Introduction
A malária é um problema de saúde global significativo. 1 A malária grave caracteriza-se, em parte, por envolvimento cerebral e muitas vezes é um fraco fator prognóstico. O envolvimento cerebral é comum em crianças menores de cinco anos nas áreas de alta transmissão da malária e representa a principal causa de morte relacionada à malária naquela faixa etária. 1 Embora o tratamento agressivo possa salvar a vida, a detecção da malária cerebral, especialmente nos estágios iniciais, pode ser difícil. Os processos patológicos envolvidos na malária cerebral incluem interrupção microvascular e edema cerebral, o que pode levar ao inchaço cerebral intenso. Neste artigo, apresentamos um protocolo de imagem por ressonância magnética (MRI) que permite a imagem in vivo de cérebro inteiro da malária cerebral experimental (ECM). Os métodos de imagem de alta resolução de cérebro inteiro foram amplamente subutilizados nesta doença, embora pouco se saiba sobre como o ECM inicia no centroSistema nervoso ou quais mecanismos específicos levam à doença. A ressonância magnética in vivo , que cobre todo o cérebro, representa uma ferramenta de pesquisa importante para obter uma melhor compreensão da patologia ECM. A ressonância magnética é capaz de avaliar o inchaço do cérebro cerebral global, que recentemente foi reconhecido como um importante preditor de morte, não apenas no ECM, mas também na malária cerebral humana. 2 , 3 O inchaço cerebral grave ocorre em doenças fatais e representa uma das várias características patológicas entre os modelos ECM e a doença humana, uma doença caracterizada por alterações inflamatórias e microvasculares. 4
O ECM pode ser induzido em camundongos CBA ou C57BL através de infecção com ANKA de Plasmodium berghei letal . 5 O início do ECM ocorre tipicamente entre os dias 6 e 10 após a infecção e resulta em encaixe, ataxia, dificuldade respiratória e coma, o que leva ao rapId death. 4 A Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) é uma pontuação útil para avaliar os sintomas clínicos da ECM. Consiste em 10 parâmetros, cada um marcou de 0 a 2, com um máximo de 20. 6 Recentemente, apresentamos boa concordância entre a gravidade dos escores do RMCBS em camundongos ECM e as alterações patológicas demonstradas pela RM. 7 Neste protocolo, descrevemos a indução de ECM em camundongos e a ressonância magnética in vivo de camundongos com ECM.
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Protocol
Todos os experimentos com animais relatados neste artigo foram conduzidos de acordo com as diretrizes padrão da Federação para Associações de Ciência Animal de Laboratório (FELASA) e as diretrizes padrão da Sociedade de Ciência Animal de Laboratório (GV-SOLAS) e foram aprovadas pelas autoridades alemãs locais em Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe , Alemanha). Por favor, note que o nível de biossegurança 2 aplica-se ao trabalho de esporozoítas de mosquito e Plasmodium berghei ANKA.
1. Infecção
- Infecte Anopheles stephensi mosquitos com Plasmodium berghei ANKA alimentando -os por 15 minutos em um mouse gametocitêmico. Mantenha os mosquitos infectados com 80% de umidade e 21 ° C.
- Coletar mosquitos fêmeas de sua gaiola 17 a 22 dias após a refeição de sangue. Coloque-os no gelo para anestesiar-los.
- Usando fórceps, coloque três a quatro mosquitos em um slide de vidro coberto com uma gota de meio RPMI frio. Coloque o slide ao microscópio. <Li> Usando fórceps, estique cuidadosamente o mosquito entre a cabeça e o corpo. Isolar a glândula salivar usando uma seringa e uma agulha. Repita este procedimento com os demais mosquitos.
- Recolher as glândulas salivares da lâmina de vidro, sugando-as com uma pipeta de vidro e recolhê-las em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
NOTA: Dependendo das taxas de infecção, geralmente podem ser obtidas 8 000 a 15 000 esporozoítos infecciosos por glândula salivar. - Por aproximadamente 3 min, esmague as glândulas salivares isoladas dentro do tubo de centrífuga com uma vara pequena e plástica para isolar os esporozoítos do tecido da glândula salivar.
- Centrifugar durante 3 minutos a 1000 xg e 4 ° C para purificar os esporozoítos do tecido restante.
- Pipetar o sobrenadante, que contém os esporozoítos (SPZ), até um novo tubo de centrífuga e contar os esporozoítos purificados em um hemocitômetro Neubauer.
- Ajustar a concentração de esporozoítos purificados para 10 000 / mL adicionando phSolução salina tamponada com osphate.
- Injetar um total de 1.000 esporozoítos (0,1 mL) nas veias da cauda de ratos C57BL / 6 endogâmicos para iniciar a infecção. Para facilitar as injeções, coloque os ratos C57BL / 6 em um dispositivo de retenção e coloque as caudas em água quente (aproximadamente 37 ° C) para auxiliar na visualização das veias da cauda;
NOTA: A própria injeção é um procedimento curto que pode ser executado dentro de alguns segundos. - Uma vez por dia, verifique a parasitemia no estágio sanguíneo em esfregaços sanguíneos a partir do dia 3 após a infecção por SPZ.
NOTA: O monitoramento da parasitemia foi previamente visualizado em um artigo JoVE de Mueller et al. 8 - Avalie os ratos uma vez por dia com a pontuação Rapid Murine Coma e Behavior Scale (RMCBS), a partir do dia 5 após a injeção de esporozoítos.
NOTA: Uma descrição detalhada deste procedimento, incluindo uma demonstração de vídeo, foi publicada por Caroll et al. 6 - AvaliarOs camundongos com imagens de MRI de acordo com o escore do RMCBS e a questão de pesquisa a ser abordada. 6
2. Configuração de Imagem de Ressonância Magnética
- Execute a ressonância magnética em um scanner animal pequeno de 9,4T usando um ressonador de volume para transmissão de radiofrequência e uma bobina receptora de superfície de 4 canais com instalação em fase. Ligue o banho de água com temperatura controlada para 42 ° C para manter a temperatura corporal do mouse.
- Induzir anestesia em uma câmara usando 2% de isoflurano e ar comprimido até o mouse não reage mais a uma pitada de dedo do pé. Manter a anestesia em 1-1,5%.
- Coloque um cateter de veia da cauda na veia da cauda do mouse. Posicione o mouse para ressonância magnética, colocando-o propenso e com uma parte traseira crunched em uma cama de animal equipada com um headlock e barra de dentes para minimizar o movimento da cabeça. Tenha cuidado para não endireitar a coluna cervical do mouse.
- Conecte um sistema de injeção do agente de contraste ao cateter da veia da cauda. Use um sistema de injeção feito sob medida preenchido com uma seringa Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) ou use um tubo PE conectado a uma seringa Gd-DTPA (0,3 mmol / kg).
- Aplique pomada com o dexpantenol em ambos os olhos. Coloque a bobina do cabeçote do receptor de superfície com 4 canais em fase na cabeça do mouse. Coloque uma almofada de respiração na parte de trás do mouse e conecte-a a um dispositivo de monitoração de respiração.
3. Protocolo de imagem
NOTA: Escolha as seqüências de imagens a partir do protocolo listado abaixo de acordo com as questões de pesquisa a serem abordadas. Todos os parâmetros listados são válidos para o software MRI, mas podem ser ajustados se outros programas de software forem usados.
- Comece executando uma varredura de localização para garantir que o cérebro do mouse esteja no isocentro do ímã.
- Para avaliar qualitativamente o edema vasogênico, use imagem em 3D ponderada em T2, selecionando uma seqüência RAR multi-fatia.
- Digite o seguinte paAjustes para o software MRI: tempo de repetição = 2.000 ms, tempo de eco = 22 ms, resolução isotrópica = 0.1mm, campo de visão = 20 x 10 x 12 mm 3 ; Matriz = 200 x 100 x 120, ângulo de flip = 90-180 °; (Spin-echo) e fator raro = 8. Inicie a sequência e aguarde 10 min 48 s para adquirir as imagens em bruto.
- Para avaliar quantitativamente o edema vasogênico, realize a relaxometria T2 selecionando uma seqüência de eco multi-fatia múltipla.
- Use os seguintes parâmetros: tempo de repetição = 3.100 ms, tempo de eco = 8-136 ms em incrementos de 8 ms, número de fatias = 17, espessura da fatia = 0,7 mm, resolução do plano = 0.116 mm x 0.116 mm, campo de visão 20 X 20 mm 2 , matriz = 172 x 172, ângulo de flip = 90-180 graus; (Spin-echo). Inicie a sequência e aguarde 8 min 53 s para adquirir as imagens em bruto.
- Para avaliar quantitativamente o edema vasogênico e o edema citotóxico, realizar imagens ponderadas por difusão / coeficiente de difusão aparenteFficient (ADC), selecionando uma sequência de difusão de spin-echo EPI.
- Use os seguintes parâmetros: tempo de repetição = 3.400 ms, tempo de eco = 20 ms, espessura da fatia = 0,7 mm, número de fatias = 17, número de direções sensibilizadas por difusão = 30, valor b = 1.500 s / mm 2 , δ = 3 ms Δ = 9 ms, fator de aceleração de codificação de Fourier parcial = 1,51, campo de visão = 12 x 15 mm 2 , matriz = 96 x 128, resolução no plano = 0,125 mm x 0,117 mm, ângulo de inclinação = 90-180 graus e Número de fatias de saturação (sagital) = 1. Inicie a sequência e aguarde 7 min 56 s até as imagens em bruto forem adquiridas.
- Para avaliar microhemorragias, use imagens 3D ponderadas com pontuação. Selecione uma seqüência FLASH com compensação de fluxo.
- Digite os seguintes parâmetros no software MRI: tempo de repetição = 2.000 ms, tempo de eco = 22 ms, resolução isotrópica 0,08 mm, campo de visão = 32 x 15 x 8 mm 3 , tamanho da matriz = 400 x 188 x 100 e fÂngulo do lábio = 12 graus. Comece a sequência e aguarde 15 min 40 s para adquirir as imagens em bruto.
- Para avaliar a permeabilidade arterial, use a angiografia do tempo de vôo, selecionando uma seqüência FLASH 3D.
- Use os seguintes parâmetros no software MRI: tempo de repetição = 16 ms, tempo de eco = 3,5 ms, espessura da fatia = 0,07 mm, resolução no plano = 0,104 x 0,104 mm, campo de visão = 20 x 20 x 10 mm 3 , matriz = 192 x 192 x 142, e ângulo de inclinação = 15 graus. Comece a seqüência e aguarde 7 min 16 s até as imagens serem adquiridas.
- Para avaliar a ruptura da barreira hematoencefálica, use imagens 3D ponderadas T1 antes e após uma injeção de agente de contraste de 0,3 mmol / kg. Selecione uma seqüência FLASH com radiofreqüência com uma excitação de freqüência de rádio global.
- Use os seguintes parâmetros de seqüência no software MRI: tempo de repetição = 5 ms, tempo de eco = 1,9 ms, resolução isotrópica = 0,156 mm, campo de visão 20 x 18,7X 18,7 mm 3 , matriz 128 x 120 x 120 e ângulo de flip = 8,5 ° ;. Comece a seqüência e aguarde 1 minuto 14 até as imagens serem adquiridas.
4. Processamento e Análise de Imagem
- Para analisar a ruptura da barreira hematoencefálica, subtrai imagens 3D ponderadas T1 não aprimoradas de imagens ponderadas T1 aprimoradas com a ferramenta aritmética ou a ferramenta de calculadora de imagem no ImageJ. Avalie as imagens de subtração para um aumento de sinal, o que corresponde à ruptura da barreira hematoencefálica. 9
- Para analisar o volume do cérebro, use conjuntos de dados nativos 3D T1 ou 3D ponderados. Delinee o cérebro da lâmpada olfativa ao cerebelo usando o editor de segmentação. 10
- Edema vasogênico
- Processe os dados de relaxometria T2 com o software MRI ou use um procedimento não linear de ajuste de mínimos quadrados. 11 Dados ponderados por difusão de processo para obter mapas ADC usando MRI sofTware ou FDT toolbox (veja Tabela de Materiais ).
- Coloque regiões de interesse manualmente nas diferentes regiões anatômicas.
NOTA: A colocação automática de regiões de interesse pode se registrar incorretamente devido ao inchaço cerebral significativo. Os valores T2 e ADC das regiões anatômicas escolhidas são obtidos desta forma.
- Para analisar o volume de microhemorragia, delinear microhemorragias, que aparecem como focos ovoides e sombrios em conjuntos de dados ponderados T2 *, usando o editor de segmentação.
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Representative Results
Em ratinhos C57BL / 6, os primeiros sintomas clínicos de ECM podem ser observados entre os dias 6 e 10 após a infecção com esporozoítos de P. berghei ANKA . ECM desenvolve em 60 a 80% dos camundongos infectados e progride rapidamente para coma e morte dentro de 24 a 48 h. Em contraste, os ratos que não desenvolvem ECM morrem após a segunda semana após a infecção por anemia grave por hiperparasitemia. 12
Na imagem de ressonância magnética, os primeiros sinais de ECM são visíveis no bulbo olfativo, que pertence ao sistema olfativo do mouse e está localizado na parte rostral do cérebro. 7 , 13 Um aumento na ruptura da barreira hematoencefálica (observado em imagens ponderadas T1 com contraste) e um aumento de fluido (aumento do sinal T2 em imagens ponderadas em T2, relaxometria T2 e imagem ponderada por difusão) indicam edema vasogênico precoceNo bulbo olfativo que já está presente em doença leve (RMCBS score 20-16) e começa a se espalhar à medida que a gravidade da doença aumenta. As imagens de sinal T1 relativas ajudam a detectar a ruptura subtil da barreira hematoencefálica ( Figura 1 ). A ruptura da barreira hematoencefálica eo edema vasogênico progridem de forma específica. Essas mudanças patológicas se espalham ao longo do fluxo migratório rostral, uma rota migratória para os neuroblastos, em direção ao tronco encefálico, que é atingido em doenças muito graves (RMCBS doloridas 9-0). Nos mapas T2, a gravidade do edema vasogênico pode ser quantificada através do desenho de regiões de interesse em regiões anatômicas específicas, conforme demonstrado na Figura 2 . Para cada região, pode-se obter um tempo de relaxamento T2 que aumenta com o aumento do edema. Juntamente com o edema vasogênico e a ruptura da barreira hematoencefálica, o inchaço do cérebro começa à medida que a gravidade do ECM aumenta. O volume do cérebro indicativo de edema começa a aumentar significativamente em camundongos moderadamente doentes como comEm comparação com a linha de base e maiores aumentos nos camundongos gravemente doentes ( Figura 3 ).
A patologia microvascular, como evidenciado por microhemorragias e um aumento do contraste de susceptibilidade do vaso (correspondente ao fluxo lento), ocorre após os primeiros sinais de ruptura da barreira hematoencefálica e edema vasogênico e pode ser visualizado com imagem ponderada com T2 *. As micro-hemorragias ocorrem predominantemente no bulbo olfativo ( Figura 4 ). O número de microhemorragias aumenta com a doença progressiva. Com doenças progressivas, as microhemorragias também são evidentes no córtex, nos gânglios basais, no cerebelo, na substância branca e no tronco encefálico.
A diminuição da permeabilidade arterial é observada pela angiografia do tempo de vôo como um sinal de comprometimento macrovascular em paralelo às mudanças microvasculares. O infarto cerebral não é uma descoberta chave na ECM. Em doenças muito graves, no entanto, áreas focais deA diminuição do ADC pode ser identificada, indicando infartos cerebrais.
Figura 1: Perturbação da barreira do sangue-cérebro. ( A ) Uma imagem coronal representativa representada em 3D T1. Um aumento no sinal T1 é visível na região central da lâmpada olfativa. ( B ) Na imagem de sinal relativa T1 correspondente (imagem de pré-contraste T1 subtraída da imagem de pós-contraste T1), o extravasamento de agente de contraste é mais fácil de delinear. O extravasamento do agente de contraste é visível nas regiões corticais frontais (setas brancas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: T2 RelaxOmetria. Os mapas de amostra T2 a diferentes alturas de um mouse gravemente doente com um escore de 5 ( A ) e da varredura de linha de base ( B ) de RMCBS são exibidos em escala de cores, em escala de cinza e em escala de cinza com ROIs como sobreposições coloridas. Azul escuro = RMS, verde = córtex, turquesa = cápsula externa, amarelo = gânglios basais, azul claro = DMS, laranja = tálamo e vermelho = tronco cerebral Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: Medições do Volume do Cérebro. O volume cerebral aumenta significativamente em camundongos moderadamente doentes (RMCBS 15-10). Valores representativos de 10 ratos são mostrados. Os dados são apresentados como o desvio padrão médio. Um teste t de Student emparelhado foi usado para analisar as diferenças em sutiãNo inchaço entre os grupos. Em camundongos moderadamente / gravemente doentes, o volume do cérebro foi significativamente aumentado em relação à linha de base (p = 0,021 / 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Microhemorragias. As imagens pontuais T2 representativas de um mouse antes do início da infecção no estágio sanguíneo ( A ) e no dia 8 após a infecção com um escore RMCBS de 14 ( B e C ) são mostradas. Na primeira imagem, nenhuma micro-hemorragia é evidente ( A ), enquanto na segunda e terceira imagens, várias microhemorragias são visíveis, com predominância na lâmpada olfativa (B: imagem coronal plana, C: projeção 3D com micro-hemorragias segmentadas).
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Discussion
Neste artigo, descrevemos um protocolo de MRI em todo o cérebro para delinear mudanças na malária cerebral experimental. Acreditamos que a ressonância magnética foi subutilizada na pesquisa de malária até o momento e espero que nossos protocolos ajudem outros pesquisadores. Gostaríamos de descrever alguns pontos adicionais que podem ser úteis.
Se os camundongos gravemente doentes forem fotografados, o posicionamento é crucial. Devido ao aumento da pressão intracraniana, os camundongos são suscetíveis à morte e, portanto, a coluna cervical não deve ser esticada. A anestesia também deve ser reduzida ao mínimo. Se os camundongos com doença leve forem fotografados, o melhor ponto de tempo para a RM é 12-24 h antes do início esperado dos primeiros sintomas clínicos. O edema vasogénico leve no bulbo olfativo é visível em camundongos que não apresentam sinais clínicos de ECM (escore RMCBS de 20).
O comprimento do protocolo de MRI em si pode ser adaptado de acordo com a questão de pesquisa específica. O proto mínimoCol deve incluir uma seqüência ponderada em T2 ou relaxometria T2 e uma seqüência ponderada T2 * para julgar a presença de edema vasogênico e carga de microhemorragia / comprometimento microvascular. Para obter imagens de boa qualidade, os artefatos de movimento devem ser reduzidos ao mínimo. O movimento será reduzido através do posicionamento adequado do mouse e mantendo a taxa de respiração em aproximadamente 60-80 respirações por minuto.
Outros métodos de imagem in vivo , como o microscópio intravital, mostram promessa na visualização de alterações patológicas no ECM a nível celular. 14 , 15 , 16 , 17 Comparado com a ressonância magnética, a microscopia intravital pode oferecer alta resolução espacial ao custo de apenas cobrir uma área cortical limitada. Em contraste, a ressonância magnética é capaz de cobrir todo o cérebro em uma resolução de até 80 μm. A ressonância magnética pode, portanto, orientar novas investigações celulares, identificandoOs locais de predileção - o início da doença -, bem como o estágio da doença, que pode então ser avaliado usando metodologias adicionais. Os achados de MRI na ECM podem ser comparados com alterações patológicas detectadas com ressonância magnética na malária cerebral humana. A malária cerebral humana e experimental mostra edema vasogênico em áreas de neurogênese, bem como patologia microvascular, como infartos cerebrais secundários em áreas de bacia hidrográfica. 7 , 18 A matéria branca e cinzenta é afetada de forma semelhante, e o inchaço do cérebro na malária cerebral humana e experimental envolve o tronco encefálico em doença grave, explicando o estado comatoso. 2 , 7
Esperamos que a imagem in vivo ajudem a desvendar o mecanismo patológico subjacente à malária cerebral, que atualmente permanece evasivo. Como o edema eo inchaço do cérebro são quase visíveis ex vivo, euOs métodos para visualizar esta patologia in vivo são fundamentais e ajudarão a melhorar a avaliação de novas terapias e vacinas.
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Acknowledgments
A assistência técnica especializada de Miriam Reinig é reconhecida com gratidão. AH recebeu financiamento de um salário pós-doutorado da Faculdade de Medicina da Universidade de Heidelberg. O MP é apoiado por um salário memorável da Fundação Else-Kröner-Fresenius. A AKM é destinatária de um salário de licença de maternidade pela Academia DZIF do Centro Alemão de Pesquisa de Infecções (DZIF). JP é o destinatário de um Centro de Pesquisa Heidelberg para Medicina Molecular (HRCMM) Career Development Fellowship. Além disso, agradecemos a Julia M. Sattler e Friedrich Frischknecht pelo fornecimento de um filme exemplar de movimento esporozoítico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001747 | for anesthesia |
| Dotarem | Guebert | 1086923 | Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL |
| Amira (Image Processing Program) | FEI Group | Version Amira 5.3.2 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., | Release 2012b | |
| FDT toolbox | FMRIB's Software Library | http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html |
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