. Forward (F) og reverse (R) primere anvendt til generering af kassetterne fra plasmiderne er indikeret sammen med den relative placering af deres homologi med plasmiderne. Primersekvenser er som opregnet i tabel 1. F1 og R1 blev også anvendt til at generere pYFP- Nat1 kassetten. Plasmidet indeholdende YFP- Nat1 kassetten (pMG2263) er identisk med pMG2120 med undtagelse af YFP i stedet for GFP-sekvensen. Kassette størrelser: GFP-Nat1, 3,7 kbp; mCherry- Nat1, 3,2 kb; YFP- Nat1, 3.7 kb. Dette tal har været ændret siden Gerami-Nejad, et al. 4 Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoler Template plasmider fra E. coli
- Grow E. coli indeholdende skabelonen plasmidet natten over i 10 ml lysogeni bouillon (LB) + 200 mg / l ampicillin (AMP) ved 37 ° C under omrystning.
- Harvest celler ved centrifugering ved 6.000 xg i 2 min.
- Dekanteres væske, isolere og oprense DNA fra E. coli-celler ved en standard fremgangsmåde som tidligere beskrevet i Ausubel et al. 8.
- Resuspender DNA i Tris-EDTA (TE; 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) ved en arbejdskoncentration på 50-100 ng / ml.
2. Design Primere
| Primer | primersekvens |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
Tabel 1: Primer sekvenser anvendt i denne undersøgelse. Fed kursiv tekst angiver homologi til ENO1 genomiske locus, normale skrifttype regioner er homologe til plasmid DNA.
- <li> Design primere til at være homologe til plasmid sekvenser der grænser kassetten skal amplificeres og til 3'-enden af mål-genet af interesse (f.eks ENO1) for at lette rekombination i genets genomiske locus (figur 2 og tabel 1) .
- Sikre, at den fremadrettede primer sekvenser matche de sidste 70 basepar (bp) af genet af interesse, 5'3 ', minus stopkodonen, for at opretholde den kodende ramme, plus den første ca. 30 bp af plasmidet sekvensen at være amplificeret. Som en note, den GGTGGTGGTT i hver primer er en poly-glycin linker uden FP homologi. Af note, i mangel af en linker, kan der være direkte fusion af funktionelle domæner, som teoretisk kan føre til protein misfoldning, lavt udbytte i proteinproduktion, eller nedsat bioaktivitet.
- Sørg for, at den omvendte primer sekvenser er 70 bp lige nedstrøms for gen, 3'5 ', ikke herunder enhver gensekvens, plus den sidste hensigtsximately 30 bp af ernæringsmæssige eller lægemiddelresistensmarkør anvendes i plasmidet.
- Brug F1 og R1 til generering GFP- Nat1 og YFP- Nat1 kassetter med pMG2120 og pMG2263 henholdsvis og F2 og R2 til frembringelse mCherry- Nat1 med pMG2343.
3. Generer FP Kassetter ved PCR (dag 1)
- Forbered reagenser til PCR. Foretag en master mix (500 pi slutvolumen) ved tilsætning af følgende mængder og koncentrationer til et 1,5 ml rør: 50 pi PCR-buffer (500 mM kaliumchlorid, 100 mM Tris pH 8,0 i vand), 20 pi deoxynucleotider (dNTP'er; stock blanding af nucleotider ved 10 mM hver), 40 pi 25 mM magnesiumchlorid, 20 pi oprenset plasmid (fra ~ 50-100 ng / pl stamopløsning), 10 pi hver fremadrettet og revers primer (fra 10 mM stamopløsninger), 30 pi Taq polymerase (generisk, 5.000 enheder / ml), og 320 pi vand.
- Portion 50 pi master mix i hver af 10 PCR-komple 0,5 ml rør.
- Placer PCR-rør i thermocycler og køre følgende trin: 1 cyklus på 5 min ved 94 ° C for at denaturere dsDNA; 40 cykler sekventielt af 45 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C for at tillade primerne at anneale til plasmidtemplate DNA og 4 min ved 68 ° C i forlængelse af DNA-produkter; og 1 endelig forlængelsescyklus på 15 minutter ved 72 ° C.
BEMÆRK: PCR Master mix og cykling parametre kan være nødvendigt at ændre på grundlag af særlige Taq polymerase anvendes. - Pool alle produkter fra de 10 PCR-reaktioner i et 1,5 ml rør.
- Om 5 pi poolet PCR-produkt til agarosegelelektroforese for at verificere amplikonstørrelse og opnå et estimat af koncentrationen produkt, baseret på sammenligning med en DNA-stige. Generelt bruger ~ 250 ug kassette DNA i hver efterfølgende transformation mix.
- Udfælde DNA ved tilsætning af 50 pi 3 M natriumacetat, efterfulgt af 750 pi 95% ethanol til produkterne og inkuberes i mindst 30 minved -20 ° C.
- Høst af PCR-produkterne ved centrifugering af røret ved 16.000 xg i 10 min. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten og tør pellet natten over. Resuspender den tørrede DNA-kassette pellet i 40 pi TE pH 8,0 og opbevares ved stuetemperatur indtil anvendelse.
4. Transform Candida Celler med FP DNA Kassetter
- På dag 1, inddrive gærstamme, der skal transformeres fra en 15% glycerol nedfrosset (-80 ° C) lager ved at udstryge et par skrabet krystaller onto gærpepton dextrose med adenin (YPAD) agar og inkuberes ved 30 ° C. Efter genvinding af kolonivækst, inokulere en enkelt koloni i 2 ml flydende YPAD medium i et glas kultur rør med en åndbar hætte og inkuberes natten over ved 30 ° C under omrøring.
- På dag 2 fortyndes 300 pi overnight gærkultur i 50 ml frisk YPAD (til en endelig OD 600 på ~ 0,2) i en 125 ml Erlenmeyer-kolbe med en åndbar hætte. Ryst ved 30 ° Cfor ~ 3 timer (til en endelig OD 600 ~ 0,6-0,8).
- Hæld overnatskultur i en 50 ml konisk rør og pelletere cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 1 500 x g i en bordcentrifuge.
- Hæld og korrekt kassere supernatanten. Resuspender cellepelleten i 5 ml vand. Re-pelletere cellerne ved centrifugering igen i 5 minutter ved 1.500 xg i en bordcentrifuge.
- Hæld og korrekt kassere supernatanten. Resuspender cellerne i 500 pi TELiAc (TE lithiumacetat: 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M lithiumacetat) mens overførsel til et 1,5 ml rør. Centrifugeres i 2 minutter ved 3.000 x g i en mikrocentrifuge.
- Resuspender celler i 250 pi TELiAc. Det totale volumen herunder pelleten bør være ~ 300 pi.
- Til en ren (forskellige mikrofugerør end i 4.2.4), tilsættes 5 pi bærer-DNA (10 mg / ml) og 150 pi forberedt Candida celler (fra 4.2.4). Dette er den negative kontrol for transformation.
- Til en anden ren mikrofugerør, tilsættes 5 pi denatureret bærer-DNA (som er blevet kogt ved 90 ° C i 10 minutter og afkølet til 4 ° C), alle 40 pi af det forberedte PCR-produkt (blandt 3.3.1) og 150 pi fremstillet Candida celler (fra 4.2.4).
- Inkuber de to transformation blandinger i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Til hver transformation blandingsglasset, tilsættes 700 pi PLATE mix (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M lithiumacetat i 50% polyethylenglycol 3350). Invert rørene for at blande og inkubere dem natten over ved stuetemperatur.
- På dag 3, inkuber transformationen blander ved 42 ° C i 1 time (varmeshock).
- Centrifuger transformationen blander i 30 sekunder ved 16.000 xg i en mikrocentrifuge. Fjern og korrekt kassér supernatanten. Resuspender hver af cellepellets i 150 pi vand ved forsigtigt at pipettere op og ned, således at ikke at beskadige cellerne.
- For transformationer utilizing auxotrofe markørgener (f.eks URA3), plade hver hele blandingen ved pipettering løsningerne på passende selektivt medie agar (f.eks mangler uridin) og sprede blandingen jævnt med sterile glaskugler.
- For transformationer, der anvender den nourseothricin resistensmarkørgen (Nat1), som beskrevet her, plade transformation blander først på ikke-selektiv YPAD agar og inkuberes ved 30 ° C i 6-12 timer. Dette trin hjælpemidler i celle opsving, post varme chok, før nourseothricin stress er anvendt.
- Efter delvis genopretning vækst, replika plade Candida celler på YPAD indeholdende 400 pg / ml nourseothricin. For transformationer anvender ernæringsmæssige markørgener (f.eks URA3), er dette mellemprodukt plating trin ikke nødvendigt, og celler kan direkte udpladet på selektive gær medier (f.eks YPAD mangler uridin) som beskrevet i 4.4.2.
BEMÆRK: Hvis transformationen lykkes, colonies skal vises inden for en til tre dage (potentielt op til fem dage af udvækst for udvælgelse på nourseothricin-holdige agar). Ingen kolonier skal vises på plader spredt med transformation blandinger indeholdende carrier DNA alene (negativ kontrol).
- For auxotrof og nourseothricin markør udvælgelse, streak formodede transformanter som enkeltkolonier til friske selektive medier agarplader og inkuberes ved 30 ° C at udbrede gærceller, som kan screenes for vellykket konstruktion af FP-fusioner.
- Screen transformanter for korrekt integration af den tagging kassetten (se Repræsentative resultater for et detaljeret eksempel). Hvis genet af interesse udtrykkes ved tilstrækkelige mængder, kan der forekomme sådan hele koloni fluorescens at det er muligt at detektere potentielle kandidat- integranter ved hjælp af en plade imaging system med fluorescensdetektion evne.
- Check formodede integranter ved PCR under anvendelse af primere homologe med sekvenser outside af regionen integration at bekræfte fusion til målgenet.
- Derudover overveje Western blot-analyse for at bestemme ekspression og størrelsen af fusionsproteinet, såvel som ved fluorescensmikroskopi af enkeltceller til visuel bekræftelse af proteinlokalisering, hvis kendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel har vi benyttet forskrift ovenfor beskrevet for at konstruere GFP og mCherry fusioner til Eno1 i en C. parapsilosis laboratoriestamme. Hver formodet transformant blev oprindeligt genudstrøget for vækst. I dette eksempel, eftersom det resulterende fusionsprotein udtrykkes kraftigt (enolase) og rammeprogrammerne er lyse, kunne vi screene transformanter ved fluorescensmikroskopi forud for udførelse diagnostisk PCR (figur 3) 6.
Figur 3: Colony fluorescens udvist af Candida transformanter. Repræsentative billeder af gær plade vækst opnået ved anvendelse af en laser scanning system udstyret med en Cy3 filter at afbilde mCherry-udtrykkende stamme og en Cy2 filter at afbilde YFP- og GFP-udtrykkende stammer. Venstre panel i hvert par, FP-Express godtng stammer; højre panel i hvert par, ikke-transformerede moderstamme (4175) afbildet med det samme filter som det tilsvarende FP-udtrykkende stamme. Efter visualisering, blev billederne vendes om og lysstyrke og kontrast blev justeret identisk for FP-udtrykkende og kontrolstammer. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra Gonia, et al. 6 Klik her for at se en større version af dette tal.
Genomisk DNA blev isoleret 9 fra hver af disse formodede transformanter og anvendt som DNA-skabelonen, sammen med primere komplementære til sekvenser, der flankerer de steder i kassetten integration (dvs. sekvenser uden for hvor F og R primere annealer inden den tilsigtede genomiske locus, der skal mærkes) , i diagnostiske PCR'er at verificere korrekt integration af den FP kassetten lige prIOR til stopcodonen af genet af interesse. Notatet for lithium acetat transformationer med C. parapsilosis, vi observerede lavere effektivitet (~ 1-2% af screenede kolonier indeholdt en korrekt integration) sammenlignet med vores erfaring med C. albicans transformationer.
For at analysere enolase lokalisering, vi observerede gærceller der udtrykker Eno1-FP-konstruktioner ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af et fotomikroskop udstyret med en 100 W kviksølvlampe og epifluorescensbelysning med GFP, YFP og Texas Red filtersæt. En afgift-coupled device (CCD) kamera blev brugt til at indsamle billeder, der blev behandlet med billedanalyse software (figur 4A) 6. Desuden fandt vi, at forskellige FP farver var nyttige for visuelt at skelne mellem forskellige gærstammer inden en blanding (figur 4B) 6. Fordi enolase udtrykkes kraftigt og placeret ien stor del af gærcellen kan FP fusioner til det anvendes til at generere fluorescerende gærstammer, som let kan visualiseres, fx i analyser af Candida -host interaktioner.
Figur 4: Ekspression og lokalisering af Eno1-FP-fusioner ved fluorescensmikroskopi. (A) Fluorescence (øverst) og differential interferens kontrast (DIC, bund) billeder til Candida-stammer, der udtrykker Eno1-rammeprogrammer. Eno1-FP'er i C. albicans og C. parapsilosis tendens til at koncentrere i kernen og i cytoplasmaet, men i langt mindre grad. (B) Mikroskopiske billeder af en blandet kultur af Candida-stammer, der udtrykker Eno1-mCherry og Eno1-GFP. Right panel, Texas rødt filter; midterpanelet, GFP filter; højre panel, flette både fluorescerende paneler med DIC billedet. Scale barer = 10 um. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra Gonia, et al. 6 Klik her for at se en større version af dette tal.
FP-fusioner også lette analyse af protein-ekspressionsniveauer ved Western blotting. Brug af gærceller genereret af protokollen beskrevet ovenfor, blev proteiner isoleret fra cellelysater, adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran 10. Eno1-FP-fusioner blev påvist på blottene ved anvendelse af kommercielt tilgængelige antistoffer som beskrevet tidligere 6. Kort fortalt, muse-anti-GFP (1: 2.000 fortynding), efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-muse-IgG (1: 10.000 fortynding) antistoffer blev anvendt til at probe for GFP- og YFP-tagged enolase. Kanin-anti-mCherry (1: 2.000 fortynding) efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG (1: 10.000 fortynding) antistoffer blev anvendt til at probe for mCherry-mærket enolase. Alle fusionsproteiner blev let påvises fra lysater af succesfulde transformanter (figur 5, bane 2, 5 og 7) 6 og var af den forventede størrelse (~ 75 kDa) sammenlignet med et protein stigen standard og C. albicans enolase-FP standarder ( Figur 5, bane 1 og 6) 6. Intet signal blev observeret for den umærkede forælder gærstammen (figur 5, bane 3 og 4) 6.
Figur 5: Immunblot af cellelysater fra Candida-stammer. Bane 1, C. albicans indeholder ENO1 -mCherry fusion (J. Berman, University of Minnesota)(Positiv kontrol); bane 2, C. parapsilosis indeholder ENO1 -mCherry fusion; bane 3 og 4, utransformeret C. parapsilosis forælder-stamme 4175 11 (negativ kontrol); bane 5, C. parapsilosis indeholder ENO1 -YFP fusion; bane 6, C. albicans indeholder ENO1 GFP fusion (J. Berman, University of Minnesota) (positiv kontrol); bane 7, C. parapsilosis indeholdende ENO1 -GFP fusion; lane L, protein stige med 98 og 64 kDa protein angivne standarder. Banerne 1-3 blev inkuberet med anti-mCherry antistof og bane 4-7 blev inkuberet med anti-GFP-antistof. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra Gonia, et al. 6 Klik her for at se en større version af dette tal.
| Protokol Step / Item | Modifikation | Potentiel Improvement (advarsler) |
| primer design | Forlænge primere ved at medtage længere region af homologi til genomisk locus af interesse | Forbedre binding effektivitet og homolog rekombination (ændring primer længde kan ændre optimale annealing temperaturer) |
| PCR (amplicon kvalitet) | Brug højere troskab Taq Gel oprense PCR-produkt | Reducer indføring af fejl i kassette sekvenser for at forbedre målretning af primer til genomsekvens og transformationseffektivitet (geloprensning kan nedsætte amplicon mængde og dermed transformationseffektivitet) |
| PCR (amplicon mængde) | Øge antallet af PCR reaktioner og pool produkter | i stigendee antal transformerede celler (for meget amplikon kan også resultere i reduceret transformationseffektivitet) |
| Cassette nedbør | Udfør centrifugering ved 4 ° C, holde alle reagenser og rør på is | Øge DNA udbytte og dermed transformationseffektivitet |
| Heat Shock | Forkorte den tid | Forbedre levedygtighed stressede gærceller (kortere varme chok gange kunne også resultere i nedsat optag af DNA kassette af celler) |
| Recovery Vækst 1 | Tillad længere opsving på YPAD agar før plating til agar indeholdende nourseothricin | Stressede gærceller kan have behov for længere inddrivelse gange når de udsættes for nourseothricin (længere inkubationstider kan også øge forurenende og falsk-positive transformant vækst) |
| Colony Udvækst 1,2 | Pladerne inkuberes i længere tidsrum (~ 5 d) | Stressed gærceller kan have behov længere inkubationstider for kolonivækst (længere inkubationstider kan også øge kontaminant og falsk-positive transformant vækst) |
| 1 Specifikt for transformationer bruger Nat1 udvælgelsesmarkør eller 2 transformationer af gærstammer, der indeholder genetiske mutationer, der påvirker vækst | ||
Tabel 2: Vejledning til fejlfinding og optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstruktion af epitop-tagget sekvenser i Candida-arter ved hjælp af PCR-medieret gen modifikation er beskrevet ovenfor kan sammenfattes som en tre-trins proces. Først en kassette fremstillet ved PCR, der koder både den ønskede for integration og regioner homolog til stedet for indsættelse i gærgenomet sekvens. For det andet er gærcellerne skal transformeres foretages kemisk kompetente med lithiumacetat og co-inkuberet med kassetten. Tredje cellerne udpladet på selektive medier for at inddrive transformanter og resulterende kolonier testes for korrekt integration af kassetten i den ønskede genomiske locus.
Der er flere kritiske trin i denne protokol for at forbedre succesraten for at opnå en fluorescerende fusionsprotein i C. albicans og C. parapsilosis. Første, anvendelse af primere, som er blevet oprenset ved polyacrylamidgelelektroforese (PAGE; af fabrikanten) er stærkt recfales. Uden oprensning er der en øget sandsynlighed for at opnå primere af ukorrekte længder i slutproduktet, hvilket kan reducere effektiviteten, hvormed kassetten integreres i det påtænkte genomiske locus ved homolog rekombination. For det andet, anbefaler vi at kontrollere, at PCR-genererede tagging kassette er af høj kvalitet, ved at analysere ~ 5 pi kassette DNA ved agarosegelelektroforese for at sikre korrekt størrelse af PCR-produktet. For det tredje, for at opnå gærceller der er optimeret til forarbejdning bør celler være i log-vækstfase, med gær knopper tydeligt ved mikroskopi forud for deres anvendelse. For det fjerde er det bydende nødvendigt at anvende forsigtig pipettering teknik under gensuspension af transformerede gærceller efter varmechok og før udpladning på selektive medier. Femte, for transformant selektion på nourseothricin, der er toksisk for gærceller, hvilket giver mere tid til vækst på YPAD agar før replikerende onto nourseothricin-holdigt medium kan være benefskaber: at fremme genvinding af transformanter. Endelig intakt plasmid og PCR kassette integration uden for den tilsigtede genomiske placering sker ved lave frekvenser i Candida og vil også resultere i kolonivækst. Det er således nødvendigt at analysere alle transformerede kolonier ved PCR under anvendelse af primere uden for sekvensen anvendt til integration. For transformanter, der verificeres af PCR, men ikke udviser fluorescens ved mikroskopi, bør overvejes Western blot analyse af cellelysater og sekventering for yderligere at undersøge årsagen til opførelse eller visualisering fiasko. Ud over disse kritiske trin, der er flere trin i den protokol, der kan ændres, hvis det er nødvendigt, for at forbedre transformation effektivitet og øge frekvensen af rigtige kassette integration. En guide fejlfinding er præsenteret i tabel 2.
Der er potentielle begrænsninger i denne teknik, der kan optimeres til fremtidige anvendelser. Den lithium acetat metode til DNA-transformation resulterer i en lavere effektivitet (~ 1-2% af screenede kolonier indeholdt en korrekt integration) for C. parapsilosis 12, sammenlignet med C. albicans. Elektroporering er en alternativ tilgang til lithiumacetattransformation der kan forbedre transformationseffektivitet 13. Anvendelse af ADH1-terminatoren, mens nødvendigt for en universel tagging fremgangsmåde kan ændre stabiliteten og / eller regulering af den genererede mRNA fra det, som ville have fundet sted med det native terminatorsekvens. Denne potentielle spørgsmål skal overvejes, når den indfødte funktion af et protein er vigtig for den specifikke problemstilling. For fluorescerende fusionsproteiner, som udtrykkes ved lave niveauer, hele koloni mikroskopi til at identificere eller skærm for succesfulde transformanter kan ikke være en mulighed. I dette tilfælde vil PCR og Western blot analyser tilvejebringe beviser på vellykket fusionsprotein sequining / protein konstruktion. En begrænsning, der er fælles for alle protein konstruktioner fusion, er, at epitop-tags kan interferere med det native funktionen af proteinet, hvilket resulterer i utilsigtede mutante fænotyper, herunder unormal lokalisering af fusionsproteinet. Behandling af disse spørgsmål er vigtige og passende kontroller bør indgå som angivet.
Plasmider er anvendelige til generering af epitopmærker i Candida ved denne PCR-medieret fremgangsmåde, foruden de her nævnte, er tidligere blevet genereret af vores forskningsgrupper og er tilgængelige for forskere gennem Fungal Genetics Stock Center (http: //www.fgsc. net). Mere information om adskillige af disse plasmider kan også findes på (http://www6.tau.ac.il/berman/). De tilgængelige plasmider indeholder et utal af kombinationer af ernæringsmæssige og resistens-markører, FP-sekvenser til at generere forskellige farvede gær, andre epitop tag indstillinger (HA, myc, V5, HIS9) til at generere proteiner, der are mærket ved enten carboxy- eller amino-termini, og promotorsekvenser til konstitutiv og regulerbar ekspression af proteiner. Plasmider indeholdende lægemiddel resistens markører er særlig gavnlig til området for svampe patogenese da dette værktøj kan for omdannelsen og undersøgelse af kliniske gærstammer som er prototrofisk, rendering konventionelle ernæringsmæssige markører ubrugelig. Konstruktionen af kliniske Candida-stammer, som fluorescerer ved forskellige bølgelængder vil være anvendelige til en række af celle- biologiske assays, der kræver evnen til at visualisere og differentiere flere gærstammer i co-kultur.
Invasiv svampesygdom grundet Candida-arter er fortsat en betydelig menneskers sundhed udfordring, som er vanskelig at behandle og er forbundet med høj sygelighed og dødelighed, især hos immunkompromitterede patienter 14, 15. Således molekylære værktøjer, der giver forskningter til mere hurtigt og nemt at studere Candida arter-vært interaktioner er af vital betydning for at fremme vores forståelse af Candida biologi og sygdomsfremkaldende mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker N. Dean for at give den oprindelige mCherry FP sekvens, M. Gerami-Nejad til opførelse af plasmider, B. Larson til teknisk bistand, og T. Heisel for nyttige råd under udviklingen af dette projekt. JB blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd Advanced Award 340.087 (RAPLODAPT). Mikroskopi og billeddannende systemer blev leveret af University of Minnesota Pediatrics Foundation og University of Minnesota Imaging Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
- Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
- Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
- Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
- Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
- Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
- Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
- Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
- Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
- Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
- Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
- Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
- Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).
