Introduction
マラリアは世界的に重要な健康問題です。重度のマラリアは部分的に脳の関与を特徴とし、しばしば不良な予後因子である。 5歳未満の小児では、マラリア伝播率の高い地域で脳関与が一般的であり、その年齢層でのマラリア関連死亡の主な原因となります。積極的な治療は命を救うことができますが、脳マラリアの検出は、特に初期段階では困難です。脳マラリアに関連する病理学的プロセスには、脳血管障害および脳浮腫が含まれ、重度の脳の腫脹を招く可能性がある。この記事では、実験的脳マラリア(ECM)の全脳インビボイメージングを可能にする磁気共鳴イメージング(MRI)プロトコルを紹介します。 ECMが中央でどのように開始するかについてはほとんど知られていないが、全脳高分解能イメージング法はこの疾患では十分に活用されていないあるいは特定の機序が原因となってこの疾患に至ることがあります。脳全体をカバーするインビボ MRIは、ECM病理のより良い理解を得るための重要な研究ツールである。 MRIは、最近、ECMだけでなくヒト大脳マラリアにおいても死の重要な予測因子であると最近認識されている世界的な脳の脳の腫脹を評価することができる。重度の脳の腫脹は、致命的な疾患で起こり、ECMモデルとヒトの疾患(炎症性および微小血管の両方の変化が特徴である疾患)との間のいくつかの病理学的特徴の1つを表す。 4
ECMは、致死的Plasmodium berghei ANKA感染によるCBAまたはC57BLマウスで誘導することができる。 ECMの発症は、感染後6日目から10日目までに典型的に起こり、フィッティング、運動失調、呼吸困難、昏睡をもたらし、これがラップにつながるイドの死。ラピッドネズミ昏睡および行動尺度(RMCBS)は、ECMの臨床症状を評価するのに役立つスコアです。これは、0から2のスコアを付けられた10のパラメータで構成され、最大20の可能なスコアを有する。6最近、我々はECMマウスにおけるRMCBSスコアの重症度とMRIによって示される病理学的変化との間に良好な一致を示した。 7このプロトコールでは、マウスにおけるECM誘導およびECMによるマウスのインビボ磁気共鳴イメージングについて記載する。
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Protocol
この記事で報告されたすべての動物実験は、実験動物科学連盟(FELASA)カテゴリBおよび実験動物科学協会(GV-SOLAS)標準ガイドラインに従って実施され、カールスルーエの地方ドイツ当局(RegierungspräsidiumKarlsruhe) 、ドイツ)。 biosavetyレベル2は、蚊とPlasmodium berghei ANKAスポロゾイトの仕事に適用されます。
1.感染
- Anophelesは、配偶子母細胞で15分間飼育することにより、 Plasmodium berghei ANKAを用いて蚊を繁殖させる。感染した蚊を湿度80%、21℃に保つ。
- 血液摂取の17〜22日後にケージから女性の蚊を収集する。それらを氷上に置き、麻酔する。
- 鉗子を使用して、一滴の冷RPMI培地で覆われたガラススライド上に3-4匹の蚊を置く。スライドを顕微鏡の下に置きます。 <鉗子を使用して、慎重に頭と体の間に蚊を伸ばします。シリンジと針を用いて唾液腺を分離する。残りの蚊でこの手順を繰り返します。
- ガラススライドから唾液腺を採取し、それらをガラスピペットで吸い取り、1.5mLの遠心チューブに集める。
注:感染率に応じて、唾液腺あたり通常8,000〜15,000の感染性スポロゾイトを得ることができます。 - 約3分間、唾液腺組織からスポロゾイトを単離するために、小さなプラスチックスティックで遠心チューブ内の分離した唾液腺を粉砕します。
- 残りの組織からスポロゾイトを精製するために、1,000×gおよび4℃で3分間遠心分離する。
- スポロゾイト(SPZ)を含む上清を新しい遠心管にピペットで移し、精製したスポロゾイトをNeubauer血球計で数えます。
- phを加えて精製スポロゾイトの濃度を10,000 / mLに調整するオスフェート緩衝生理食塩水。
- 近交系のC57BL / 6マウスの尾静脈に合計1,000個のスポロゾイト(0.1 mL)を注入して感染を開始させます。注射を容易にするために、C57BL / 6マウスを拘束具に置き、尾を静脈(約37℃)の水に入れて尾静脈の視覚化を助ける。
注記:注入自体は、数秒以内に実行できる短い手順です。 - 1日1回、SPZ感染後3日目以降の血液塗抹標本において、血液段階の寄生虫血症をチェックする。
注:Parasitemiaのモニタリングは、Mueller らの JoVEの記事で以前に可視化されています。 8 - スポロゾイト注射後5日目から急速マウス昏睡および行動尺度(RMCBS)スコアでマウスを1日1回評価する。
注:ビデオデモンストレーションを含むこの手順の詳細な説明は、Caroll et al。 6 - 評価RMCBSスコアおよび対処すべき研究課題に従って、MRI画像を有するマウス。 6
2.磁気共鳴イメージングセットアップ
- 高周波伝送用のボリューム共振器と4チャネルフェーズドアレイの表面受信コイルを使用して、9.4T小型動物スキャナーでMRIを実行します。マウスの体温を維持するために、温度制御された水浴を42℃にする。
- 2%イソフルランおよび圧縮空気を用いて、マウスがつま先にもはや反応しなくなるまで、チャンバー内の麻酔を誘導する。麻酔を1-1.5%に維持する。
- マウスの尾静脈に尾静脈カテーテルを置く。頭の動きを最小限に抑えるために、ヘッドロックと歯のバーが装備された動物のベッドに傷つきやすいように置き、MRIのためにマウスを配置します。マウスの頸椎をまっすぐにしないように注意してください。
- 造影剤注入システムを尾静脈カテーテルに接続する。 Gd-DTPA(0.3 mmol / kg)シリンジを充填したカスタムメードの注入システムを使用するか、Gd-DTPA(0.3 mmol / kg)シリンジに接続したPEチューブを使用してください。
- デクスパンテノール眼軟膏を両眼に塗布する。 4チャンネルフェーズドアレイサーフェスレシーバヘッドコイルをマウスの頭に置きます。マウスの後ろに呼吸パッドを置き、呼吸監視装置に接続します。
3.イメージングプロトコル
注:対処すべき研究課題に従って、以下に列挙したプロトコールからイメージング配列を選択する。記載されているすべてのパラメータはMRIソフトウェアで有効ですが、他のソフトウェアプログラムが使用されている場合は調整する必要があります。
- マウスの脳がマグネットのアイソセンタにあることを確認するために、ローカライズスキャンを開始します。
- 血管原性浮腫を定性的に評価するには、マルチスライスレアシーケンスを選択して3D T2強調画像を使用します。
- 次のPAを入力してください繰返し時間= 2.000ms、エコー時間= 22ms、等方性分解能= 0.1mm、視野= 20×10×12mm 3 。マトリックス= 200×100×120、フリップ角= 90~180°、 (スピンエコー)、および希少因子= 8.シーケンスを開始し、10分48秒待って生の画像を取得する。
- 血管形成性浮腫を定量的に評価するために、マルチスライス、多重スピンエコーシーケンスを選択することによってT2緩和測定を実施する。
- 繰返し時間= 3.100ms、エコー時間= 8-136ms、8msの増分、スライス数= 17、スライス厚さ= 0.7mm、面解像度= 0.116mm×0.116mm、視野20 x20mm2、マトリックス= 172x172、フリップ角= 90-180°、 (スピンエコー)。シーケンスを開始し、8分53秒待って生の画像を取得する。
- 血管原性浮腫および細胞傷害性浮腫の両方を定量的に評価するために、拡散強調画像/見掛け拡散係数スピンエコーEPI拡散シーケンスを選択することによって、効率的(ADC)マッピングを可能にする。
- 反復時間= 3.400ms、エコー時間= 20ms、スライス厚= 0.7mm、スライス数= 17、拡散増感方向の数= 30、b値= 1.500s / mm 2 、δ= 3msのパラメータを使用する。 、Δ= 9ms、部分フーリエ符号化加速係数= 1.51、視野= 12×15mm 2 、マトリックス= 96×128、面内分解能= 0.125mm×0.117mm、フリップ角= 90-180度、および彩度スライス(矢状)の数= 1。シーケンスを開始し、生画像が取得されるまで7分56秒待つ。
- 微小出血を評価するには、3D T2 *加重イメージングを使用する。フロー補正FLASHシーケンスを選択します。
- 繰り返し時間= 2.000 ms、エコー時間= 22 ms、等方性解像度0.08 mm、視野= 32 x 15 x 8 mm 3 、マトリックスサイズ= 400 x 188 x 100、およびfリップアングル= 12度。シーケンスを開始し、生の画像を取得するために15分40秒待つ。
- 動脈の開存性を評価するには、3D FLASHシーケンスを選択して、飛行時間血管造影を使用します。
- 繰返し時間= 16ms、エコー時間= 3.5ms、スライス厚さ= 0.07mm、面内分解能= 0.104×0.104mm、視野= 20×20×10mm 3 、MRIソフトウェアの以下のパラメータを使用する。 = 192×192×142、フリップ角= 15度である。シーケンスを開始し、画像が取得されるまで7分16秒待ちます。
- 血液脳関門の崩壊を評価するには、0.3 mmol / kgの造影剤注入の前後に3D T1強調画像を使用する。グローバルラジオ周波数の励起を使用して、ラジオ周波数で損なわれたFLASHシーケンスを選択します。
- MRIソフトウェアでは、繰り返し時間= 5ms、エコー時間= 1.9ms、等方性分解能= 0.156mm、視野20×18.7×18.7mm 3 、マトリックス128×120×120、フリップ角= 8.5°。シーケンスを開始し、画像が取得されるまで1分14秒待ちます。
4.画像処理と解析
- 血液脳関門の障害を解析するには、ImageJの算術ツールまたは画像計算ツールを使用して、強化されたT1強調画像から3D非拡張T1強調画像を差し引きます。減数画像を評価し、血液脳関門の障害に対応する信号の増加を確認する。 9
- 脳の容積を分析するには、ネイティブ3D T1または3D T2加重データセットを使用します。セグメンテーションエディタを使用して、脳を嗅球から小脳まで描写する。 10
- 血管形成性浮腫
- MRIソフトウェアでT2緩和測定データを処理するか、非線形最小二乗適合手順を使用します。 11 MRI sofを用いたADCマップを得るための拡散強調データの処理twareまたはFDTツールボックス( 材料表を参照)。
- 関心領域を異なる解剖学的領域に手動で配置します。
注記:重要な脳の腫脹により、関心領域の自動配置が正しく登録されないことがあります。選択された解剖学的領域のT2時間およびADC値がこのようにして得られる。
- 微小出血量を分析するには、セグメンテーションエディタを使用して、T2 *加重データセット上に卵形の暗い焦点として現れる微小出血を描写する。
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Representative Results
C57BL / 6マウスでは、 P. berghei ANKAスポロゾイトによる感染後6日目〜10日目の間にECMの最初の臨床症状が観察される。 ECMは感染マウスの60〜80%で発症し、24〜48時間以内に急速に昏睡と死に進行する。対照的に、ECMを発症しないマウスは、過気管支喘息により重度の貧血から感染後第2週後に死亡する。 12
MRIイメージングでは、ECMの最も早い兆候が、マウスの嗅覚系に属し、脳の吻側部分に位置する嗅球に見える。 (コントラスト強調されたT1加重画像で見られる)血液量増加とT2強調画像でのT2シグナルの増加、T2リラクソメトリーおよび拡散強調画像での増加は、早期の血管形成性浮腫を示している穏やかな病気(RMCBSスコア20-16)に既に存在し、病気の重症度が増すにつれて広がり始める嗅球において、相対的なT1シグナル画像は、微妙な血液脳関門の破壊を検出するのに役立ちます( 図1 )。血液脳関門の破壊および血管原性浮腫が特定の様式で進行する。これらの病理学的変化は、非常に重篤な疾患(RMCBS痛み9-0)に到達する脳幹への神経芽細胞の移動経路である吻側の移動流に沿って広がっている。 T2マップでは、 図2に示すように 、関心領域を特定の解剖学的領域に描くことによって、血管原性浮腫の重症度を定量化することができる。各領域について、浮腫の増加に伴って増加するT2緩和時間を得ることができる。血管原性浮腫および血液脳関門の破壊と共に、ECMの重症度が増加すると脳の腫脹が始まる。中程度の病気のマウスでは浮腫を示す脳体積が著しく増加し始めるベースラインに耐え、重症のマウスではさらに増加する( 図3 )。
微小血管出血および血管感受性のコントラストの増加(遅い流れに対応する)のような微小血管病変は、血液脳関門破壊および血管原性浮腫の最初の徴候の後に起こり、T2 *加重イメージングで視覚化することができる。微小出血は、主に嗅球で起こる( 図4 )。微小出血の数は、進行性疾患に伴って増加する。進行性疾患では、微小出血は皮質、基底核、小脳、白質および脳幹においても明らかである。
動脈の開存性の減少は、微小血管変化と並行して大血管障害の徴候として飛行時間型血管造影によって見られる。脳梗塞はECMの重要な発見ではありません。しかしながら、非常に重篤な疾患では、ADCの減少が同定され、脳梗塞を示す。
図1:血液脳関門障害。 ( A )代表的な冠状3D T1強調画像。嗅球の中央領域でT1シグナルの増加が見える。 ( B )対応するT1相対信号画像(T1プレコントラスト画像からT1後コントラスト画像を引いたもの)において、造影剤の血管外遊出は描出し易い。造影剤の血管外遊出は、前頭皮質領域で見える(白い矢印)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:T2リラックスometry。 RMCBSスコア5( A )およびベースラインスキャン( B )を有する重篤な病気のマウスからの異なる高さのサンプルT2マップを、カラースケール、グレースケール、およびROIをカラーオーバーレイとしてグレースケールで表示する。ダークブルー= RMS、緑=皮質、ターコイズ=外皮、黄色=基底核、淡青= DMS、オレンジ=視床、赤=脳幹この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図3:脳の体積の測定。中程度に病気のマウス(RMCBS 15-10)では脳体積が有意に増加する。 10匹のマウスの代表値を示す。データは、平均標準偏差として提示される。ペアのスチューデントt検定を用いて、ブラの差異を分析したグループ間の腫れで中等度/重度の病気のマウスでは、脳容積はベースラインと比較して有意に増加した(p = 0.021 / 0.001)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:微小出血。血液段階感染( A )の発症前およびRMCBSスコア14( BおよびC )の感染後8日目のマウスの代表的なT2 *加重画像を示す。第2画像と第3画像では、嗅球(B:平面コロナル像、C:セグメント化微小出血による3D投影像)が優勢で、いくつかの微小出血が目に見える。
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Discussion
この記事では、実験的脳マラリアの変化を描写する全脳MRIプロトコルについて説明します。我々は、今日までマラリア研究においてMRIが十分に活用されておらず、我々のプロトコールが他の研究者を助けることを期待している。私たちは役に立つかもしれないいくつかの追加ポイントについて説明したいと思います。
重度の病気のマウスが画像化される場合、位置決めが重要である。頭蓋内圧の上昇により、マウスは死亡しやすいため、頚椎を伸ばしてはならない。麻酔も最低限に保つ必要があります。軽度の疾患を有するマウスを画像化する場合、MRIにとって最良の時点は、最初の臨床症状の予期される発症の12〜24時間前である。 ECM(RMCBSスコア20)の臨床徴候を示さないマウスにおいて、嗅球における軽度の血管原性浮腫が見られる。
MRIプロトコル自体の長さは、具体的な研究の質問に従って適応させることができます。最小原則血管形成浮腫および微小出血負荷/微小血管障害の存在を判断するために、T2加重配列またはT2リラクソメトリーおよびT2 *加重配列を含むべきである。良質の画像を得るためには、モーションアーチファクトを最小限に抑える必要があります。動きは、マウスの適切な配置と、毎分約60-80回の呼吸で呼吸速度を維持することによって低減される。
生体内顕微鏡法などの他の生体内イメージング法は、細胞レベルでECMの病理学的変化を視覚化することを約束する。 MRIと比較して、生体内顕微鏡法は限られた皮質領域のみをカバーするという代償で高い空間分解能を提供することができる。対照的に、MRIは脳全体を80μmまでの分解能でカバーすることができます。したがって、MRIは、疾病の発症部位、疾病の発症部位、病気の発症ステージを評価し、さらなる方法論を用いて評価することができる。 ECMにおけるMRI所見は、ヒト脳マラリアにおけるMRIで検出された病理学的変化と比較することができる。ヒトおよび実験的脳性マラリアの両方が、神経新生の領域ならびに流域領域の二次大脳梗塞などの微小血管病変において血管形成性浮腫を示す。白質および灰白質は同様の様式で影響を受け、ヒトおよび実験用脳マラリアの脳の腫脹は、昏睡状態を説明する重篤な疾患の脳幹を伴う。 2,7
私たちは、インビボでのイメージングが、現在はまだ分かりにくい脳マラリアの根底にある病理学的メカニズムを解明するのに役立つことを願っています。浮腫や脳の腫脹がエクスビボでほとんど見えないので、私インビボでこの病状を視覚化するための方法が重要であり、新規療法およびワクチン接種の評価を改善するのに役立つであろう。
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Acknowledgments
Miriam Reinigの専門家の技術支援は感謝しています。 AHは、ハイデルベルク大学医学部のポスドク奨学金から資金を受けた。 MPはElse-Kröner-Fresenius財団の記念奨励金によって支えられています。 AKMは、DZIFアカデミー(DZIF)の母子保健給付の受給者です。 JPは、ハイデルベルク分子医学研究センター(HRCMM)のキャリア開発フェローシップの受領者です。さらに我々は、スポロゾイト運動の模範的な映画を提供してくれたJulia M. SattlerとFriedrich Frischknechtに感謝する。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane | Baxter | 1001747 | for anesthesia |
Dotarem | Guebert | 1086923 | Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL |
Amira (Image Processing Program) | FEI Group | Version Amira 5.3.2 | |
MATLAB | The MathWorks, Inc., | Release 2012b | |
FDT toolbox | FMRIB's Software Library | http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html |
References
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