Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Generering av Fluorescent Protein Fusions i Published: March 4, 2017 doi: 10.3791/55333

Summary

PCR-mediert gen modifikasjon kan brukes til å generere fluorescerende proteinfusjoner i Candida art, som muliggjør visualisering og kvantifisering av gjærceller og proteiner. Heri presenterer vi en strategi for å konstruere et fluorescerende protein fusjon (Eno1-FP) i Candida parapsilosis.

Abstract

Candida-arter, utbredt kolonisatorer intestinal og urin traktater, er årsaken til de fleste av invasive soppinfeksjoner hos mennesker. Dermed er molekylære og genetiske verktøy for å legge til rette studiet av deres patogeneserelaterte mekanismer. PCR-mediert genmodifisering er en enkel og rask måte å generere epitop-merket proteiner for å lette deres oppdagelse. Spesielt fluorescerende protein (FP)-fusjoner er kraftige verktøy som tillater visualisering og kvantifisering av både gjærceller og proteiner ved fluorescens mikroskopi og immunblotting, respektivt. Plasmider inneholdende FP kodende sekvenser, sammen med nærings-markørgener som letter transformasjon av Candida arter, er blitt generert i den hensikt å FP konstruksjon og ekspresjon i Candida. Heri presenterer vi en strategi for å bygge en FP fusjon i en Candida-arter. Plasmider som inneholder nourseothricin sveisince transformasjon markør-gen (Nat1) sammen med sekvenser for enten grønn, gul, eller kirsebær FPS (GFP, YFP, mCherry) brukes sammen med primere som inneholder gen-spesifikke sekvenser i en polymerase kjedereaksjon (PCR) for å generere en FP kassett . Dette genspesifikke kassett har evnen til å integrere seg i 3'-enden av det tilsvarende gen locus via homolog rekombinasjon. Vellykket i-ramme fusjon av FP sekvens i genet locus av interesse blir verifisert genetisk, etterfulgt av analyse av fusjonsprotein-ekspresjon ved mikroskopi og / eller immuno-deteksjonsmetoder. I tillegg, i tilfellet av høyt uttrykte proteiner, vellykkede fusjoner kan screenes for i første rekke ved fluorescens bildeteknikker.

Introduction

Candida-arter er commensal sopp som kolonisere tarm og urogenitale områder av alle mennesker. Under tilstander med immunsvikt, så som det som forekommer med prematur fødsel eller immunsuppressive effekter av behandlinger for kreft, kan Candida-arter bli opportunistiske patogener. Av de Candida-arter, er Candida albicans den mest utbredte sopp kolonisator og forårsaker de fleste av invasive soppinfeksjoner. Andre Candida-arter som C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis og C. kruseii også forårsake alvorlige infeksjoner hos immunkompromitterte pasienter, med noen oppviser iboende motstand mot brukte anti-fungal antibiotika slik som fluconazol og amfotericin B. Derfor infeksjoner med noen av disse artene blir observert oftere, spesielt hos pasienter som behandles profylaktisk med antisoppmidler. Selv med riktig og rettidig enNTI-soppbehandling, invasive Candida-infeksjoner fortsette å være assosiert med signifikant morbiditet og mortalitet 1. På grunn av betydningen av Candida-arter i menneskers helse, er det et behov for lett tilgjengelige molekylære verktøy som tillater studiet og klarlegging av deres patogenese mekanismer.

Et viktig verktøy som lar forskere å visualisere og kvantifisere mikrobielle celler og proteiner som de uttrykker er FP fusion teknologi. Polymerase kjedereaksjon (PCR) -mediert gen modifikasjon, slik det er beskrevet i denne artikkelen, tillater bygging av fusjoner mellom FP sekvenser og en Candida-protein-kodende sekvens av interesse ved dens genomiske locus. Stabil integrering av konstruksjonen forenkler analysen av protein ekspresjon, så vel som proteinlokaliserings dynamikk. Plasmider inneholdende sekvenser som FP, optimalisert for ekspresjon i Candida albicans, og som kan brukes i PCR-mediert gene modifikasjon strategi, er tidligere bygget 2, 3, 4, 5. Plasmider som inneholder FP transformasjon "kassetter": et FP-sekvens bundet til et ernæringsmessig markørgen som muliggjør transformasjon av C. albicans og C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. For tiden tilgjengelige plasmider inneholder en rekke valgbare markørgener ernærings (URA3, HIS1, ARG4) for omforming av auxotrofe stammer, så vel som en dominant medikamentresistensmarkør (Nat1), som muliggjør transformasjon av kliniske stammer mangler auxotrophies. I tillegg plasmider inneholder muligheter for opptil fire forskjellige FP sekvenser (grønn [GFP], yellow [YFP], cyan [CFP] og kirsebær [mCherry]) og enten en ADH1 termineringssekvens for bygging av carboxyenden proteinfusjoner, eller en promotorsekvens for bygging av amino-terminale proteinfusjoner. Primerne er utformet med homologi med plasmid-DNA som omgir FP kassetten. I tillegg primerne inneholder også 5'-forlengelse sekvenser som bærer homologi til gjærgenet av interesse å bli merket, noe som letter integrering av kassetten i det genomiske lokuset via homolog rekombinasjon (figur 1). Genspesifikke FP-kassetter er generert ved PCR og deretter transformert inn i Candida-celler som er gjort kompetente for opptak av DNA ved behandling med litium-acetat.

Figur 1
Figur 1: Diagram av hvordan FP sekvens fusjoner blir generert i Candida-arter. (A) Plasmid-DNA inklues en FP sekvens og en sekvens som koder nourseothricin motstand (Nat1). Relative steder av Forward (FWD) og revers (REV) primere er vist med svarte deler av primere som indikerer regionen av homologi til plasmidet sekvens og lilla deler betegner genet spesifikke homologi region eller primer extension. (B) FP kassetter er forvandlet til Candida og integrere i ENO1 genomiske locus via homolog rekombinasjon (stiplede linjer). (C) Resulterer FP fusjon sekvens på 3'end av ENO1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Heri presenterer vi et eksempel på proteinfusjon (Eno1-FP) konstruksjoner i Candida-arter. Vi bruker tagging plasmider som inneholder Nat1 transformasjon markørgenet sammen med sekvenser som koder GFP, YFP, ellermCherry (figur 2). Disse plasmidene brukes sammen med primere i PCR for å generere genspesifikke kassetter som lette fusjon av fps til 3'-enden av ENO1, noe som resulterer i ekspresjon av Eno1 kondensert til fps ved sin karboksy-terminus.

Figur 2
Figur 2: Kart over FP kassett som inneholder plasmider. Forover (F) og omvendt (R) primere som brukes for å generere kassettene fra plasmidene er angitt sammen med den relative plasseringen av deres homologi til plasmidene. Primer sekvenser er som angitt i tabell 1. F1 og R1 ble også brukt for å generere pYFP- Nat1 kassetten. Plasmidet inneholdende YFP- Nat1 kassetten (pMG2263) er identisk med pMG2120 med unntak av YFP i stedet for GFP-sekvensen. Kassett størrelser: GFP-Nat1, 3,7 KBP; mCherry- Nat1, 3,2 kbp; YFP- Nat1, tre.7 kbp. Dette tallet har blitt forandret fra Gerami-Nejad, et al. 4 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Koble Mal Plasmider fra E. coli

  1. Dyrke E. coli som inneholder plasmidet malen over natten i 10 ml lysogeni buljong (LB) + 200 mg / l ampicillin (AMP) ved 37 ° C med risting.
  2. Høste cellene ved sentrifugering ved 6000 xg i 2 min.
  3. Dekanter væsken, isolere og rense DNA fra E. coli-celler ved en standard metode som tidligere beskrevet i Ausubel et al. 8.
  4. Resuspender DNA i Tris-EDTA (TE; 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) ved en arbeidskonsentrasjon på 50-100 ng / ml.

2. Design Primere

primer primer Sequence
F1 5 ' GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 '
R1 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 '
F2 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG
GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 '
R2 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 '

Tabell 1: Primer sekvenser brukt i denne studien. Fet Kursiv tekst indikerer homologi til ENO1 genomiske locus, normale skrift regionene er homolog til plasmid DNA.

    <li> Design primere for å være homologe til plasmid-sekvenser som grenser til kassetten som skal forsterkes, så vel som til den 3'-enden av mål-genet av interesse (f.eks ENO1) for å lette rekombinasjon inn i genets genomiske locus (figur 2 og tabell 1) .
    1. Sørge for at de fremre primersekvensene møter de siste 70 basepar (bp) av genet av interesse, 5'-3 ', minus stoppkodonet, for å opprettholde den kodende rammen, i tillegg til den første tilnærmet 30 bp av plasmidet rekken skal forsterket. Som et notat, GGTGGTGGTT i hver primer er et poly-glysin linker uten FP homologi. Av notatet, i fravær av en linker, det kan være direkte sammensmelting av funksjonelle domener, som teoretisk kan føre til protein misfolding, lavt utbytte i proteinproduksjon, eller svekket bioaktivitet.
    2. Pass på at revers primer sekvenser er 70 bp like nedstrøms av genet, 3'5 ', ikke inkludert eventuelle gensekvens, pluss den siste approximately 30 bp av den ernæringsmessige eller medikamentresistensmarkør som brukes i plasmidet.
    3. Bruk F1 og R1 for å generere GFP- Nat1 og YFP- Nat1 kassetter med pMG2120 og pMG2263 henholdsvis og F2 og R2 til å generere mCherry- Nat1 med pMG2343.

3. Generer FP Kassetter med PCR (Dag 1)

  1. Forbered reagenser for PCR. Lag en master mix (500 mL endelig volum) ved å legge følgende volumer og konsentrasjoner i en 1,5 ml tube: 50 ul PCR buffer (500 mM kaliumklorid, 100 mM Tris pH 8,0 i vann), 20 pl deoksynukleotider (dNTP; lager blanding av nukleotider ved 10 mM av hver), 40 pl 25 mM magnesiumklorid, 20 pl renset plasmid (fra ~ 50 til 100 ng / mL stamløsning), 10 ul hver forover og revers primer (fra 10 mM stamløsninger), 30 ul Taq polymerase (generisk, 5000 enheter / ml), og 320 pl vann.
    1. Delmengde 50 mL av master-mix i hver av 10 PCR-compatible 0,5 ml rør.
  2. Plasser PCR-rørene i thermocycler og kjøre følgende trinn: en syklus på 5 min ved 94 ° C for å denaturere dsDNA; 40 sykluser i rekkefølge av 45 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 55 ° C for å tillate primere for å anneale til plasmid-templat-DNA, og 4 min ved 68 ° C i forlengelse av DNA-produkter; og en endelig forlengelse syklus på 15 minutter ved 72 ° C.
    MERK: PCR mester mix og sykkel parametere må kanskje endres basert på den aktuelle Taq polymerase brukt.
  3. Pool alle produkter fra de 10 PCR reaksjoner i en 1,5 ml tube.
    1. Emne 5 ul av PCR-produktet oppsamlet på agarosegel-elektroforese for å bekrefte amplikonet størrelse og oppnå et estimat av produktkonsentrasjon, basert på sammenligning med en DNA-stige. Vanligvis bruker ~ 250 mikrogram av kassett-DNA i hver påfølgende transformasjon mix.
    2. Utfelles DNA ved tilsetning av 50 ul 3 M natriumacetat, etterfulgt av 750 ul 95% etanol til produktene og inkuberes i minst 30 minved -20 ° C.
    3. Høste PCR-produkter ved sentrifugering av røret ved 16 000 xg i 10 min. Fjern forsiktig og kast supernatanten og tørk pellet over natten. Resuspender den tørkede DNA-pellet kassetten i 40 ul TE pH 8,0 og lagres ved romtemperatur inntil bruk.

4. Transform Candida Celler med FP DNA Kassetter

  1. På dag 1, gjenopprette gjærstamme til å bli forvandlet fra en 15% glycerol frosset (-80 ° C) lager ved å stryke noen få skrapt krystaller ut mot gjær peptone druesukker med adenin (YPAD) agar og inkuberes ved 30 ° C. Etter utvinning av kolonivekst, inokulere en enkelt koloni i 2 ml flytende YPAD medium i et glasskulturrør med en pustende lokk og inkubert over natten ved 30 ° C under omrøring.
  2. På dag 2, fortynne 300 ul over natten gjærkultur i 50 ml frisk YPAD (til en endelig OD 600 på ~ 0,2) i en 125 ml Erlenmeyer-kolbe med et pustende cap. Rist ved 30 ° Cfor ~ 3 timer (til en endelig OD 600 ~ 0,6-0,8).
    1. Hell over natten-kulturen i et 50 ml konisk rør og pelletere cellene ved å spinne i 5 minutter ved 1 500 x g i en bordsentrifuge.
    2. Hell av og riktig kast supernatanten. Cellepelleten suspenderes i 5 ml vann. Re-pellet cellene ved sentrifugering på nytt i 5 min ved 1500 x g i en bordsentrifuge.
    3. Hell av og riktig kast supernatanten. Resuspender cellene i 500 ul TELiAc (TE litiumacetat: 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M litiumacetat) ved overføring til et 1,5 ml rør. Sentrifuger rør i 2 min ved 3000 x g i en mikrosentrifuge.
    4. Resuspender celler i 250 mL TELiAc. Det totale volum inklusive pellet bør være ~ 300 ul.
  3. Til en ren (forskjellig mikrosentrifugerør enn i 4.2.4), tilsett 5 mL bærer-DNA (10 mg / ml) og 150 ul fremstilt Candida-celler (fra 4.2.4). Dette er den negative kontroll for transformation.
    1. Til en andre ren mikrofugerør, tilsett 5 mL av denaturert bærer-DNA (som har blitt kokt ved 90 ° C i 10 min og avkjølt til 4 ° C), alle 40 ul av den fremstilte PCR-produktet (fra 3.3.1) og 150 ul forberedt Candida celler (fra 4.2.4).
    2. Inkuber de to transformasjons mikser i 30 minutter ved romtemperatur.
    3. Til hvert transformasjon blandingsrøret, tilsett 700 ul PLATE mix (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 M litiumacetat i 50% polyetylenglykol 3350). Invertere rør for å blande og inkubere dem over natten ved RT.
  4. På dag 3, inkuber transformasjonen mikser ved 42 ° C i 1 time (varmesjokk).
    1. Sentrifuger transformasjon blander i 30 sekunder ved 16000 x g i en mikrosentrifuge. Fjern og riktig kast supernatanten. Resuspender hver av cellepelletene i 150 mL vann ved forsiktig pipettering opp og ned slik at man ikke å skade cellene.
    2. For transformasjoner utilizing auxotrofe markørgener (f.eks URA3), plate hver hele blandingen ved å pipettere løsningene på den aktuelle selektive medier agar (f.eks mangler uridin) og spre blandingen jevnt ved hjelp av sterile glassperler.
    3. For transformasjoner som benytter den nourseothricin motstand markørgenet (Nat1), slik det er beskrevet her, blander plate transformasjon først på ikke-selektive YPAD agar og inkuberes ved 30 ° C i 6-12 timer. Dette trinnet hjelpemidler i celle utvinning, post varmesjokk, før nourseothricin stress brukes.
    4. Etter delvis vekst utvinning, kopi plate Candida cellene bort på YPAD inneholder 400 mikrogram / ml nourseothricin. For transformasjoner som benytter næringsmarkørgener (f.eks URA3), er dette mellompletteringstrinn ikke nødvendig, og cellene kan bli direkte sådd ut på selektive media gjær (f.eks YPAD mangler uridin) som beskrevet i 4.4.2.
      MERK: Hvis transformasjon er vellykket, colonies skal vises i løpet av én til tre dager (potensielt opp til fem dager med utvekst for utvalget på nourseothricin inneholder agar). Ingen kolonier skal vises på platene spres med transformasjon blandinger som inneholder bærer DNA alene (negativ kontroll).
  5. For auxotrof markør og nourseothricin utvalg, rekke antatte transformanter som enkeltkolonier på friske selektivt medium agarplater og inkubert ved 30 ° C for å forplante gjærceller som kan bli screenet for vellykket konstruksjon av FP-fusjoner.
  6. Skjermtrans for korrekt integrering av tagging kassetten (se Representative Resultater for et detaljert eksempel). Dersom genet av interesse er uttrykt i tilstrekkelige mengder, kan hele kolonien fluorescens forekomme slik at det er mulig å påvise potensiell kandidat integranter ved hjelp av en plate avbildningssystem med fluorescensdeteksjon evne.
    1. Sjekk antatte integranter ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere homologe til sekvenser outside av regionen for integrering for å bekrefte fusjon til målgenet.
    2. I tillegg vurdere Western blot-analyse for å bestemme ekspresjon og størrelsen av fusjonsproteinet, så vel som ved fluorescens mikroskopi av enkeltceller for visuell bekreftelse av protein lokalisering, dersom denne er kjent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et eksempel brukte vi den protokoll som er beskrevet ovenfor for å konstruere GFP og mCherry fusjoner til Eno1 i en C. parapsilosis laboratoriestamme. Hver antatte transformant ble opprinnelig gjenutstrøket for vekst. I dette eksempel, siden det resulterende fusjonsprotein er sterkt uttrykt (enolase) og FPS er lyse, var vi i stand til å screene transformanter ved fluorescens mikroskopi før gjennomføring diagnostisk PCR (figur 3) 6.

Figur 3
Figur 3: Colony fluorescens utstilt av Candida trans. Representative bilder av gjær plate vekst oppnås ved hjelp av en laser scanning system utstyrt med en Cy3 filter for å avbilde mCherry-uttrykke belastning og en Cy2 filter for å avbilde YFP- og GFP-uttrykke stammer. Venstre panel i hvert par, FP-expressing stammer; panel til høyre i hvert par, ikke-transformerte moderstammen (4175) avbildes med det samme filteret som den tilsvarende FP-uttrykkende stamme. Etter visualisering, ble bildene snudd og lysstyrke og kontrast er justert likt for FP-uttrykke og kontrollstammer. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Gonia, et al. 6 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Genomisk DNA ble isolert 9 fra hver av disse antatte transformanter og anvendt som DNA-templat, sammen med primere komplementære til sekvenser som flankerer de områder av kassetten integrering (dvs. sekvenser utenfor der F og R primere glødning innenfor det tiltenkte genomiske locus som skal merkes) i diagnostiske PCR for å verifisere korrekt integrering av FP kassetten bare prior til stoppkodonet til genet av interesse. Av notatet, for litium acetate transformasjoner med C. parapsilosis, observerte vi lavere effektivitet (~ 1-2% av koloniene screenet inneholdt en riktig integrering) sammenlignet med vår erfaring med C. albicans transformasjoner.

Å analysere enolase lokalisering, observerte vi gjærceller uttrykker Eno1-FP konstruerer ved fluorescens mikroskopi ved hjelp av en photomicroscope utstyrt med en 100 W kvikksølvlampe og epifluorescence belysning med GFP, YFP og Texas Red filtersett. En CCD (CCD) kamera ble brukt til å samle bilder som ble behandlet med bildeanalyse programvare (figur 4A) 6. I tillegg har vi funnet at forskjellige farger FP var nyttige for visuelt å skille mellom forskjellige gjærstammer i en blanding (figur 4B) 6. Fordi enolase er sterkt uttrykt og ligger ien stor del av gjærcellen, kan FP fusjoner til den brukes til å generere fluorescerende gjærstammer som kan bli lett å visualisere, for eksempel, i analyser av Candida -host interaksjoner.

Figur 4
Figur 4: Uttrykk og lokalisering av Eno1-FP fusjoner av fluorescens mikroskopi. (A) Fluorescens (øverst) og differensial interferens kontrast (DIC, nederst) bilder for Candida-stammer som uttrykker Eno1-fps. Eno1-fps i C. albicans og C. parapsilosis har en tendens til å konsentrere seg i kjernen, så vel som i cytoplasma, men til en mye lavere grad. (B) mikroskopiske bilder av en blandet kultur av Candida-stammer som uttrykker Eno1-mCherry og Eno1-GFP. Høyre panel, Texas rødt filter; center panel, GFP filter; panel til høyre, slå sammen både fluorescerende paneler med DIC bilde. Skala barer = 10 mikrometer. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Gonia, et al. 6 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

FP fusjoner også legge til rette for analyse av protein expression nivåer ved Western blotting. Ved hjelp av gjærceller som er generert av den protokoll som er beskrevet ovenfor, ble proteinene isolert fra cellelysatene, adskilt av natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE), og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran 10. Eno1-FP fusjoner ble oppdaget på blotter ved hjelp av kommersielt tilgjengelige antistoffer som tidligere beskrevet seks. I korthet mus anti-GFP (1: 2000 fortynning), etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert geit-anti-mus IgG (1: 10.000 fortynning) antistoffer ble anvendt for å probe for GFP- og YFP-tagged enolase. Kanin anti-mCherry (1: 2000 fortynning), etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert geit-anti-kanin-IgG (1: 10.000 fortynning) antistoffer ble anvendt for å probe for mCherry merkede enolase. Alle fusjonsproteiner ble lett detektert fra lysater av vellykkede transformanter (Figur 5, sporene 2, 5 og 7) 6, og var av forventet størrelse (~ 75 kDa) sammenlignet med en protein stige standard og C. albicans enolase-FP-standarder ( figur 5, felt 1 og 6) 6. Ikke noe signal ble observert for den ukodede modergjærstammen (figur 5, kolonnene 3 og 4) 6.

Figur 5
Figur 5: Immunoblot av cellelysater fra Candida-stammer. Lane 1, C. albicans inneholder ENO1 -mCherry fusjon (J. Berman, University of Minnesota)(Positiv kontroll); lane 2, C. parapsilosis inneholder ENO1 -mCherry fusjon; kolonnene 3 og 4, ikke-transformerte C. parapsilosis moderstammen 4175 11 (negativ kontroll); lane 5, C. parapsilosis inneholder ENO1 -YFP fusjon; kjørefelt 6, C. albicans inneholder ENO1 -GFP fusjon (J. Berman, University of Minnesota) (positiv kontroll); lane 7, C. parapsilosis inneholder ENO1 -GFP fusjon; lane L, protein stige med 98 og 64 kDa protein standarder angitt. Felt 1-3 ble inkubert med anti-mCherry antistoff og kolonnene 4-7 ble inkubert med anti-GFP-antistoff. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Gonia, et al. 6 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protokoll Trinn / post modifikasjon Potensielle Improvement (advarsler)
grunning design Forlenge primere ved å inkludere lenger region av homologi til genomisk locus av interesse Forbedre binding effektivitet og homolog rekombinasjon (endre primer lengde kan endre optimale annealing temperaturer)
PCR (fragment kvalitet) Bruk høyere fidelity Taq
Gel rense PCR produktet
Reduser innføring av feil i kassett sekvenser for å bedre målretting av primer til genomsekvens og transformasjon effektivitet (gel rensing kan redusere amplicon kvantitet og dermed transformasjon effektivitet)
PCR (fragment mengde) Øke antall PCR reaksjoner og basseng produkter Increase antall transformerte celler (for mye amplikon kan også resultere i redusert transformasjonseffektivitet)
kassett nedbør Utfør sentrifugering ved 4 ° C, holde alle reagenser og rør på is DNA øke utbytte og, følgelig, transformasjon effektivitet
Heat Shock Forkorte tiden Forbedre levedyktigheten av belastede gjærceller (kortere varmesjokktider kan også resultere i redusert opptak av DNA kassett av celler)
Recovery Vekst 1 Tillat for lengre utvinning på YPAD agar før plating til agar som inneholder nourseothricin Stressede gjærceller kan trenge lengre utvinning ganger når de utsettes for nourseothricin (lengre inkubasjonstid kan også øke forurensningen og falske positive transform vekst)
Colony utvekst 1,2 Inkuber platene for lengre tid (~ 5 d) Stressed gjærceller kan trenge lengre inkubasjonstid for kolonivekst (lengre inkubasjonstid kan også øke forurensningen og falske positive transform vekst)
1 Spesifikt for transformasjoner ved hjelp Nat1 seleksjonsmarkør eller 2 transformasjoner av gjærstammer som inneholder genetiske mutasjoner som påvirker vekst

Tabell 2: Veiledning for feilsøking og optimalisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bygging av epitop tagget sekvenser i Candida-arter ved hjelp av PCR-mediert genmodifisering strategi beskrevet ovenfor kan oppsummeres som en tre-trinns prosess. For det første er en kassett laget ved PCR som koder for både den ønskede for integrering og regioner homologe til det geometriske sted for innføring i gjærgenomsekvens. For det andre, blir gjærcellene som skal transformeres gjøres kjemisk kompetent med litiumacetat og ko-inkubert med kassetten. For det tredje, blir cellene sådd ut på selektivt medium for å gjenvinne transformanter og resulterende kolonier blir undersøkt for riktig integrering av kassetten i den ønskede genomiske locus.

Det er flere viktige skritt i denne protokollen for å forbedre suksessrate på å skaffe et fluorescerende fusjonsprotein i C. albicans og C. parapsilosis. Først bruk av primere som har blitt renset ved polyakrylamidgelelektroforese, er svært rec (PAGE av produsenten)er anbefalt. Uten rensing, er det en økt sannsynlighet for å oppnå primere av ukorrekte lengder i det ferdige produkt, noe som kan redusere effektiviteten med hvilken kassetten integreres i den tiltenkte genomiske lokuset ved homolog rekombinasjon. For det andre, anbefaler vi at du bekrefter at PCR-genererte merking kassetten er av høy kvalitet, ved å analysere ~ 5 mL av kassett DNA ved agarosegelelektroforese for å sikre riktig størrelse på PCR-produktet. For det tredje, for å oppnå gjærceller som er optimalisert for transformasjon, bør cellene være i loggen vekstfase, med gjær knopper tydelige ved mikroskopi før deres bruk. Fjerde, er det viktig å bruke milde pipetteringsteknikk under oppvirvling av transformerte gjærceller etter varme sjokk og før plating på selektive medier. Femte, for transformant utvalg på nourseothricin, som er giftig for gjærceller, slik at mer tid for vekst på agar YPAD før replikerende på nourseothricin-inneholdende medium kan være beneficial å fremme gjenvinning av trans. Sist, intakte plasmid og PCR kassett integrering utsiden av det tilsiktede genomiske stedet forekommer ved lave frekvenser i Candida, og vil også resultere i kolonivekst. Således er det nødvendig å analysere alle transformerte kolonier ved PCR ved bruk av primere utenfor sekvensen som brukes for integrering. For transformanter som er bekreftet ved hjelp av PCR, men ikke oppviser fluorescens ved mikroskopi, bør Western blot-analyse av cellelysater og sekvensering anses å ytterligere undersøke årsaken til konstruksjon eller visualisering svikt. I tillegg til disse viktige skritt, er det flere trinn i protokollen som kan endres om nødvendig, for å forbedre transformasjon effektivitet og øke hyppigheten av riktig kassett integrering. En feilsøkingsguiden er presentert i tabell 2.

Det er potensielle begrensninger i denne teknikk som kan være optimalisert for fremtidige anvendelser. den Lithium-Ionm acetat metode anvendt for DNA-transformasjon resulterer i en lavere effektivitet (~ 1-2% av koloniene screenet inneholdt en riktig integrasjon) for C. parapsilosis 12, sammenlignet med C. albicans. Electroporation er en alternativ tilnærming til litiumacetatmetoden transformasjon som kan forbedre transformasjon effektivitet 13. Bruk av ADH1 terminatoren, mens nødvendig for en universell metode merking, kan forandre stabiliteten og / eller regulering av den genererte mRNA fra det som ville ha forekommet med den native terminatorsekvensen. Dette potensielle problemet må tas i betraktning når de innfødte funksjon av et protein er viktig for den spesifikke problemstillingen. For fluorescerende fusjonsproteiner som kommer til uttrykk ved lave nivåer, hele kolonien mikroskopi for å identifisere eller skjerm for vellykkede trans kan ikke være et alternativ. I dette tilfellet vil PCR og Western blot analyser gi bevis på vellykket fusjonsprotein sequhet / protein byggingen. En begrensning som er felles for alle fusjonsproteinkonstruksjoner, er at epitop lapper kan forstyrre den opprinnelige funksjon av proteinet, noe som resulterer i utilsiktede mutante fenotyper, inkludert unormal lokalisering av fusjonsproteinet. Vurdering av disse spørsmålene er viktige og nødvendige kontroller bør inkluderes som angitt.

Plasmider nyttige for å generere epitop tagger i Candida av dette PCR-mediert tilnærming, i tillegg til de som er nevnt her, har tidligere blitt generert av våre forskningsgrupper og er tilgjengelig for forskere gjennom Fungal Genetics Stock Senter (http: //www.fgsc. nett). Mer informasjon om flere av disse plasmider kan også bli funnet på (http://www6.tau.ac.il/berman/). De tilgjengelige plasmider inneholder et mylder av kombinasjoner av ernæringsmessige og legemiddelresistensmarkører, FP-sekvenser for å generere forskjellige farger gjær, andre epitop tag alternativer (HA, myc, V5, HIS9) for å generere proteiner som are merket ved enten karboksy- eller amino-termini, og promotersekvenser for konstitutiv og regulerbar ekspresjon av proteiner. Plasmider som inneholder stoffet resistensmarkører er spesielt gunstig for feltet av sopp patogenesen som dette verktøyet åpner for transformasjon og studier av kliniske gjærstammer som er prototrofe, rendekonvensjonelle ernæringsmessige markører ubrukelig. Konstruksjonen av kliniske Candida-stammer som fluorescerer ved forskjellige bølgelengder vil være nyttig for en rekke celle biologiske analyser som krever evne til å visualisere og differensiere flere gjærstammer i ko-kulturen.

Invasive soppsykdommer på grunn av Candida-arter fortsetter å være en betydelig helse- utfordring som er vanskelig å behandle, og er forbundet med høy sykelighet og dødelighet, spesielt hos immunkompromitterte pasienter 14, 15. Dermed molekylære verktøy som tillater forskningers til raskere og enklere å studere Candida-arter-vert interaksjoner er svært viktig for å fremme vår forståelse av Candida biologi og patogeneserelaterte mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker N. Dean for å gi den opprinnelige mCherry FP sekvens, M. Gerami-Nejad for bygging av plasmider, B. Larson for teknisk assistanse, og T. Heisel for nyttige råd under utviklingen av dette prosjektet. JB ble støttet av European Research Council Advanced Award 340087 (RAPLODAPT). Mikroskopi og bildesystemer ble gitt av University of Minnesota Pediatrics Foundation og University of Minnesota Imaging Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 W mercury lamp CHIU Technical Corporation M-100T
95% Ethanol Any NA
Adenine Any NA
Ampicillin Any NA
Carrier DNA Ambion AM9680 Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera Photometrics CoolSNAP HQ
Conical Tube Corning 430828 50 ml
Culture Tube Rotator New Brunswick 2013923 TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade Any NA
Eppendorf Tubes Eppendorf 022363719, 022363212 0.5 ml, 1.5 ml
Erlenmeyer Flask Fisher Scientific 7250089 125 ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any NA
Freezer (-80 °C) Thermo Electron Corporation ULT-1386-9-V Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets Chroma Technology Corporation 49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes Fisher Scientific 1496126 75 mm
HRP goat anti-mouse antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2301
Incubator (30 °C) Any NA
Lithium Acetate Any NA
Lysogeny Broth (LB) Media Any NA
Magnesium Chloride Any NA
Microcentrifuge Eppendorf 5415 D
Microscope Nikon E600 Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody Roche 11814460001
Nourseothricin Fisher Scientific 50997939
PCR Thermocycler Applied Biosystems 9700 GeneAmp PCR System
PCR tubes BioExpress, GeneMate T-3035-1 0.2 ml
Polyethylene Glycol 3350 Any NA
Potassium Chloride Any NA
Rabbit anti-mCherry antibody BioVision 5993-100
Refrigerator (4 °C) Any NA
Sodium Acetate Any NA
Stereomicroscope Nikon SMZ1500
Table Top Centrifuge Labnet Z 400 Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase Any NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Any NA
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media Any NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
  2. Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
  3. Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
  4. Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
  5. Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
  6. Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
  7. Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
  8. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
  9. Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
  10. Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
  11. Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
  12. Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
  13. Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
  14. Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
  15. Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).

Tags

Genetikk , PCR-mediert genmodifisering fluoriserende protein, Lithium acetate transformasjon,
Generering av Fluorescent Protein Fusions i<em&gt; Candida</em&gt; Arter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A.More

Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A. Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species. J. Vis. Exp. (121), e55333, doi:10.3791/55333 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter