Summary
Modificação do gene mediada por PCR pode ser usado para gerar fusões de proteínas fluorescentes em espécies de Candida, o que facilita a visualização e quantificação das células de levedura e proteínas. Aqui, nós apresentamos uma estratégia para a construção de uma fusão proteína fluorescente (ENO1-FP) em Candida parapsilosis.
Abstract
Espécies de Candida, colonizadores prevalentes das vias intestinais e genito-urinário, são a causa da maioria das infecções fúngicas invasivas em humanos. Assim, ferramentas moleculares e genéticos são necessários para facilitar o estudo de seus mecanismos de patogénese. modificação do gene mediada por PCR é uma abordagem simples e rápida para gerar proteínas marcadas no epitopo para facilitar a sua detecção. Em particular, a proteína fluorescente (FP) fusões são ferramentas poderosas que permitem a visualização e quantificação de ambas as células de levedura e proteínas por microscopia de fluorescência e imunotransferência, respectivamente. Os plasmídeos contendo as sequências de codificação de FP, juntamente com genes marcadores nutricionais que facilitam a transformação de espécies de Cândida, foram geradas com a finalidade de construção e expressão em FP Candida. Aqui, nós apresentamos uma estratégia para a construção de uma fusão FP em uma espécie de Candida. Os plasmídeos contendo o trabalho a prova nourseothricingene transformação marcador NCE (NAT1), juntamente com sequências, quer para verde, amarelo, ou cereja PQ (GFP, YFP, mCherry) são utilizados juntamente com iniciadores que incluem sequências específicas de gene numa reacção em cadeia da polimerase (PCR) para gerar uma cassete de FP . Esta cassete de gene-específico tem a capacidade de se integrar na extremidade 3 'do locus do gene correspondente através de recombinação homóloga. Bem sucedida de fusão em-quadro da sequência de FP no locus do gene de interesse é verificada geneticamente, seguido por análise de expressão de proteína de fusão por microscopia e / ou métodos de detecção de imuno. Além disso, para o caso de proteínas altamente expressas, fusões bem sucedidas pode ser rastreada para principalmente por técnicas de imagem por fluorescência.
Introduction
Espécies de Candida são fungos comensais que colonizam as vias intestinais e genito-urinário de todos os seres humanos. Sob condições de imunodeficiência, tal como o que ocorre com o nascimento prematuro ou efeitos imunossupressores de tratamentos para o cancro, espécies de Cândida pode tornar-se agentes patogénicos oportunistas. Das espécies de Candida, Candida albicans é o colonizador fúngica mais prevalente e faz com que a maioria das infecções fúngicas invasivas. Outras espécies de Candida, como C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. kruseii também causar infecções graves em pacientes imunocomprometidos, com algumas apresentando resistência intrínseca aos comumente utilizados antibióticos anti-fúngicas, como fluconazol e anfotericina B. Assim, infecções com algumas destas espécies estão sendo observados com maior frequência, especialmente em pacientes que estão sendo tratados profilaticamente com agentes anti-fúngicos. Mesmo com uma adequada e atempadatratamento nti-fúngica, infecções por Candida invasivos continuem a ser associado com uma morbidade e mortalidade significativas. Devido à importância de espécies de Candida em saúde humana, existe uma necessidade para ferramentas moleculares prontamente disponíveis que permitem o estudo e a elucidação dos seus mecanismos de patogénese.
Uma importante ferramenta que permite que os pesquisadores para visualizar e quantificar células microbianas e as proteínas que eles expressam é a tecnologia de fusão FP. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) do gene mediada por modificação, tal como descrito no presente documento, permite a construção de fusões, entre as sequências de FP e uma proteína Candida sequência codificante de interesse no seu locus genómico. A integração estável da construção facilita a análise da expressão da proteína, bem como dinâmica localização de proteínas. Os plasmídeos contendo as sequências de PF, optimizado para a expressão em Cândida albicans e que pode ser utilizado no g mediada por PCRestratégia de modificação eno, foram previamente construídas 2, 3, 4, 5. Os plasmídeos contêm FP transformação de "cassetes": uma sequência de FP ligado a um gene marcador nutricional que facilita a transformação de C. albicans e C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. Actualmente plasmídeos disponíveis contêm uma variedade de genes de selecção marcadores nutricionais (URA3, His1, ARG4) para a transformação de estirpes auxotróf iças, bem como um marcador de resistência a droga dominante (NAT1), o que facilita a transformação de estirpes clínicas falta auxotrophies. Além disso, os plasmídeos contêm opções para até quatro sequências FP diferentes (verde [GFP], yelloW [YFP], ciano [PCP], e cereja [mCherry]) e, ou uma sequência de terminação de ADH1 para construção de fusões de proteína carboxi-terminal, ou uma sequência promotora para a construção de proteínas de fusão do terminal amino. Os iniciadores foram concebidos com homologia com o ADN de plasmídeo em torno da cassete de FP. Além disso, os iniciadores contêm também sequências 5'-extensão portadoras de homologia para o gene de levedura de interesse a ser marcado, o que facilita a integração da cassete no locus genómico através de recombinação homóloga (Figura 1). Cassetes de genes específicos de FP são gerados por PCR e, em seguida, transformados em células de Candida tornadas competentes para a absorção de ADN por meio do tratamento com acetato de lítio.
Figura 1: Diagrama de como fusões de sequências de FP são geradas em espécies de Candida. (A) inclu O DNA de plasmídeoes uma sequência FP e uma sequência que codifica nourseothricin resistência (NAT1). localizações relativas da frente (FWD) e inverso (REV) iniciadores são mostrados, com porções pretas dos iniciadores que indicam a região de homologia com a sequência de plasmídeo e as porções roxo que denotam a região de homologia específico para o gene ou a extensão do iniciador. Cassetes (B) FP são transformados em Candida e integrar dentro do locus genómico ENO1 através de recombinação homóloga (linhas pontilhadas). (C) resultante sequência de fusão de FP na extremidade 3 'de ENO1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Aqui, apresentamos um exemplo de proteína de fusão (ENO1-FP) construções em espécies de Candida. Nós utilizam a marcação de plasmídeos contendo o gene NAT1 transformação marcador juntamente com as sequências que codificam GFP, YFP, oumCherry (Figura 2). Estes plasmídeos são usados juntamente com iniciadores de PCR para gerar cassetes de gene-específicos que facilitam a fusão de PQ para a extremidade 3 'de ENO1, resultando em expressão de ENO1 fundido com PQ no seu terminal carboxi.
Figura 2: Mapas de FP plasmídeos contendo cassetes. Para a frente (F) e inverso (R) iniciadores utilizados para gerar as cassetes dos plasmídeos estão indicados juntamente com a localização relativa da sua homologia com os plasmídeos. As sequências dos iniciadores são como listados na Tabela 1. F1 e R1 também foram utilizadas para gerar a cassete pYFP- NAT1. O plasmídeo contendo a cassete de YFP- NAT1 (pMG2263) é idêntico ao pMG2120 com excepção da YFP no lugar da sequência de GFP. Formatos de cassete: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kpb; YFP- NAT1, 3.7 kpb. Este valor foi modificado a partir Gerami-Nejad, et al. 4 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Modelo Isolar os plasmídeos a partir de E. coli
- Crescer E. coli contendo o plasmídeo molde durante a noite em 10 ml de caldo de lisogenia (LB) com 200 mg / L de ampicilina (AMP), a 37 ° C com agitação.
- Células colheita por centrifugação a 6000 xg durante 2 min.
- Decantar líquido, isolar e purificar DNA a partir de células de E. coli por um método padrão tal como previamente descrito em Ausubel et al. 8.
- ADN Ressuspender em Tris-EDTA (TE; Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0) a uma concentração de trabalho de 50-100 ng / ml.
2. Projeto Primers
| cartilha | sequência iniciadora |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
Tabela 1: As sequências dos iniciadores utilizados neste estudo. Texto em itálico a negrito indica homologia com o locus genómico ENO1, as regiões de fonte normais são homólogas ao plasmídeo de ADN.
- <li> conceber iniciadores para ser homólogo ao plasmídeo sequências limítrofes da cassete a ser amplificado, bem como para a extremidade 3 'do gene alvo de interesse (por exemplo, ENO1) para facilitar a recombinação em local genómico do gene (Figura 2 e Tabela 1) .
- Assegure-se que as sequências de iniciador de sentido directo corresponder aos últimos 70 pares de bases (pb) do gene de interesse, 5'-3 ', menos o codão de paragem, para manter a grelha de codificação, além do primeiro, aproximadamente 30 pb da sequência de plasmídeo a ser amplificado. Como uma nota, o GGTGGTGGTT em cada iniciador é um ligante de poli-glicina com nenhuma homologia de FP. É de notar, na ausência de um agente de ligação, pode haver fusão directa de domínios funcionais, o que pode teoricamente conduzir a enrolamento incorrecto da proteína, baixo rendimento na produção de proteínas, ou bioactividade prejudicada.
- Certifique-se que as sequências de primer reverso são 70 bp a jusante do gene, 3'-5 ', não incluindo qualquer sequência do gene, mais a última approdamente 30 pb do marcador nutricional ou resistência a drogas usadas no plasmídeo.
- Uso F1 e R1 a gerar cassetes GFP NAT1 e YFP- NAT1 com pMG2120 e pMG2263, respectivamente e F2 e R2 para gerar mCherry- NAT1 com pMG2343.
3. Gerar FP Cassetes por PCR (Dia 1)
- Prepare os reagentes para a PCR. Adicione uma mistura principal (500 volume final ul), adicionando os seguintes volumes e concentrações para um tubo de 1,5 ml: 50 ul de tampão de PCR (cloreto de potássio 500 mM, Tris 100 mM, pH 8,0 em água), desoxinucleótidos 20 ul (dNTPs; mistura estoque de nucleótidos em 10 mM de cada), cloreto de magnésio 40 ul de 25 mM, 20 ul do plasmídeo (~ 50-100 ng de solução de estoque / ul purificada), 10 ul de cada iniciador directo e (a partir de soluções de estoque 10 mM reverso), 30 ul de Taq polimerase (genérico, 5.000 unidades / ml), e 320 ul de água.
- Alíquota de 50 ul da mistura principal em cada um dos 10-PCR compatible 0,5 ml de tubos.
- Colocar os tubos de PCR no termociclador e executar os passos seguintes: 1 ciclo de 5 minutos a 94 ° C para desnaturar ADNcd; 40 ciclos de 45 s sequencialmente a 94 ° C, 30 seg a 55 ° C para permitir que os iniciadores para hibridar com o ADN molde de plasmídeo, e 4 min a 68 ° C para extensão de produtos de ADN; e um ciclo de extensão final de 15 min a 72 ° C.
NOTA: A PCR Master Mix e ciclismo parâmetros podem precisar de ser modificado com base na polimerase Taq particular usado. - Piscina todos os produtos das reações 10 de PCR em um tubo de 1,5 ml.
- Sujeito 5 ul de produtos de PCR reunidos para electroforese em gel de agarose para verificar a dimensão do amplicon e obter uma estimativa da concentração do produto, com base em comparação com uma escada de ADN. Geralmente, utilizar ~ 250 ug de ADN em cada cassete de mistura de transformação subsequente.
- Precipitar o DNA por adição de acetato de 50 ul de sódio 3M seguida por 750 ul de etanol a 95% para os produtos e incubar pelo menos 30 mina -20 ° C.
- Colher os produtos de PCR por centrifugação do tubo a 16.000 xg durante 10 min. Remova cuidadosamente e elimine o sobrenadante e secar o sedimento durante a noite. Ressuspender o sedimento cassete de ADN secou-se em 40 ul de TE, pH 8,0 e armazenar a temperatura ambiente até à sua utilização.
4. transformar células de Candida com FP DNA Cassetes
- No Dia 1, recuperar estirpe de levedura a ser transformada a partir de uma glicerol 15% congelado (-80 ° C) da riscando algumas cristais raspados Onto dextrose de levedura peptona de agar com adenina (YPAD) e incubar a 30 ° C. Após a recuperação do crescimento de colónias, inocular uma única colónia em 2 ml de meio YPAD líquido num tubo de cultura de vidro com uma tampa respirável e incubar durante a noite a 30 ° C com agitação.
- No Dia 2, dilui-se a 300 ul de cultura de levedura durante a noite em 50 ml YPAD fresco (para uma DO final de 600 ~ 0,2) num balão de Erlenmeyer de 125 ml com uma tampa respirável. Agitar a 30 ° Cpara ~ 3 horas (a um OD final de 600 ~ 0,6-0,8).
- Verter a cultura durante a noite num tubo cónico de 50 ml e sedimentar as células por centrifugação durante 5 min a 1 500 xg numa centrifugadora de bancada.
- Deitar fora e descartar adequadamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de água. Re-sedimentar as células por centrifugação novamente durante 5 min a 1500 xg numa centrifugadora de bancada.
- Deitar fora e descartar adequadamente o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul TELiAc (acetato de lítio TE: Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, acetato de lítio 0,1 M) durante a transferência para um tubo de 1,5 ml. Centrifugar o tubo durante 2 min a 3000 x g numa microcentrífuga.
- Ressuspender as células em 250 ul TELiAc. O volume total, incluindo o sedimento deve ser ~ 300 uL.
- Para um (tubo de microcentrífuga diferente do que em 4.2.4) limpo, adicionar 5 uL de ADN transportador (10 mg / ml) e 150 ul de células de Candida preparada (a partir de 4.2.4). Este é o controlo negativo para o transformation.
- Para um segundo tubo de microcentrífuga limpo, adicionam-se 5 ul de ADN de transporte (desnaturado que foi fervida a 90 ° C durante 10 min e arrefeceu-se para 4 ° C), todos os 40 ul do produto de PCR preparado (a partir de 3.3.1) e 150 ul de células de Candida preparado (a partir de 4.2.4).
- Incubam-se as duas misturas de transformação durante 30 min à temperatura ambiente.
- Para cada tubo de mistura de transformação, adicionar 700 ul de mistura placa (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, acetato de lítio 0,1 M em 50% de polietileno glicol 3350). Inverta os tubos para misturar e incubar durante a noite à RT.
- No Dia 3, incubar a transformação mistura a 42 ° C durante 1 h (choque térmico).
- Centrifugar a transformação mistura durante 30 segundos a 16000 xg numa microcentrífuga. Retirar e descartar adequadamente o sobrenadante. Ressuspender cada um dos sedimentos celulares em 150 ul de água por suavemente pipetando para cima e para baixo de modo a não danificar as células.
- Para transformações UTilizing genes marcadores auxotróf icos (por exemplo, URA3), cada placa totalidade da mistura pipetando as soluções para o meio de agar selectivo apropriado (por exemplo, uridina falta) e espalhar a mistura uniformemente com esferas de vidro estéreis.
- Para transformações utilizando o gene marcador de resistência nourseothricin (NAT1), como descrito aqui, a transformação placa primeira mistura em agar YPAD não selectivo e incuba-se a 30 ° C durante 6-12 h. Este passo ajuda na recuperação das células, choque pós calor, antes nourseothricin estresse é aplicado.
- Após a recuperação parcial de crescimento, placa replica as células de Candida Onto YPAD contendo 400 ug / ml nourseothricin. Para transformações utilizando genes marcadores nutricionais (por exemplo, URA3), este passo intermediário chapeamento não é necessária e as células podem ser directamente plaqueadas em meios selectivos de levedura (por exemplo, falta de uridina YPAD) tal como descrito em 4.4.2.
NOTA: Se a transformação for bem sucedida, colonies deve aparecer dentro de um a três dias (potencialmente até cinco dias de crescimento para a seleção no agar contendo nourseothricin-). Há colônias devem aparecer em placas espalhadas com misturas de transformação contendo DNA transportador sozinho (controle negativo).
- Para a selecção do marcador auxotrófico e nourseothricin, raia transformantes putativos como colónias individuais para placas frescas de agar de meio selectivo e incuba-se a 30 ° C, para propagar as células de levedura que podem ser rastreados para a construção de fusões bem sucedidas FP.
- Transformantes de tela para a integração correta da cassete de marcação (ver resultados representativos para um exemplo detalhado). Se o gene de interesse é expresso em quantidades suficientes, toda colónia de fluorescência pode ocorrer de tal modo que é possível detectar integrantes candidatos potenciais, utilizando um sistema de imagem da placa com capacidade de detecção de fluorescência.
- Verificar integrantes putativos por PCR utilizando iniciadores homólogos às sequências Outside da região de integração para confirmar a fusão do gene alvo.
- Além disso, considerar a análise de transferência de Western para determinar a expressão e o tamanho da proteína de fusão, bem como por microscopia de fluorescência de células individuais para a confirmação visual da localização da proteína, se for conhecida.
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Representative Results
Como um exemplo, utilizou-se o protocolo descrito acima para GFP e mCherry fusões de ENO1 numa estirpe de laboratório C. parapsilosis. Cada transformante putativo foi inicialmente novamente riscados para o crescimento. Neste exemplo, uma vez que a proteína de fusão resultante é altamente expresso (enolase) e PQ são brilhantes, fomos capazes de rastrear os transformantes por microscopia de fluorescência, antes de realizar PCR de diagnóstico (Figura 3) 6.
Figura 3: Colony fluorescência exibida pelos transformantes de Candida. Imagens representativas de crescimento placa de levedura obtida utilizando um sistema de varredura a laser equipado com um filtro Cy3 para a imagem da estirpe mCherry expressando e um filtro Cy2 para a imagem da YFP- e estirpes que expressam GFP. painel da esquerda em cada par, FP-expressing estirpes; painel da direita em cada par, a estirpe-mãe não transformada (4175) fotografada com o mesmo filtro como a estirpe FP-expressando correspondente. Na sequência de visualização, as imagens foram invertidas e brilho e contraste foram ajustados de forma idêntica para FP-expressar e estirpes de controlo. Este valor é reproduzido com permissão de Gonia, et al. 6 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ADN genómico foi isolado 9 a partir de cada um destes transformantes putativos e usado como molde de ADN, juntamente com iniciadores complementares a sequências que flanqueiam os sítios de integração da cassete (ou seja, sequências fora de que F e R iniciadores emparelham dentro do locus genómico destina-se a ser marcado) , em PCRs de diagnóstico para verificar a correcta integração da cassete FP apenas prIOR para o codão de paragem do gene de interesse. De nota, para transformações de acetato de lítio com C. parapsilosis, observou-se menor eficiência (~ 1-2% de colónias pesquisadas continha uma integração correcta), em comparação com a nossa experiência com C. albicans transformações.
Para analisar localização enolase, observou-se células de levedura que expressam ENO1-FP constrói por microscopia de fluorescência utilizando um fotomicroscópio equipado com uma lâmpada de mercúrio de 100 W e com iluminação de epifluorescência GFP, YFP e conjuntos de filtros vermelho do Texas. Uma câmara de dispositivo de carga acoplada (CCD) foi utilizado para a recolha de imagens que foram processados com o software de análise de imagem (Figura 4A) 6. Além disso, descobrimos que diferentes cores FP eram úteis para distinguir visualmente diferentes cepas de leveduras dentro de uma mistura (Figura 4B) 6. Porque enolase é altamente expresso e localizado emuma grande parte da célula de levedura, de PF fusões com ele pode ser usado para gerar estirpes de levedura fluorescentes que podem ser facilmente visualizadas, por exemplo, em análises de interacções Candida -host.
Figura 4: Expressão e localização de fusões ENO1-FP por microscopia de fluorescência. (A) de fluorescência (topo) e contraste de interferência diferencial (DIC, parte inferior) imagens de cepas de Candida expressar ENO1-PQ. ENO1-PQ em C. albicans e C. parapsilosis tendem a concentrar-se no núcleo, assim como no citoplasma, mas a um grau muito mais baixo. (B) As imagens microscópicas de uma cultura mista de cepas de Candida que expressam ENO1-mCherry e ENO1-GFP. painel direito, filtro vermelho Texas; painel central, filtro de GFP; painel direito, fusão de ambos os painéis fluorescentes com a imagem DIC. Barras de escala = 10 uM. Este valor é reproduzido com permissão de Gonia, et al. 6 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
PF fusões também facilitar a análise dos níveis de expressão de proteínas por transferência de Western. Usando células de levedura geradas pelo protocolo descrito acima, as proteínas foram isoladas a partir de lisados de células, separadas por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) 10. Fusões ENO1-FP foram detectados nas manchas utilizando anticorpos disponíveis comercialmente tal como anteriormente descrito 6. Resumidamente, de ratinho anti-GFP (1: 2000 de diluição), seguido por peroxidase de rábano silvestre conjugado com anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho (diluição de 1: 10.000) anticorpos foram utilizados para sondar para GFP e YFP-TAenolase gged. De coelho anti-mCherry (1: 2000 de diluição) seguido de IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (diluição de 1: 10.000) anticorpos foram utilizados para sondar para enolase mCherry-tag. Todas as proteínas de fusão foram prontamente detectados a partir de lisados de transformantes de sucesso (Figura 5, pistas 2, 5 e 7) e 6 eram do tamanho esperado (~ 75 kDa), quando comparado com um padrão de proteína de escada e padrões de C. albicans enolase-FP ( A Figura 5, as pistas 1 e 6) 6. Nenhum sinal foi observado para a estirpe de levedura-mãe não marcado (Figura 5, pistas 3 e 4) 6.
Figura 5: imunotransferência de lisados de células de estirpes de Candida. Pista 1, C. albicans contendo fusão ENO1 -mCherry (J. Berman, Universidade de Minnesota)(Controlo positivo); pista 2, C. parapsilosis contendo fusão ENO1 -mCherry; pistas 3 e 4, não transformada C. parapsilosis estirpe progenitora 4175 11 (controle negativo); pista 5, C. parapsilosis contendo ENO1 -YFP fusão; pista 6, C. albicans contendo fusão ENO1 -GFP (J. Berman, Universidade de Minnesota) (controlo positivo); pista 7, C. parapsilosis contendo ENO1 -GFP fusão; pista L, escada de proteína com 98 e 64 padrões kDa indicados. As pistas 1-3 foram incubadas com anticorpo anti-mCherry e as pistas 4-7 foram incubadas com anticorpo anti-GFP. Este valor é reproduzido com permissão de Gonia, et al. 6 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Protocolo Step / item | Modificação | Melhoria potencial (advertências) |
| desenho de primers | Alongar primers incluindo mais região de homologia com lócus genômico de interesse | Melhorar a eficiência de ligação e recombinação homóloga (modificando o comprimento do iniciador pode mudar temperaturas de recozimento óptimas) |
| PCR (qualidade amplicão) | Use maior Taq fidelidade Gel purificar produto de PCR | Reduzir a introdução de erros em sequências de cassete para melhorar o direccionamento de iniciador a sequência do genoma e a eficiência de transformação (gel de purificação pode diminuir a quantidade de amplicão e, portanto, a eficiência de transformação) |
| PCR (quantidade amplicão) | Aumentar o número de reações de PCR e produtos de piscina | increase número de células transformadas (muito amplicão também pode resultar na diminuição da eficiência de transformação) |
| precipitação cassette | Realizar centrifugação a 4 ° C, todos os reagentes e manter os tubos em gelo | Aumentar a produção de DNA e, portanto, a eficiência de transformação |
| Choque Térmico | Encurtar o tempo | Melhorar a viabilidade de células de levedura estressados (tempos de choque térmico mais curtas também poderia resultar na diminuição da absorção de cassete de DNA pelas células) |
| Crescimento de recuperação 1 | Permitir por mais tempo de recuperação em agar YPAD antes do plaqueamento de agar contendo nourseothricin | células de levedura estressadas podem precisar de tempo de recuperação maior quando expostos a nourseothricin (tempos de incubação mais longos podem também aumentar contaminante e crescimento transformante falso-positivo) |
| Colony Conseqüência 1,2 | Incubar as placas para tempos mais longos (5 ~ d) | Stcélulas de levedura ressed pode precisar tempos de incubação mais longos para o crescimento da colônia (tempos de incubação mais longos podem também aumentar contaminante e crescimento transformante falso-positivo) |
| 1 Específico para transformações usando marcador de seleção NAT1 ou 2 transformações das estirpes de leveduras que contêm mutações genéticas que afetam o crescimento | ||
Tabela 2: Guia para solução de problemas e otimização.
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Discussion
Construção de sequências de epitopo etiquetado em espécies de Candida, utilizando a estratégia de modificação de genes mediada por PCR acima descrito pode ser resumido como um processo em três etapas. Em primeiro lugar, a cassete é feita por PCR que codifica a sequência desejada, tanto por integração e regiões homólogas para o locus da inserção no genoma da levedura. Em segundo lugar, as células de levedura a ser transformadas são feitas quimicamente competente com acetato de lítio e co-incubou-se com a cassete. Em terceiro lugar, as células são plaqueadas em meios selectivos para recuperar transformantes e colónias resultantes são testados quanto à integração correcta da cassete no locus genómico desejado.
Há vários passos críticos dentro deste protocolo para melhorar a taxa de sucesso de obtenção de uma proteína de fusão fluorescente no C. albicans e C. parapsilosis. Em primeiro lugar, a utilização de iniciadores que foram purificados por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE; pelo fabricante) é altamente recrecomen-. Sem purificação, há um aumento da probabilidade de obtenção de iniciadores de comprimentos incorrectas no produto final, o que pode diminuir a eficácia com a qual a cassete integra no locus genómico pretendido por recombinação homóloga. Em segundo lugar, recomendamos a verificação de que a cassete de marcação gerado por PCR é de alta qualidade, por meio da análise ~ 5 jil de DNA da cassete através de electroforese em gel de agarose para garantir a correcta tamanho do produto de PCR. Em terceiro lugar, a obtenção de células de levedura que foram optimizadas para a transformação, as células devem estar na fase logarítmica de crescimento, com botões de levedura evidentes por microscopia antes da sua utilização. Quarto, é imperativa a utilização de técnica de pipetagem suave durante a resuspensão de células de levedura transformadas após o choque térmico e antes de plaqueamento em meios seletivos. Em quinto lugar, para a selecção do transformante sobre nourseothricin, que é tóxico para as células de levedura, permitindo mais tempo para o crescimento em agar YPAD antes de replicar em meio contendo nourseothricin pode ser benefcial para promover a recuperação de transformantes. Por último, o plasmídeo intacto e a integração da cassete de PCR fora do local genómico destina ocorrer a baixas frequências em Candida e também vai resultar em crescimento de colónias. Assim, é necessário analisar todas as colónias transformadas, por PCR, utilizando iniciadores externos da sequência utilizada para a integração. Para os transformantes que são verificadas por PCR, mas não apresentam fluorescência por microscopia, análise de transferência de Western de lisados celulares e de sequenciação devem ser considerados para investigar a razão para a construção ou a falha de visualização. Além dessas etapas críticas, há várias etapas no protocolo que podem ser modificadas, se necessário, para melhorar a eficiência de transformação e aumentar a frequência de integração cassete correta. Um guia de solução é apresentado na Tabela 2.
Não há limitações potenciais desta técnica que pode ser optimizado para aplicações futuras. o lithiuMétodo M de etilo utilizado para os resultados de transformação de DNA em uma eficiência mais baixa (~ 1-2% de colónias pesquisadas continha uma integração correta) para C. parapsilosis 12, em relação a C. albicans. A electroporação é uma abordagem alternativa ao lítio transformação de etilo que pode melhorar a eficiência de transformação 13. Uso do terminador de ADH1, embora necessária para um método de marcação universal, podem alterar a estabilidade e / ou regulação do mRNA gerado a partir do que o que teria ocorrido com a sequência de terminação nativo. Esse problema potencial precisa ser considerado quando a função nativa de uma proteína é importante para a questão de pesquisa específica. Para as proteínas de fusão fluorescentes que são expressos em níveis baixos, a microscopia de colónias para identificar todo ou de tela para os transformantes bem sucedidos podem não ser uma opção. Neste caso, a PCR e análises de Western blot fornecerá provas de sequ proteína de fusão bem sucedidaconstrução / proteína cia. Uma limitação, comum a todas as construções de proteínas de fusão, que é marcadores de epitopo podem interferir com a função nativa da proteína, resultando em fenótipos mutantes não desejadas, incluindo a localização anormal da proteína de fusão. Tratamento dessas questões é importante e controles apropriados devem ser incluídos como indicado.
Plasmídeos úteis para a geração de marcadores de epitopo em Candida por esta abordagem mediada por PCR, para além dos mencionados aqui, foram previamente gerado pelo nosso grupo de pesquisa e estão disponíveis para os investigadores através da Fungal Genetics da Center (http: //www.fgsc. líquido). Mais informações sobre vários destes plasmídeos também podem ser encontradas em (http://www6.tau.ac.il/berman/). Os plasmídeos disponíveis contêm uma infinidade de combinações de marcadores de resistência nutricionais e farmacêuticas, sequências de FP para gerar levedura de cor diferente, outras opções de tag epitopo (HA, myc, V5, HIS9) para gerar proteínas que ARe etiquetados em qualquer das sequências de carboxi- ou amino-terminais, e o promotor para a expressão constitutiva de proteínas e regulável. Os plasmídeos que contêm marcadores de resistência a drogas são particularmente benéficos para o campo da patogénese fúngica como esta ferramenta permite a transformação e estudo de estirpes de levedura que são clínicos prototrófica, tornando marcadores nutricionais convencionais inutilizável. A construção de estirpes de Candida clínicos que fluorescem a diferentes comprimentos de onda serão úteis para uma variedade de ensaios de células biológicas que requerem a capacidade de visualizar e diferenciar várias estirpes de levedura, em co-cultura.
Doença fúngica invasiva por espécies de Candida continua a ser um desafio para a saúde humana significativa que é difícil de tratar e está associada com alta morbidade e mortalidade, especialmente em pacientes imunocomprometidos 14, 15. Assim, ferramentas moleculares que permitem pesquisaers a mais rápida e fácil estudar Candida interações espécies hospedeiras são de vital importância para promover nossa compreensão da biologia e patogenia mecanismos de Candida.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos N. Dean para fornecer a sequência mCherry FP original, M. Gerami-Nejad para a construção de plasmídeos, B. Larson para a assistência técnica, e T. Heisel para o conselho útil durante o desenvolvimento deste projeto. JB foi apoiado pelo Prémio Europeu Conselho de Pesquisa Avançada 340.087 (RAPLODAPT). sistemas de microscopia e de imagem foram fornecidos pela Universidade de Minnesota Pediatria Foundation e da Universidade de Minnesota Imaging Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
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