Introduction
Малярия является серьезной проблемой глобального здравоохранения. 1 Тяжелая малярия характеризуется, в частности, вовлечением головного мозга и часто является плохим прогностическим фактором. Участие в мозге распространено у детей в возрасте до пяти лет в районах с высокой передачей малярии и является основной причиной смерти от малярии в этой возрастной группе. 1 Хотя агрессивное лечение может быть жизненно важным, выявление церебральной малярии, особенно на ранних стадиях, может быть затруднено. Патологические процессы, связанные с церебральной малярией, включают микрососудистые нарушения и отек мозга, что может привести к серьезному отеку мозга. В этой статье мы представляем протокол магнитно-резонансной томографии (МРТ), который позволяет полностью мозговой визуализации in vivo экспериментальной церебральной малярии (ECM). В этом заболевании широко использовались методы визуализации с высоким разрешением с высоким разрешением, хотя мало что известно о том, как ECM инициирует в центральнойНервной системы или какие конкретные механизмы приводят к заболеванию. МРТ in vivo , охватывающая весь мозг, представляет собой важный исследовательский инструмент для лучшего понимания патологии ECM. МРТ способна оценить глобальную головную мозговую опухоль, которая в последнее время признана важным предсказателем смерти не только в ECM, но также и при церебральной малярии. 2 , 3 Тяжелая опухоль головного мозга возникает при смертельных заболеваниях и представляет собой одну из нескольких патологических особенностей между моделями ECM и болезнями человека, заболеванием, которое характеризуется как воспалительными, так и микрососудистыми изменениями. 4
ECM может индуцироваться у мышей CBA или C57BL путем заражения летальным плазмодием berghei ANKA. 5 Начало ECM обычно происходит между 6 и 10 днями после инфицирования и приводит к фитингу, атаксии, респираторному дистрессу и коме, что приводит к рэпуId смерть. 4 Быстрая шкала комы и поведения (RMCBS) - это полезный показатель для оценки клинических симптомов ECM. Он состоит из 10 параметров, каждый из которых оценивается от 0 до 2, с максимально возможной оценкой 20. 6 Недавно мы показали хорошее согласие между степенью оценки RMCBS у мышей ECM и патологическими изменениями, продемонстрированными с помощью МРТ. 7 В этом протоколе мы описываем индукцию ECM у мышей и визуализацию in vivo магнитно-резонансной томографии мышей с ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных, описанные в этой статье, проводились в соответствии с стандартными рекомендациями Федерации лабораторных ассоциаций животных (FELASA) категории B и стандартами общеорганизационного лабораторного животноводства (GV-SOLAS) и были одобрены местными властями Германии в Карлсруэ (Regierungspräsidium Karlsruhe , Германия). Обратите внимание, что уровень биозависимости 2 относится к работе москита и Plasmodium berghei ANKA sporozoite.
1. Инфекция
- Инфекция мошек Anopheles stephensi с помощью Plasmodium berghei ANKA путем кормления их в течение 15 мин на гаметоцитемической мыши. Держите инфицированных комаров при влажности 80% и 21 ° C.
- Соберите самцов комаров из их клетки через 17-22 дня после еды. Поместите их на лед, чтобы обезболивать их.
- Используя щипцы, разместите от трех до четырех москитов на стеклянном слайде, покрытом каплей холодной среды RPMI. Поместите слайд под микроскоп. <Li> Используя щипцы, аккуратно растяните комара между головой и телом. Выделите слюнную железу с помощью шприца и иглы. Повторите эту процедуру с оставшимися комарами.
- Соберите слюнные железы со стекла, сосав их стеклянной пипеткой и соберите их в 1,5 мл центрифужной пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от уровня инфицирования, обычно от 8 000 до 15 000 инфекционных спорозоитов могут быть получены в слюнной железе. - В течение приблизительно 3 минут разбейте изолированные слюнные железы в пробирке центрифуги маленькой пластиковой палкой для выделения спорозоитов из ткани слюнной железы.
- Центрифуга в течение 3 мин при 1000 мкг и 4 ° С для очистки спорозоитов от оставшейся ткани.
- Внесите супернатант, который содержит спорозоиты (SPZ), в новую пробирку для центрифуги и подсчитайте очищенные спорозоиты в гемоцитометре Нойбауэра.
- Отрегулируйте концентрацию очищенных спорозоитов до 10 000 / мл, добавив phЗамасленный залив.
- Вводят в общей сложности 1000 спорозоитов (0,1 мл) в хвостовые вены инбредных мышей C57BL / 6 для инициирования инфекции. Чтобы облегчить инъекции, поместите мышей C57BL / 6 в ограничитель и поместите хвосты в теплую (приблизительно 37 ° C) воду, чтобы помочь визуализации хвостовых вен;
ПРИМЕЧАНИЕ. Сама инъекция - это короткая процедура, которая может быть выполнена в течение нескольких секунд. - Один раз в день проверяйте паразитемию крови на мазках крови с 3-го дня после заражения SPZ.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мониторинг паразитемии был ранее визуализирован в статье JoVE Mueller et al. 8 - Оцените мышей один раз в день с помощью шкалы быстрого кома и шкалы поведения (RMCBS), начиная с 5-го дня после инъекции спорозоита.
ПРИМЕЧАНИЕ. Подробное описание этой процедуры, включая демонстрацию видео, было опубликовано Caroll et al. 6 - оценитьМышей с визуализацией МРТ в соответствии с оценкой RMCBS и вопросом исследования, подлежащим рассмотрению. 6
2. Настройка магнитно-резонансной томографии
- Выполните МРТ на маленьком сканирующем сканере 9,4 т с использованием объемного резонатора для радиочастотной передачи и катушки приемника поверхности с 4-канальной фазированной решеткой. Включите водяную баню с контролируемой температурой до 42 ° C, чтобы поддерживать температуру тела мыши.
- Вызывают анестезию в камере с использованием 2% изофлурана и сжатого воздуха, пока мышь больше не реагирует на пинч пальца. Поддерживайте анестезию на уровне 1-1,5%.
- Поместите катетер хвостовой вены в хвостовую вену мыши. Расположите мышь для МРТ, поставив ее склонным и с хрустом спиной на животной кровати, оборудованной головной дверью и зубчатым стержнем, чтобы свести к минимуму движение головы. Старайтесь не выпрямлять шейный позвоночник мыши.
- Подключите систему инъекции контрастного вещества к катетеру хвостовой вены, Используйте специальную инъекционную систему, заполненную шприцем Gd-DTPA (0,3 ммоль / кг), или используйте полиэтиленовые трубки, подключенные к шприцу Gd-DTPA (0,3 ммоль / кг).
- Нанести глазную мазь декспантенолом на оба глаза. Поместите обмотку головки приемника с 4-канальной фазированной решеткой на головку мыши. Поместите дыхательную подушку на тыльную сторону мыши и подключите ее к устройству мониторинга дыхания.
3. Протокол обработки изображений
ПРИМЕЧАНИЕ. Выберите последовательности изображений из приведенного ниже протокола в соответствии с вопросами исследования, которые необходимо решить. Все перечисленные параметры действительны для программного обеспечения MRI, но могут потребоваться корректировка при использовании других программ.
- Начните с выполнения локализующего сканирования, чтобы убедиться, что мозг мыши находится в изоцентре магнита.
- Чтобы качественно оценить вазогенный отек, используйте 3D-взвешенное изображение с Т2, выбирая многосекундную RARE-последовательность.
- Введите следующий paПомехами в программное обеспечение MRI: время повторения = 2000 мс, время эха = 22 мс, изотропное разрешение = 0,1 мм, поле зрения = 20 x 10 x 12 мм 3 ; Матрица = 200 x 100 x 120, угол поворота = 90-180 °; (Спин-эхо) и редкий фактор = 8. Запустите последовательность и подождите 10 мин 48 с, чтобы получить необработанные изображения.
- Чтобы количественно оценить вазогенный отек, произведите релаксометрию Т2, выбирая многослойную множественную спин-эхо-последовательность.
- Используйте следующие параметры: время повторения = 3,100 мс, время эха = 8-136 мс с шагом 8 мс, количество срезов = 17, толщина среза = 0,7 мм, разрешение по плоскости = 0,116 мм x 0,116 мм, поле зрения 20 X 20 мм 2 , матрица = 172 x 172, угол поворота = 90-180 градусов; (Спин-эхо). Запустите последовательность и подождите 8 мин 53 с, чтобы получить необработанные изображения.
- Чтобы количественно оценить как вазогенный отек, так и цитотоксический отек, выполните диффузионно-взвешенную визуализацию / коэффициент кажущейся диффузии(АЦП) путем выбора диффузионной последовательности ЭПИ спин-эха.
- Используйте следующие параметры: время повторения = 3.400 мс, эхо-время = 20 мс, толщина среза = 0,7 мм, количество срезов = 17, количество сенсибилизированных направлений диффузии = 30, значение b = 1,500 с / мм 2 , δ = 3 мс , Δ = 9 мс, частичный коэффициент ускорения Фурье = 1,51, поле зрения = 12 x 15 мм 2 , матрица = 96 x 128, разрешение в плоскости = 0,125 мм x 0,117 мм, угол поворота = 90-180 градусов и Количество насыщенных срезов (сагиттал) = 1. Запустите последовательность и подождите 7 минут 56 с, пока не будут получены необработанные изображения.
- Чтобы оценить микрогеморрагии, используйте 3D T2 * -среднюю визуализацию. Выберите FLASH-последовательность с компенсацией потока.
- Введите следующие параметры в программное обеспечение MRI: время повторения = 2000 мс, время эха = 22 мс, изотропное разрешение 0,08 мм, поле зрения = 32 x 15 x 8 мм 3 , размер матрицы = 400 x 188 x 100 и fУгол губ = 12 градусов. Запустите последовательность и подождите 15 мин 40 с, чтобы получить необработанные изображения.
- Чтобы оценить артериальную проходимость, используйте время ангиографии полета, выбрав трехмерную последовательность FLASH.
- Используйте следующие параметры в программном обеспечении MRI: время повторения = 16 мс, время эха = 3,5 мс, толщина среза = 0,07 мм, разрешение в плоскости = 0,104 x 0,104 мм, поле зрения = 20 x 20 x 10 мм 3 , матрица = 192 x 192 x 142, угол поворота = 15 градусов. Запустите последовательность и подождите 7 минут 16 с, пока изображения не будут получены.
- Чтобы оценить нарушение гематоэнцефалического барьера, используйте 3D T1-взвешенную визуализацию до и после инъекции контрастного агента 0,3 ммоль / кг. Выберите радиочастотную вспышку FLASH с глобальным радиочастотным возбуждением.
- Используйте следующие параметры последовательности в программном обеспечении MRI: время повторения = 5 мс, время эха = 1,9 мс, изотропное разрешение = 0,156 мм, поле зрения 20 х 18,7X 18,7 мм 3 , матрица 128 x 120 x 120 и угол поворота = 8.5 ° ;. Начните последовательность и подождите 1 мин 14 секунд, пока изображения не будут получены.
4. Обработка и анализ изображений
- Чтобы проанализировать нарушение гематоэнцефалического барьера, вычитайте трехмерные не расширенные изображения, взвешенные по T1, из расширенных изображений с T1-взвешиванием с помощью арифметического инструмента или инструмента калькулятора изображения в ImageJ. Оцените вычитание изображений для увеличения сигнала, что соответствует разрушению гематоэнцефалического барьера. 9
- Чтобы проанализировать объем мозга, используйте собственные 3D-массивы T1 или 3D T2. Выделите мозг из обонятельной луковицы в мозжечок, используя редактор сегментации. 10
- Вазогенный отек
- Обработайте данные релаксометрии T2 с помощью программного обеспечения MRI или используйте нелинейную процедуру подбора наименьших квадратов. 11 Данные с диффузионно-взвешенной технологией для получения карт АЦП с использованием МРТTware или FDT (см. Таблицу материалов ).
- Поместите области интереса вручную в разные анатомические области.
ПРИМЕЧАНИЕ. Автоматическое размещение областей, представляющих интерес, может регистрироваться неправильно из-за значительного отека мозга. Таким образом получают значения Т2 и АЦП выбранных анатомических областей.
- Чтобы проанализировать объем микрогеморрагии, выделите микрогеморрагии, которые выглядят как яйцевидные, темные фокусы на T2 * -уровневых наборах данных, используя редактор сегментации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
У мышей C57BL / 6 первые клинические симптомы ECM наблюдаются между 6 и 10 днями после заражения спорозоитами P. berghei ANKA . ECM развивается у 60 - 80% инфицированных мышей и быстро прогрессирует до комы и смерти в течение 24-48 часов. Напротив, мыши, которые не развивают ECM, умирают после второй недели после инфицирования от тяжелой анемии из-за гиперпаразитемии. 12
В МРТ-визуализации самые ранние признаки ECM видны в обонятельной луковице, которая принадлежит обонятельной системе мыши и расположена в ростральной части мозга. 7 , 13 Увеличение разрыва гематоэнцефалического барьера (наблюдаемое на изображениях с увеличенным T1-коэффициентом контраста) и увеличение жидкости (увеличение сигнала T2 на T2-взвешенных изображениях, релаксометрия T2 и диффузионно-взвешенное изображение) указывают на ранний вазогенный отекВ обонятельной луковице, которая уже присутствует в легкой болезни (показатель RMCBS 20-16), и начинает распространяться по мере увеличения тяжести заболевания. Относительные изображения сигналов T1 помогают обнаружить тонкое нарушение гематоэнцефалического барьера ( рисунок 1 ). Нарушение гематоэнцефалического барьера и вазогенный отек развиваются определенным образом. Эти патологические изменения распространяются вдоль рострального миграционного потока, мигрирующего маршрута для нейробластов, к стволу головного мозга, который достигается при очень тяжелом заболевании (RMCBS болит 9-0). На картах Т2 тяжесть вазогенного отека можно количественно оценить, привлекая интересные области в конкретные анатомические области, как показано на рисунке 2 . Для каждой области может быть получено время релаксации T2, которое увеличивается с увеличением отека. Наряду с вазогенным отеком и нарушением гематоэнцефалического барьера опухоль головного мозга начинается с серьезности ECM. Объем мозга, указывающий на отек, начинает значительно увеличиваться у умеренно больных мышей как комПо сравнению с исходным уровнем и дальнейшим увеличением количества сильно больных мышей ( рис. 3 ).
Микрососудистая патология, о чем свидетельствуют микрогеморрагии и увеличение контрастности восприимчивости сосудов (что соответствует медленному течению), возникает после первых признаков нарушения гематоэнцефалического барьера и вазоодного отека и может быть визуализировано с помощью T2 * -звезного изображения. Микроосаждения преимущественно встречаются в обонятельной луковице ( рис. 4 ). Количество микрогеморрагов увеличивается с прогрессирующим заболеванием. При прогрессирующей болезни микрогеморраги также проявляются в коре, базальных ганглиях, мозжечке, белом веществе и стволе мозга.
Снижение артериальной проходимости наблюдается при ангиографии во время полета, что является признаком макроваскулярного нарушения параллельно с микрососудистыми изменениями. Церебральный инфаркт не является ключевым нахождением в ECM. Однако при очень тяжелом заболевании основные областиУменьшение АЦП можно выявить, указав церебральные инфаркты.
Рисунок 1: Нарушение барьера мозгового мозга. ( A ) Репрезентативное изображение коронального 3D T1-взвешенного изображения. Увеличение сигнала T1 наблюдается в центральной области обонятельной луковицы. ( B ) На соответствующем изображении сигнала T1 (предварительное контрастное изображение T1, вычитаемое из постконтрастного изображения T1), экстравазация контрастного вещества легче очерчивать. Экстравазатор контрастного вещества виден в лобных областях коры (белые стрелки). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Релакс T2ometry. Образцы карт T2 на разных высотах от одной сильно больной мыши с оценкой RMCBS 5 ( A ) и базовым сканированием ( B ) отображаются в цветовой гамме, в шкале серого и в сером цвете с ROI в виде цветных накладок. Синий = RMS, зеленый = кора, бирюза = внешняя капсула, желтый = базальные ганглии, светло-синий = DMS, оранжевый = таламус и красный = мозговой штурм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерения объема мозга. Объем мозга значительно увеличивается у умеренно больных мышей (RMCBS 15-10). Показаны репрезентативные значения 10 мышей. Данные представлены как среднее стандартное отклонение. Для анализа различий в бюстгальтере был использован t-критерий для парного студентаПри набухании между группами. У умеренно / сильно больных мышей объем мозга был значительно увеличен по сравнению с исходным уровнем (p = 0,021 / 0,001). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Микрогеморраги. Показаны T2-взвешенные изображения мыши перед наступлением инфекции на стадии крови ( A ) и на 8-й день после заражения с помощью показателя RMCBS 14 ( B и C ). На первом изображении никакие микрогеморремы не видны ( А ), а во втором и третьем изображениях видны несколько микрогеморрагов с преобладанием обонятельной луковицы (B: плоское корональное изображение, C: 3D-проекция с сегментированными микрогеморрагиями).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы описываем МРТ-протокол всего мозга для определения изменений в экспериментальной церебральной малярии. Мы считаем, что МРТ до сих пор недостаточно используется в исследованиях малярии и надеемся, что наши протоколы помогут другим исследователям. Мы хотели бы описать некоторые дополнительные моменты, которые могут быть полезны.
Если выводятся тяжелые больные мыши, то позиционирование имеет решающее значение. Из-за повышенного внутричерепного давления мыши подвержены смерти, и поэтому шейный отдел позвоночника не должен растягиваться. Анестезию следует также свести к минимуму. Если визуализировать мышей с легкой болезнью, лучший момент времени для МРТ составляет 12-24 ч до ожидаемого начала первых клинических симптомов. Мягкий вазогенный отек в обонятельной луковице наблюдается у мышей, у которых нет клинических признаков ECM (оценка RMCBS 20).
Длина самого протокола MRI может быть адаптирована в соответствии с конкретным вопросом исследования. Минимальный протоCol должен включать взвешенную по T2 последовательность или релаксометрию T2 и последовательность T2 * с взвешенным весом, чтобы судить о наличии вазоодного отека и микрохромной нагрузки / микрососудистой недостаточности. Чтобы получить изображения хорошего качества, артефакты движения должны быть сведены к минимуму. Движение будет уменьшено благодаря правильному расположению мыши и поддержанию скорости дыхания примерно на 60-80 вдохов в минуту.
Другие методы визуализации in vivo , такие как интравитальная микроскопия, демонстрируют перспективность визуализации патологических изменений в ECM на клеточном уровне. 14 , 15 , 16 , 17 По сравнению с МРТ, микроскопическая микроскопия может обеспечить высокое пространственное разрешение за счет покрытия только ограниченной области коры. Напротив, МРТ способна охватить весь мозг с разрешением до 80 мкм. Поэтому МРТ может проводить дальнейшие клеточные исследования, идентифицируяСайты пристрастия - начало заболевания, а также стадию заболевания, которые затем могут быть оценены с использованием дополнительных методологий. Результаты МРТ в ECM можно сравнить с патологическими изменениями, выявленными с помощью МРТ при церебральной малярии. Как человеческая, так и экспериментальная церебральная малярия демонстрируют вазогенный отек в областях нейрогенеза, а также микрососудистую патологию, такую как вторичные церебральные инфаркты в водораздельных зонах. 7 , 18 Аналогичным образом затрагиваются белое и серое вещество, а опухоль головного мозга как у человека, так и у экспериментальной церебральной малярии связана с мозговой стеной при тяжелой болезни, объясняя состояние коматозности. 2 , 7
Мы надеемся, что визуализация in vivo поможет разгадать лежащий в основе патологический механизм церебральной малярии, который в настоящее время остается неуловимым. Поскольку отек и опухоль головного мозга едва заметны ex vivo, мнеМетоды визуализации этой патологии in vivo являются ключевыми и помогут улучшить оценку новых методов лечения и вакцинации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
С благодарностью признается экспертная техническая помощь Мириам Рейниг. AH получил финансирование от постдокторской стипендии медицинского факультета Гейдельбергского университета. MP поддерживается мемориальной стипендией фонда Else-Kröner-Fresenius. АКМ является получателем стипендии по беременности и родам Академии DZIF Немецкого центра инфекционных исследований (DZIF). JP является получателем научного центра Heidelberg Research Molecular Medicine (HRCMM) по развитию карьеры. Кроме того, мы с благодарностью признаем Джулию М. Саттлер и Фридриха Фришкнехта за предоставление образцового фильма о спорозоите.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001747 | for anesthesia |
| Dotarem | Guebert | 1086923 | Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL |
| Amira (Image Processing Program) | FEI Group | Version Amira 5.3.2 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., | Release 2012b | |
| FDT toolbox | FMRIB's Software Library | http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
- Seydel, K. B., et al. Brain swelling and death in children with cerebral malaria. N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).
- Penet, M. F., et al. Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).
- de Souza, J. B., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).
- Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice. Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).
- Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), (2010).
- Hoffmann, A., et al. Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream. PLoS Pathog. 12 (3), e1005470 (2016).
- Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J Vis Exp. (84), e50829 (2014).
- Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome. Brain Res. 1237, 101-109 (2008).
- Giri, S., et al. T2 quantification for improved detection of myocardial edema. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56 (2009).
- Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L. Experimental models of cerebral malaria. Curr Top Microbiol Immunol. 297, 103-143 (2005).
- Zhao, H., et al. Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria. Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).
- Nacer, A., et al. Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier. PLoS Pathog. 10 (12), e1004528 (2014).
- Nacer, A., et al. Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria. PLoS Pathog. 8 (10), e1002982 (2012).
- Pai, S., et al. Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis. PLoS Pathog. 10 (7), e1004236 (2014).
- Shaw, T. N., et al. Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria. PLoS Pathog. 11 (11), e1005210 (2015).
- Potchen, M. J., et al. Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease. AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).
