Introduction
Le paludisme est un problème de santé mondial important. 1 Le paludisme sévère se caractérise en partie par une atteinte cérébrale et est souvent un facteur de pronostic médiocre. L'atteinte cérébrale est fréquente chez les enfants de moins de cinq ans dans les zones de transmission élevée du paludisme et représente la principale cause de décès liés au paludisme dans ce groupe d'âge. 1 Bien que le traitement agressif puisse sauver des vies, la détection du paludisme cérébral, surtout au début, peut être difficile. Les processus pathologiques impliqués dans le paludisme cérébral comprennent la perturbation microvasculaire et l'œdème cérébral, ce qui peut entraîner un gonflement grave du cerveau. Dans cet article, nous présentons un protocole d'imagerie par résonance magnétique (IRM) qui permet l'imagerie in vivo du cerveau entier du paludisme cérébral expérimental (ECM). Les méthodes d'imagerie à haute résolution à cerveau complet ont été largement sous-utilisées dans cette maladie, même si on sait peu de choses sur la façon dont l'ECM s'engage dans la centraleSystème nerveux ou quels mécanismes spécifiques conduisent à la maladie. L' IRM in vivo , couvrant l'ensemble du cerveau, représente un outil de recherche important pour mieux comprendre la pathologie ECM. L'IRM est capable d'évaluer le gonflement cérébral cérébral global, récemment reconnu comme un prédicteur important de la mort non seulement dans l'ECM mais aussi dans le paludisme cérébral humain. 2 , 3 Le gonflement du cerveau grave se produit dans une maladie mortelle et représente l'un des nombreux traits pathologiques entre les modèles ECM et les maladies humaines, une maladie caractérisée par des altérations inflammatoires et microvasculaires. 4
L'ECM peut être induite chez les souris CBA ou C57BL par une infection par le Lethal Plasmodium berghei ANKA. 5 L'apparition de l'ECM se produit habituellement entre les jours 6 et 10 après l'infection et entraîne l'ajustement, l'ataxie, la détresse respiratoire et le coma, ce qui conduit au rapId death. 4 L'Échelle Coma et Comportement Murine Rapide (RMCBS) est un score utile pour évaluer les symptômes cliniques de l'ECM. Il se compose de 10 paramètres, chacun évalué de 0 à 2, avec un score maximum possible de 20. 6 Récemment, nous avons montré un bon accord entre la gravité des scores RMCBS chez les souris ECM et les changements pathologiques démontrés par l'IRM. 7 Dans ce protocole, nous décrivons l'induction ECM chez la souris et l'imagerie par résonance magnétique in vivo de souris avec ECM.
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Protocol
Toutes les expérimentations animales rapportées dans cet article ont été menées selon les directives standard de la catégorie B de la Fédération des associations de laboratoire (FELASA) et de la Société des sciences animales de laboratoire (GV-SOLAS) et ont été approuvées par les autorités allemandes locales à Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe , Allemagne). Veuillez noter que le niveau de biosécurité 2 s'applique aux travaux de sporozoïtes ANKA de moustiques et de Plasmodium Berghei.
1. Infection
- Infecte les moustiques Stephensi d'Anopheles avec Plasmodium berghei ANKA en les alimentant pendant 15 min sur une souris gamétocytémique. Gardez les moustiques infectés à 80% d'humidité et 21 ° C.
- Recueillir les moustiques femelles de leur cage 17 à 22 jours après le repas du sang. Placez-les sur de la glace pour les anesthésier.
- À l'aide d'une pince, placez trois à quatre moustiques sur une lame de verre recouverte d'une goutte de milieu RPMI froid. Placez la glissière sous un microscope. <Li> En utilisant une pince, étirer soigneusement le moustique entre la tête et le corps. Isoler la glande salivaire à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Répétez cette procédure avec les autres moustiques.
- Recueillir les glandes salivaires de la glissière de verre en les aspirant avec une pipette en verre et les recueillir dans un tube centrifuge de 1,5 ml.
NOTE: Selon les taux d'infection, habituellement, 8 000 à 15 000 sporozoïtes infectieux peuvent être obtenus par glandes salivaires. - Pendant environ 3 minutes, écrasez les glandes salivaires isolées dans le tube de la centrifugeuse avec un petit bâton en plastique pour isoler les sporozoïtes du tissu des glandes salivaires.
- Centrifuger pendant 3 min à 1000 xg et 4 ° C pour purifier les sporozoïtes des tissus restants.
- Pipeter le surnageant, qui contient les sporozoïtes (SPZ), à un nouveau tube centrifuge et compter les sporozoïtes purifiés dans un hémocytomètre Neubauer.
- Ajuster la concentration de sporozoïtes purifiés à 10 000 / ml en ajoutant du phSolution salée tamponnée par ostéphate.
- Injecter un total de 1000 sporozoïtes (0,1 mL) dans les veines de la queue de souris C57BL / 6 consanguines pour lancer une infection. Pour faciliter les injections, placez les souris C57BL / 6 dans un dispositif de retenue et placez les queues dans de l'eau chaude (environ 37 ° C) pour faciliter la visualisation des veines de la queue;
REMARQUE: l'injection elle-même est une courte procédure qui peut être effectuée en quelques secondes. - Une fois par jour, vérifiez la parasitémie du stade sanguin sur les frottis sanguins à partir du 3ème jour après l'infection à SPZ.
NOTE: Le suivi de la parasitemie a déjà été visualisé dans un article JoVE de Mueller et al. 8 - Évaluez les souris une fois par jour avec le score Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS), à partir du jour 5 après l'injection de sporozoïtes.
NOTE: Une description détaillée de cette procédure, y compris une démonstration vidéo, a été publiée par Caroll et al. 6 - ÉvaluerLes souris avec IRM selon le score RMCBS et la question de recherche à traiter. 6
2. Installation d'imagerie par résonance magnétique
- Effectuez une IRM sur un scanner animal de 9,4T à l'aide d'un résonateur de volume pour la transmission par radiofréquence et d'une bobine réceptrice de surface à 4 canaux. Allumez le bain-marie à température contrôlée à 42 ° C afin de maintenir la température du corps de la souris.
- Induire l'anesthésie dans une chambre en utilisant 2% d'isoflurane et de l'air comprimé jusqu'à ce que la souris ne réagisse plus à un pincement de l'orteil. Maintenir l'anesthésie à 1-1,5%.
- Placez un cathéter de veine de queue dans la veine de queue de la souris. Placez la souris pour l'IRM en la plaçant en position inclinée et avec un revers creusé sur un lit d'animal équipé d'un écouteur et d'une barre dentée pour minimiser le mouvement de la tête. Prenez soin de ne pas redresser la colonne vertébrale cervicale de la souris.
- Raccorder un système d'injection d'agent de contraste au cathéter de veine de queue. Utilisez un système d'injection sur mesure rempli d'une seringue Gd-DTPA (0.3 mmol / kg) ou utilisez un tube PE connecté à une seringue Gd-DTPA (0.3 mmol / kg).
- Appliquer une pommade oculaire au dexpanthenol aux deux yeux. Placez la bobine de tête de récepteur de surface à 4 canaux en phase sur la tête de la souris. Placez un coussin de respiration sur le dos de la souris et connectez-le à un dispositif de surveillance de la respiration.
3. Protocole d'imagerie
REMARQUE: Choisissez les séquences d'imagerie à partir du protocole indiqué ci-dessous en fonction des questions de recherche à traiter. Tous les paramètres répertoriés sont valables pour le logiciel MRI mais peuvent être modifiés si d'autres logiciels sont utilisés.
- Commencez par effectuer une analyse localisée pour vous assurer que le cerveau de la souris est dans l'isocentre de l'aimant.
- Pour évaluer qualitativement l'œdème vasogénique, utilisez l'imagerie pondérée 3D T2 en sélectionnant une séquence RARE multi-tranches.
- Entrez le pa suivantRams dans le logiciel MRI: temps de répétition = 2.000 ms, temps d'écho = 22 ms, résolution isotrope = 0.1mm, champ de vision = 20 x 10 x 12 mm 3 ; Matrice = 200 x 100 x 120, angle de basculement = 90-180 °; (Spin-echo) et facteur rare = 8. Démarrez la séquence et attendez 10 min 48 s pour acquérir les images brutes.
- Pour évaluer quantitativement l'œdème vasogénique, effectuez la relaxometry T2 en sélectionnant une séquence d'écho multi-tranche, à spin multiple.
- Utilisez les paramètres suivants: temps de répétition = 3.100 ms, temps d'écho = 8-136 ms par incréments de 8 ms, nombre de tranches = 17, épaisseur de la tranche = 0,7 mm, résolution du plan = 0.116 mm x 0.116 mm, champ de vision 20 X 20 mm 2 , matrice = 172 x 172, angle de basculement = 90-180 degrés; (Spin-echo). Commencez la séquence et attendez 8 min 53 s pour acquérir les images brutes.
- Pour évaluer quantitativement l'œdème vasogénique et l'œdème cytotoxique, effectuer une imagerie pondérée par diffusion / un coefficient de diffusion apparentFficient (ADC) en sélectionnant une séquence de diffusion EPI spin-echo.
- Utiliser les paramètres suivants: temps de répétition = 3.400 ms, temps d'écho = 20 ms, épaisseur de la tranche = 0,7 mm, nombre de tranches = 17, nombre de directions sensibles à la diffusion = 30, valeur b = 1.500 s / mm 2 , δ = 3 ms , Δ = 9 ms, facteur d'accélération de codage Fourier partiel = 1,51, champ de vision = 12 x 15 mm 2 , matrice = 96 x 128, résolution dans le plan = 0,125 mm x 0,117 mm, angle de basculement = 90-180 degrés, et Nombre de tranches de saturation (sagittal) = 1. Démarrez la séquence et attendez 7 min 56 s jusqu'à ce que les images brutes soient acquises.
- Pour évaluer les micro-hémorragies, utilisez une imagerie pondérée 3D T2 *. Sélectionnez une séquence FLASH à compensation de débit.
- Entrez les paramètres suivants dans le logiciel MRI: temps de répétition = 2.000 ms, temps d'écho = 22 ms, résolution isotrope 0.08 mm, champ de vision = 32 x 15 x 8 mm 3 , taille de la matrice = 400 x 188 x 100 et fAngle des lèvres = 12 degrés. Commencez la séquence et attendez 15 min 40 s pour acquérir les images brutes.
- Pour évaluer la perméabilité artérielle, utilisez l'angiographie en temps de vol en sélectionnant une séquence 3D FLASH.
- Utilisez les paramètres suivants dans le logiciel MRI: temps de répétition = 16 ms, temps d'écho = 3,5 ms, épaisseur de coupe = 0,07 mm, résolution dans le plan = 0,104 x 0,104 mm, champ de vision = 20 x 20 x 10 mm 3 , matrice = 192 x 192 x 142, et angle de basculement = 15 degrés. Commencez la séquence et attendez 7 min 16 s jusqu'à ce que les images soient acquises.
- Pour évaluer la perturbation de la barrière hémato-encéphalique, utilisez une image pondérée 3D T1 avant et après une injection d'agent de contraste de 0,3 mmol / kg. Sélectionnez une séquence FLASH à radio fréquence avec une excitation de radiofréquence globale.
- Utiliser les paramètres de séquence suivants dans le logiciel MRI: temps de répétition = 5 ms, temps d'écho = 1,9 ms, résolution isotrope = 0,156 mm, champ de vision 20 x 18,7X 18,7 mm 3 , matrice 128 x 120 x 120 et angle de basculement = 8,5 ° ;. Commencez la séquence et attendez 1 min 14s jusqu'à ce que les images soient acquises.
4. Traitement et analyse d'images
- Pour analyser la perturbation de la barrière hémato-encéphalique, soustraire des images 3D non améliorées pondérées par T1 à partir d'images pondérées T1 améliorées avec l'outil arithmétique ou l'outil de calcul d'image dans ImageJ. Évaluez les images de soustraction pour augmenter le signal, ce qui correspond à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. 9
- Pour analyser le volume du cerveau, utilisez des ensembles de données pondérés en 3D typiques T1 ou 3D. Détaillez le cerveau de l'ampoule olfactive au cervelet en utilisant l'éditeur de segmentation. dix
- Œdème vasogénique
- Traiter les données de relaxometry T2 avec un logiciel d'IRM ou utiliser une procédure d'ajustement non-linéaire non-linéaire. 11 Données pondérées par diffusion de processus pour obtenir des cartes ADC à l'aide de MRI sofTware ou FDT toolbox (voir la table des matériaux ).
- Placez les régions d'intérêt manuellement dans les différentes régions anatomiques.
REMARQUE: le placement automatique des régions d'intérêt peut s'inscrire incorrectement en raison d'un gonflement important du cerveau. Les valeurs T2 et ADC des régions anatomiques choisies sont obtenues de cette manière.
- Pour analyser le volume de la microhémorragie, délimiter les micro-hémorragies, qui apparaissent comme des foyers ovoïdes et noirs sur des bases de données pondérées T2 *, en utilisant l'éditeur de segmentation.
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Representative Results
Chez les souris C57BL / 6, les premiers symptômes cliniques de l'ECM peuvent être observés entre les jours 6 et 10 après une infection par les sporozoïtes ANKA de P. berghei . ECM se développe dans 60 à 80% de la souris infectée et progresse rapidement au coma et à la mort dans les 24 à 48 h. En revanche, les souris qui ne développent pas l'ECM meurent après la deuxième semaine après l'infection par une anémie grave due à une hyperparasitemie. 12
Dans l'imagerie par IRM, les premiers signes d'ECM sont visibles dans l'ampoule olfactive, qui appartient au système olfactif de la souris et se trouve dans la partie rostrale du cerveau. 7 , 13 Une augmentation de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique (observée sur les images pondérées T1 contrastées) et une augmentation de fluide (augmentation du signal T2 sur les images pondérées en T2, la relaxometrie T2 et l'imagerie pondérée par diffusion) indiquent un œdème vasogénique précoceDans l'ampoule olfactive qui est déjà présente dans une maladie légère (score RMCBS 20-16) et commence à se propager alors que la gravité de la maladie augmente. Les images de signaux T1 relatives aident à détecter une perturbation subtile de la barrière hémato-encéphalique ( figure 1 ). La rupture de la barrière hémato-encéphalique et l'œdème vasogénique progressent d'une manière spécifique. Ces changements pathologiques se sont répandus le long du flux migratoire rostral, une voie migratoire pour les neuroblastes, vers le tronc cérébral, atteinte dans une maladie très sévère (RMCBS endoloris de 9 à 0). Sur les cartes T2, la gravité de l'œdème vasogénique peut être quantifiée en dessinant des régions d'intérêt dans des régions anatomiques spécifiques, comme le montre la figure 2 . Pour chaque région, un temps de relaxation T2 qui augmente avec l'augmentation de l'œdème peut être obtenu. En plus de l'œdème vasogénique et de la rupture de la barrière hémato-encéphalique, l'enflure du cerveau commence lorsque la gravité de l'ECM augmente. Le volume de cerveau indicatif de l'œdème commence à augmenter de manière significative chez les souris modérément malades comme comPar rapport à la ligne de base et d'autres augmentations chez les souris gravement malades ( figure 3 ).
La pathologie microvasculaire, comme en témoignent les micro-hémorragies et une augmentation du contraste de susceptibilité des vaisseaux (correspondant au débit lent), se produit après les premiers signes de perturbation de la barrière hémato-encéphalique et de l'œdème vasogénique et peut être visualisée avec une imagerie pondérée T2 *. Les micro-hémorragies se produisent principalement dans l'ampoule olfactive ( figure 4 ). Le nombre de micro-hémorragies augmente avec une maladie progressive. Chez les maladies progressives, les micro-léphalémies sont également évidentes dans le cortex, les ganglions de base, le cervelet, la matière blanche et le tronc cérébral.
La diminution de la perméabilité artérielle est observée par l'angiographie chronométrée comme signe d'altération macrovasculaire parallèlement aux changements microvasculaires. L'infarctus cérébral n'est pas une conclusion clé dans l'ECM. Dans une maladie très sévère, cependant, les domainesLa diminution de l'ADC peut être identifiée, ce qui indique des infarctus cérébraux.
Figure 1: Interruption de la barrière du cerveau. ( A ) Une image représentative représentative de T1 en 3D. Une augmentation du signal T1 est visible dans la région centrale de l'ampoule olfactive. ( B ) Sur l'image de signal relative T1 correspondante (image de pré-contraste T1 soustraite de l'image de post-contraste T1), l'extravasation d'agent de contraste est plus facile à délimiter. L'extravasation d'un agent de contraste est visible dans les régions corticales frontales (flèches blanches). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: T2 RelaxOmetrie. Les échantillons de cartes T2 à différentes hauteurs d'une souris gravement malade avec un score RMCBS de 5 ( A ) et du balayage de base ( B ) sont affichés dans une échelle de couleur, en échelle de gris et en échelle de gris avec des ROI en tant que superpositions colorées. Bleu foncé = RMS, vert = cortex, turquoise = capsule externe, jaune = ganglions de base, bleu clair = DMS, orange = thalamus et rouge = tronc cérébral Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Mesures du volume du cerveau. Le volume de cerveau augmente significativement chez les souris mal nourries (RMCBS 15-10). Des valeurs représentatives de 10 souris sont représentées. Les données sont présentées comme l'écart-type moyen. Un test t de Student a été utilisé pour analyser les différences de soutien-gorgeEn gonflement entre les groupes. Chez les souris modérément / gravement malades, le volume du cerveau a été significativement augmenté par rapport à la ligne de base (p = 0,021 / 0,001). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Microhémorragies. Les images pondérées T2 de la souris avant le début de l'infection au stade sanguin ( A ) et le jour 8 après une infection avec un score RMCBS de 14 ( B et C ) sont montrées. Dans la première image, aucune micro-hémorragie n'est évidente ( A ), tandis que dans les deuxième et troisième images, plusieurs microhémorragies sont visibles, avec une prédominance dans l'ampoule olfactive (B: image coronal plane, C: projection 3D avec micro-hémorragies segmentées).
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Discussion
Dans cet article, nous décrivons un protocole d'IRM à cerveau entier pour délimiter les changements dans le paludisme cérébral expérimental. Nous croyons que l'IRM a été sous-utilisée dans la recherche sur le paludisme à ce jour et espérons que nos protocoles aideront les autres enquêteurs. Nous aimerions décrire quelques points supplémentaires qui peuvent être utiles.
Si les souris gravement malades sont imagées, le positionnement est crucial. En raison de la pression intracrânienne accrue, les souris sont sensibles à la mort, et donc, la colonne cervicale ne doit pas être étirée. L'anesthésie devrait également être réduite au minimum. Si les souris atteintes d'une maladie légère sont imagées, le meilleur point de temps pour l'IRM est de 12 à 24 heures avant l'apparition prévue des premiers symptômes cliniques. Un œdème vasogénique léger dans l'ampoule olfactive est visible chez la souris qui ne présente aucun signe clinique d'ECM (score RMCBS de 20).
La longueur du protocole IRM lui-même peut être adaptée selon la question de recherche spécifique. Le proto minimalCol devrait inclure une séquence pondérée en T2 ou une relaxometry T2 et une séquence pondérée T2 * afin de juger la présence d'un œdème vasogénique et d'une charge micro-hémorragique / déficience microvasculaire. Pour obtenir des images de bonne qualité, les artefacts de mouvement doivent être réduits au minimum. Le mouvement sera réduit grâce au positionnement correct de la souris et en maintenant le taux de respiration à environ 60 à 80 respirations par minute.
D'autres méthodes d'imagerie in vivo , telles que la microscopie intravitaliste, se révèlent prometteuses en visualisant des altérations pathologiques dans ECM au niveau cellulaire. 14 , 15 , 16 , 17 Comparé à l'IRM, la microscopie intravitale peut offrir une résolution spatiale élevée au coût de couvrir uniquement une zone corticale limitée. En revanche, l'IRM est capable de couvrir tout le cerveau à une résolution allant jusqu'à 80 μm. L'IRM peut donc guider d'autres recherches cellulaires en identifiantLes sites de prédilection - le début de la maladie - ainsi que le stade de la maladie, qui peut ensuite être évalué en utilisant d'autres méthodologies. Les résultats de l'IRM dans l'ECM peuvent être comparés aux altérations pathologiques détectées avec IRM dans le paludisme cérébral humain. Le paludisme cérébral humain et expérimental montre un œdème vasogénique dans les domaines de la neurogenèse, ainsi que la pathologie microvasculaire, comme les infarctus cérébraux secondaires dans les bassins hydrographiques. 7 , 18 La matière blanche et la matière grise sont affectées de manière similaire, et le gonflement du cerveau dans le paludisme cérébral humain et expérimental implique le tronc cérébral dans une maladie grave, expliquant l'état comateux. 2 , 7
Nous espérons que l' imagerie in vivo aidera à démêler le mécanisme pathologique sous-jacent du paludisme cérébral, qui reste actuellement insaisissable. Comme l'œdème et le gonflement du cerveau sont à peine visibles ex vivo, moiLes méthodes permettant de visualiser cette pathologie in vivo sont essentielles et contribueront à améliorer l'évaluation des nouvelles thérapies et des vaccinations.
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Acknowledgments
L'assistance technique experte de Miriam Reinig est reconnaissante. AH a reçu un financement d'une allocation postdoctorale de la faculté de médecine de l'Université de Heidelberg. Le député est soutenu par une allocation commémorative de la Fondation Else-Kröner-Fresenius. AKM est bénéficiaire d'une allocation de congé de maternité par l'Académie DZIF du Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF). JP est récipiendaire d'une bourse de recherche de perfectionnement professionnel de la médecine moléculaire Heidelberg (HRCMM). Nous remercions également Julia M. Sattler et Friedrich Frischknecht d'avoir fourni un film exemplaire de mouvement sporozoïste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001747 | for anesthesia |
| Dotarem | Guebert | 1086923 | Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL |
| Amira (Image Processing Program) | FEI Group | Version Amira 5.3.2 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., | Release 2012b | |
| FDT toolbox | FMRIB's Software Library | http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html |
References
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