Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335

Summary

Данио регенерации сетчатки в основном были изучены с использованием фиксированных сетчатку. Однако динамические процессы, такие как интеркинетического ядерной миграции происходят во время рекуперативного ответа и требуют живых клеток, чтобы исследовать основные механизмы. Здесь мы описываем культуру и условия формирования изображения для мониторинга интеркинетического ядерной миграции (НИМ) в режиме реального времени с использованием многофотонный микроскопии.

Abstract

Эндогенная программа регенерации инициируется Müller глии в взрослых данио (Danio rerio) сетчатка следующие повреждения нейронов и смерти. Глии Мюллера вновь войти в клеточный цикл и производят нейрональные клетки-предшественники, которые претерпевают последующих раундов клеточных делений и дифференцируются в потерянных нейрональных типов клеток. Оба Müller глии и нейронов клеток - предшественников ядер реплицировать свою ДНК и подвергаются митоза в различных местах сетчатки, то есть они мигрируют между базальной Внутренний ядерный слой (INL) и наружный ядерный слой (ONL), соответственно, в способе , описанном в интеркинетического Ядерная миграция (INM). INM в основном была изучена в развивающейся сетчатке. Для изучения динамики INM во взрослом регенерирующим данио сетчатку в деталях, живых клеток изображений флуоресцентно-меченых Мюллер глии / нейрональных клеток-предшественников требуется. Здесь мы предоставляем условия для выделения и культуры спинные сетчаткуот Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио , которые подвергались воздействию постоянного интенсивного света в течение 35 часов. Мы также показали , что эти культуры сетчатки являются жизнеспособными для проведения экспериментов визуализации живых клеток, постоянно приобретая Z-стек изображений по всей толщине эксплантов сетчатки глаза до 8 ч с использованием многофотонной микроскопии для наблюдения за миграционную поведение GFAP: nGFP -положительным клетки , Кроме того, мы описываем детали для проведения анализа после обработки изображений для определения скорости апикальной и базальной INM. Подводя итог, мы создали условия для изучения динамики INM во взрослой модели регенерации нейронов. Это позволит углубить наше понимание этого ключевого клеточного процесса и позволяют определить механизмы, которые контролируют INM.

Introduction

В отличие от людей, данио (Danio rerio) демонстрируют надежный ответ регенерации на гибель клеток нейронов сетчатки 1, 2, 3, 4. Фактор некроза опухоли α, сигнальная молекула , которая высвобождается от смерти нейронов сетчатки индуцирует Müller глии проживающее в базальном Внутренний ядерный слой (INL) сетчатки, пролиферировать 5 и производить нейрональных клеток - предшественников , которые продолжают разрастаться до того дифференцироваться в нейронную клетку типы , которые умерли 2, 3, 4. Во время пролиферативной фазы реакции регенерации, ядра Müller глии и их производные нейрональные клетки - предшественники проходят повторяющиеся миграционную картину в фазе с клеточного цикла (интеркинетического миграции ядер, INM) 6 >, 7. Ядра расположены в базальной INL реплицировать свою ДНК, прежде чем переходить к наружному ядерный слой (ONL), где они делят до того, как возникающие ядра возвращают базально к INL. Этот процесс был впервые описан в ходе нейроэпителиальной разработки с использованием гистологических методов, в то время как методы визуализации живых клеток позже подтвердил толкование Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Обе гистохимические и живых клеток подходы формирования изображений используются для определения механизмов , лежащих INM и его функции в развитии нейроэпителия включая сетчатку 9, 11, 12, 13. Однако механизмы, регулирующие INM во взрослом регенерирующейся сетчатку не были изучены достаточно подробноXref "> 6, 7. живых клеток будет неоценимым подход для продвижения наших знаний о сигнальных путей , которые контролируют INM во взрослом регенерирующей сетчатки.

До недавнего времени живой ячейки изображения INM в сетчатке не был ограничен либо живых эмбрионов данио или к эмбриональной птенца или послеродового мыши эксплантатов сетчатки глаза 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. В то время как эксплантов сетчатки глаза от взрослых животных разных видов , включая мышей, крыс и данио были использованы для различных клетки биологические подходы 17, 18, 19, 20, эксперименты живых клеток с использованием эксплантатов сетчатки глаза гаве были ограничены короткими периодами времени и не выполняется непрерывно в течение нескольких часов 21, 22. Здесь мы описываем подробный протокол к культуре легких поврежденных взрослых данио сетчатке для проведения экспериментов живых клеток изображений INM мониторинга с использованием мульти-фотонной микроскопии 6. Подходы живых клеток имеют преимущество перед иммуногистохимических методов при исследовании механизмов , контролирующих INM, как динамика INM, например, скорости могут быть затронуты , а не место митоза, который бы не потенциально быть обнаружены с помощью иммуноцитохимии.

В дальнейшем, этот метод также имеет потенциал, чтобы быть модифицирована для изучения других динамических процессов во время регенерации сетчатки, такие как фагоцитоз смерти фоторецепторов Мюллером глии или поведение микроглии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: рерио были подняты и поддерживается на объекте Нотр-Дам данио в области наук о жизни Центра Freimann. Методы, описанные в этой рукописи утверждаются Университета Нотр-Дам уходу и использованию животных комитета и в соответствии с заявлением для использования животных в научных исследованиях зрения Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии.

1. Решения

  1. Подготовьте 70% этанола для стерилизации капот культуры тканей и любое оборудование / реагенты, которые передаются в капот культуры ткани.
  2. Добавляют 2 мл 2-феноксиэтанол до 1 л воды в системе (1: 500 2-феноксиэтанол).
  3. Приготовьте 0,1 мМ NaHCO 3, рН 8,0. Используйте шприц объемом 10 мл и размер пор шприцевой фильтр 0,2 мкм, чтобы стерилизовать раствор в стерилизованную капот культуры ткани.
    Примечание: NaHCO 3 используется для эффективного распространения клеток и тканей клей по всей поверхности покровного fluorodishes (смшаг 3.2).
  4. Готовят 1,0 M CaCl 2 и 1,0 М MgCl 2. Стерилизация с помощью шприца 10 мл и 0,2 мкм размером пор шприцевой фильтр в стерилизованные капот культуры ткани.
  5. Для подготовки Hank's-сбалансированный солевой раствор (HBSS), добавить стерильный CaCl 2 и стерильно MgCl 2 до 1х HBSS без Ca 2+ / Mg 2+, без фенола красного в конечной концентрации 1 мМ каждого. Работа в стерильной среде.
  6. Для приготовления культуральной среды, смесь 50% 1x минимальную поддерживающую среду (MEM) , без фенола красного, 25% HBSS , содержащий CaCl 2 и MgCl 2 (смотри раздел 1.4), 25% лошадиной сыворотки (HS), 10 единиц / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина. Работа в стерильной среде.
    Примечание: Избегайте среды, содержащей фенол красный, как это autofluoresces, влияя тем самым сигнал-шум. 23
  7. Приготовьте 10 мл 1% легкоплавкой агарозы в 1X MEM без фенолового красного. Растопить агарозы / 1x MEM с помощью микпросп. Приготовьте небольшие объемы агарозы (например, 10 мл) в качестве повторяющегося повторного нагрева изменит концентрации ионов из - за испарения жидкости.
  8. До начала культивирования, стерилизовать 1,5 мл микроцентрифужных трубки автоклавированием.

2. Свет-повреждение Paradigm

  1. Темно-адаптация
    1. 2 место - 3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио (или другой трансгенной данио интереса) на 6 - 14 месяцев в окружающую среду , лишенную света для 14 г. Для получения более подробно см ссылку 2, 6, 24, 25.
  2. Поместите резервуар , содержащий 2 - 3 темно-адаптированный трансгенного данио в воде системы между двумя люминесцентными лампами , которые излучают свет 2800 люкс 2, 6, 24, 25. Expose данио к постоянной интенсивным светом в течение 35 часов. Во время воздействия света, гарантировать, что температура воды поддерживается между 31 - 33 ° C.

3. Подготовка к культивированием (В день Ретинального изоляции)

  1. Используя 70% этанола, стерилизовать капот культуры тканей и компоненты / инструменты, которые передаются в капюшоне культуры ткани (например, флаконы , содержащие MEM и HBSS, пипетки, стерильные наконечники пипеток и т.д.).
  2. Получение fluorodishes
    1. Смазать один fluorodish для каждой сетчатки с клеткой и тканевым клеем (см Таблицу материалов).
    2. Развести клеток и тканей адгезив в 0,1 мМ NaHCO 3 до конечной концентрации 70 мкг / мл, добавляют по 50 мкл в каждую fluorodish и распространить решение через центр fluorodish с 200 мкл кончика пипетки (приблизительно 1 - диаметр 1,2 см ).
    3. Инкубируйте fluorodishes с покрытием в течение 1 - 3 ч при комнатной температуре; (В качестве альтернативы, инкубировать O / N при 4 ° С).
    4. Удалить раствор и полоскать 3 раза с 500 мкл 1х MEM для каждой стирки. Чтобы избежать fluorodishes с покрытием от высыхания, поддерживать их в MEM до эксплантов сетчатки глаза не установлены.
  3. Подготовка культуральной среды, как описано на стадии 1.6. Питательную среду можно хранить в течение до 1 недели при температуре 4 ° С.

4. Выделение и Культивирование эксплантов сетчатки

Примечание: Протокол описано ниже для выделения дорсальной части сетчатки, которая является область сетчатки глаза, который преимущественно пораженном с помощью описанной парадигмы свет на повреждения. Таким образом, повреждение-индуцированной пролиферации и связанное с ним событие интеркинетического ядерной миграции происходят в дорсальной части сетчатки. Тем не менее, процедура изоляции может быть скорректирована с получением областей сетчатки глаза в соответствии с конкретными требованиями исследователя / исследовательского вопроса.

  1. Эвтаназии один легкий поврежденной трансгенного данио Aта время в 1: 500 2-феноксиэтанол.
  2. Удалить MEM из одного fluorodish с 1000 мкл пипетки, так что только тонкая пленка остатков жидкости.
  3. Передача данио на сухую бумажное полотенце, удалить глаз с изогнутой парой Дюмон пинцетом (пинцет # 5, под углом 45 °) и передать его на fluorodish.
  4. Использование стереомикроскопа, ориентируем глаз с ученика на крышку проскальзывания fluorodish так, чтобы спина глаза с зрительного нерва видна (рис 1D).
  5. С парой МакФерсон-Vannas ножниц удалить зрительного нерва, резка близко к задней части глаза. Кроме того, удалить соединительную ткань, выстилающих вне глаза.
  6. Держите глаз между его носовой и височной стороны с парой # 5 щипцов, делая надрез в зрительном стебле, прокалывая одним ножницеобразном лезвием через решетчатой пластинки и разрезанием вдоль обоих носовой и височной стороны глаза (рис 1E , сегментированный Liпе).
  7. Используя две пары # 5 пинцетом, один для проведения спинной стороне сетчатки, а другая пара, чтобы отделить от брюшного дорсальной части сетчатки, тянуть ткани.
    Примечание: Желательно, чтобы ориентировать спинной сетчатки глаза так, чтобы объектив и слой ганглиозных клеток сталкиваются с покровное в то время как склеры обращен вверх.
  8. Удалить склеры из дорсальной части сетчатки с одной парой # 5 щипцов, придерживая объектив , который подключен к сетчатке со второй парой # 5 щипцов (рис 1Н, I).
  9. Чтобы снять объектив, используйте Макферсон-Vannas ножницы и вырезать за объективом без повреждения сетчатки глаза (рис 1I, J). Иногда линза отделяется на этапе 4.7. В этом случае удалите склеры осторожно пинцетом, удерживая сетчатку на отреза со второй парой # 5 щипцов.
  10. Удалите стекловидное тело, удаляя линзы без повреждения сетчатки глаза. Свести сетчатку со слоем ганглиозных клеток, обращенной к покровноеиз fluorodish (рис 1L, М).
  11. Объемный сетчатку с 10 мкл 1% легкоплавкой агарозы и пусть агарозном затвердевать.
  12. Смотрите, что жидкость агарозы не снимает сетчатку, так как даже небольшое возвышение может повлиять на способность глубоко сосредоточиться в ткани. Если наблюдается подъем, используйте пипетку, чтобы удалить агарозы. Пусть остаточный набор агарозы, прежде чем пытаться добавить больше.
  13. Повторите шаг 4.12 несколько раз перед добавлением 1% легкоплавкой агарозе, чтобы покрыть всю fluorodish. После того, как агароза затвердела, добавьте 1,5 мл культуральной среды.
  14. Поддерживать культуру эксплантов сетчатки глаза в 5% / воздушной среде СО 2 , установленной на уровне 32 ° С в течение примерно 12 часов , чтобы позволить сетчатка оправиться от стресса , понесенные процедуры выделения. Установите температуру до 32 ° С, чтобы поддерживать сетчатку при той же температуре в виде светло-обработанного данио рерио (этап 2.3).

5. Многофотонная Микроскопия

Таблицу материалов), большие расстояния цели погружения в воду 40X Апо (NA 1.15), сканер гальванометра и климатическую камеру, которая содержит вставку для четырех 35 мм чашки Петри. Изображения были получены с не descanned детектором (R-NDD).

  1. До визуализации, уравновешивают экологической камеры для достижения 5% / воздуха атмосферы СО 2. Убедитесь, что пустые чашки Петри вставлены в держатель, чтобы избежать утечки газа в помещение.
  2. Включите систему микроскопии.
  3. После того, как камера окружающей среды уравновешивают, добавить показатель преломления жидкости на большие расстояния погружения в воду цели 40X Апо (NA 1.15).
    Примечание: Показатель преломления жидкость с оптическими свойствами, аналогичными свойствам воды используется во избежание испарения воды при длительном визуализации.
  4. Место гриппаorodishes с эксплантатов сетчатки глаза в камеру. Используя свет светлого, поместите образец в пути света и довести midregion спинной сетчатки в плоскости фокуса.
  5. С помощью GFP эпифлуоресцентной свет , чтобы сосредоточить внимание на GFAP: nGFP -положительным Мюллера ядер глии (рис 2А, В).
    Примечание: Если эксплантаты не установлены плоские или агарозы накопилось под эксплантов, это будет трудно сосредоточиться на GFAP: nGFP -положительные ядер , или они будут флуоресцировать слабо.
    1. Проверьте, правильно ли переезд в другой области в пределах той же эксплантов сетчатки глаза преодолеет фокусировки вопрос. В противном случае перейти к другому эксплантов сетчатки глаза.
  6. В программном обеспечении получения изображения, откройте 'A1 MP GUI', то 'TiPad', то 'A1 Компактный графический интерфейс "и" приобретение ND "окна. Для многофотонного изображений, убедитесь, что параметр в 'ИК NDD' выбрана в 'A1 Compact GUI.
  7. В "НастройG 'поле, выберите ИК-DM для 1 - го дихроичного зеркала и выбрать полосовой фильтр 525/50 приобрести GFP флуоресценции.
  8. Включите ИК-лазера в окне с надписью «A1MP GUI». Это займет несколько минут, лазер, чтобы быть готовым. Установите длину волны 910 нм для возбуждения флуоресценции GFP и выровнять лазер, нажав на кнопку "Auto выравнивания" в окне "A1 MP графического интерфейса пользователя '.
  9. Убедитесь в том, что помещение и оборудование фары выключены или закрыты перед открытием затвора в 'A1' MP GUI, чтобы избежать передержки ФЭУ. Для снижения уровня шума, размещения микроскопа в затемненном помещении.
  10. Приобретать изображения поля зрения 300 х 300 пикселей, при увеличении двух, и время пикселей жилище 4,8 мкс / пиксель. Грубо настроить мощность лазера путем изменения 'зону захвата' в 'A1MP GUI' и коэффициента усиления в окне "A1 Compact графического интерфейса пользователя '.
  11. Настройка Z-стек
    1. Сосредоточьтесь на слое ганглиозных клеток, чтобы установить верхний фокальной плоскости Z-стека в 'Z' подокна в "окне приобретения ND '. Некоторые GFAP: nGFP -положительные клетки , как правило , расположены в слое ганглиозных клеток, что помогает определить базальную предел сетчатки (рис 2А, D).
    2. Перемещение фокальной плоскости через уровень ОНЛ (рис 2А, В), которая характеризуется наличием слабо меченым GFAP: nGFP -положительным клетки , которые являются круглыми и увеличены по сравнению с их аналогами в INL (рис 2A, C) ,
    3. Установить эту плоскость в нижней части Z-стека. Убедитесь в том, что весь ОНЛ будет образ (рис 2А, В).
    4. При возникновении координационных сдвигов плоскости, которые требуют Переустановка в период формирования изображения, дважды щелкните на средней позиции в 'Z' подокна, чтобы назначить его в качестве позиции «дома». Переход в "симметричном режиме определяется 'и нажмите кнопку «родственник».
    5. Установить размер Z-шага в диапазоне от 0,7 до 1 мкм.
  12. Коррекция Z-интенсивность:
    1. Применить корректировки г интенсивности, чтобы компенсировать потери интенсивности пикселей из-за рассеяния света при визуализации в глубоких слоях ткани.
    2. Чтобы установить исправление, откройте окно 'коррекции г интенсивности ". Для того, чтобы установить 'диапазон Z-стека', выберите 'From ND'.
    3. Нажмите на нижней фокальной плоскости в окне "Z интенсивности коррекции '(в данном случае, соответствует слой ганглиозных клеток) и установить интенсивность лазерного излучения (' область приобретения 'в' A1MP GUI ') и коэффициентом усиления (A1 Compact GUI ).
    4. Нажмите на стрелку рядом с 'Z-значений' в окне 'коррекции г интенсивности ", чтобы подтвердить настройки, которые впоследствии показаны в разделе" настройки устройства "в окне" коррекции г интенсивности »для выбранного фокальной плоскости.
    5. Повторите процесс для среднего ай верхней плоскости, увеличивая мощность лазера и коэффициент усиления. Дополнительные фокальные плоскости могут быть добавлены, если это необходимо. Таблицу 1 для конкретных лазерных и усиления настройки для экспериментов на рисунках 2 - 4.
    6. Установите 'зону захвата' в окне 'A1' MP с графическим интерфейсом. Не следует выбирать зону захвата больше, чем 15, и коэффициент усиления выше, чем 126, в начале обработки изображений, чтобы обойти фотообесцвечиванию и повышенного уровня шума.
      Примечание: Как лазеры и фотоэлектронные умножители различаются между микроскопии систем, тест-лазера и настройки коэффициента усиления для получения оптимальных условий для визуализации микроскопа созданного, избегая при этом фотообесцвечивание.
    7. Выберите 'коррекции относительной интенсивности' в окне 'коррекции г интенсивности ".
  13. В подокне "таймсериях" в окне "ND" приобретение, установить срок до 8 ч и интервал до "без задержки". Затем убедитесь, что нажать 'Run Z-коррекцию' в тон 'г-стек' к югу от окна в кнопке "ND" Приобретение окна приобрести таймсерий 3-D.
  14. Поддержание эксплантов сетчатки глаза при температуре 27 - 29 ° С в течение всего времени получения изображения.
  15. На протяжении всего периода получения изображения, при необходимости, повторно отрегулировать уровень мощности и коэффициента усиления, чтобы поддерживать качество изображения для анализа пост-обработки изображений. Для корректировки выполните шаги 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Если фокальной плоскости сдвигов, приостановить или остановить прогон и выполнить шаг 5.11 снова.
    Примечание: Если 'относительно г-коррекции "был выбран на этапе 5.12.7 и 5.11.4 шаг был выполнен не должно быть необходимости перенастроить мощности и коэффициента усиления уровней, если не произошло обширное фотообесцвечивание.

6. Анализ скорости

  1. Выдержка времени, установив "область интереса" на изображении. Используйте 'измерения времени' инструмента и экспортировать значения времени в электронную таблицу.
  2. Обрезка область, которая содержит диviding GFAP: nGFP -положительным ядро.
  3. Выберите обрезанную область так, что она содержит, по меньшей мере, одно ядро, которое не подвергается INM для того, чтобы установить точку отсчета для последующего измерения расстояния, что ядро ​​разделяющая мигрировали по отношению к базальной INL. Примечание: Чтобы выбрать ядро, которое остается в базисной INL, это помогает подготовить 3-D реконструкция таймсериях а.
  4. В качестве альтернативы, если GFAP: наблюдается nGFP -положительным клеток в ONL в течение всего периода сбора данных, используют вертикальную линию фиксированной длины , охватывающей от ONl ядра к базальной INL с целью определения опорной точки.
  5. С помощью функции "показать ломтиков View ', генерируют ортогональные проекции. Затем измените режим из "среза" до "максимальной проекции интенсивности».
  6. Выключите 'ху' вид ортогональной проекции максимальной. В зависимости от ориентации, при которой мигрирующий / разделив ядро ​​лучше всего видно, AРБП выключить либо "xz'- или" yz'-вид.
  7. Нажмите на изображение, оставшееся с правой кнопкой мыши и извлечь 'хг' или 'серии yz'-изображения с помощью "функции Создать новый документ с этой точки зрения". При необходимости повернуть изображение.
  8. С помощью функции "Ручное измерение", проведите горизонтальную линию через изображение на нижнем уровне ядра , который остается в базальной INL и не подвергается INM (= опорный пункт; Рисунок 4A - Е, красная горизонтальная линия).
  9. Измерьте расстояние между опорной линией и базисной точке ядра мигрирующей для таймсериях с помощью инструмента "измерения линии" в программном обеспечении анализа (см Рисунок 4A - E).
  10. После того, как ядерная оболочка распадается, измерить базальную положение сомы, если она является идентифицируемым после диффузии GFP в всей клетки.
  11. Использование программного обеспечения электронной таблицы, построить расстояние, нюмигрировали против упоминавшихся в гл времени , прошедшего (рис 4F).
    1. Для определения скорости апикальной миграции (v а), график расстояния , пройденного за период до распада ядерной оболочки происходит (рис 4G).
    2. Выберите серию данных в рамках диаграммы, щелкните правой кнопкой мыши и вставить кривую линейной регрессии в том числе соответствующая функция 'у = х + с'. Наклон 'м' в функции представляет скорость, v а (рис 4G).
    3. Повторите шаги 6.11.1 и 6.11.2 для первой фазы быстрой миграции базальных для определения базальной миграции скорость, V б (рис 4H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выделение сетчатки в соответствии с процедурой , описанной в схеме на фиг.1 , позволяет культивирование уплощенной дорсальной части сетчатки от светло-поврежденных взрослых Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио в течение не менее 24 ч в 5% СО в 2 / воздушная среда. Эти плоские навесные эксплантов сетчатки глаза могут быть использованы для координационных плоскостей изображения на уровне глубоких тканей. Примером может служить Müller глии / нейронные ядра клеток - предшественников , меченных GFP из Müller глии-промотор GFAP (глиальных фибриллярный кислый белок), которые расположены в ONL во время митоза в свет поврежденной сетчатки глаза (2A фигуры - D, 3). Для дальнейшего подтверждения того, что этот подход применим к изображению различные слои клеток сетчатки, остро изолированные эксплантов сетчатки были получены из неповрежденного Tg [Rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 данио глаза, выражающие EGFP в стержневых фоторецепторов подродопсина промотором. Рисунок 2E - Н показывает , что можно получить изображения GFP-положительных фоторецепторов стержня и их внутренних сегментов. В качестве стержневых внутренние сегменты проходят между коническими фоторецепторов в сторону пигментного эпителия сетчатки, эти данные будет означать, что это также возможно изображение конуса фоторецепторов. Это, однако, не дальнейшее расследование.

Понаблюдав Müller глии / ядер нейрональных клеток - предшественников в ONL в световом поврежденной сетчатки, мы охарактеризовали их миграционное поведение подробно (рис 3 и Movie 1). Клетки Мюллера / нейронные ядра клеток-предшественников, помеченных GFP мигрируют двунаправленным между базальной положением INL, где они обычно проживают и ONL, место потери фоторецепторов. Как правило, GFAP: nGFP -положительные ядра мигрировали на короткое расстояние в INL (рис 3A - C) , прежде чем они прошлиРазбивка ядерной оболочки, в то время как по- прежнему расположены в INL, основанный на перераспределении GFP в цитоплазме весь Клетки Мюллера / нейрональной прогениторных клеток (рис 3D). После деления клеток в ONL, два GFAP: nGFP -положительные ядра стали видны в ONL (рис 3F, G), возвращающего к базальной INL (рис 3Н - J). При делении клеток, вновь возникающие ядра изначально были очень тусклыми , и поэтому трудно определить (рис 3G). Тем не менее, в пределах от одного до двух временных рамок после митоза, ядерная флуоресценция GFP стал ярким, что позволило визуализировать ядерной миграции (рис 3Н - J). Живых клеток также позволила визуализировать разделительной плоскости (рис 3F, G), которое произошло в горизонтальном направлении на апикальной поверхности сетчатки для ячейки , показанной на фиг.3. Также возможно использовать другие трансгенные данио линии, такиекак Tg [GFAP: EGFP] NT11 данио , которые выражают GFP в цитоплазме (данные не показаны). Несмотря на то, что можно надежно определить верхушечный движение и горизонтальные деления клеток, часто бывает трудно точно определить положение базально мигрирующими дочерних ядер и вертикальных делений клеток в Tg [GFAP: EGFP] NT11 данио сетчатка (данные не показаны).

Для определения скорости, A GFAP: nGFP -положительным ядра , которые не мигрируют в течение всего периода записи была выбрана в качестве опорной точки (звезда, рис 4A - E). Расстояние ядра мигрирующей (вертикальная красная линия, рис 4A - E) определяли по отношению к опорному GFAP: nGFP -положительным ядра (горизонтальная красная линия, рис 4A - E) в каждой временной точке серии изображения на максимум или XZ YZ-проекции (в зависимости, при которой угол ядра может быть visualiзет наиболее эффективно). Расстояние , которое мигрировали ядро наносили на график против времени в таблице (рис 4F - H). Разбивка Ядерная мембрана часто наблюдается на графике в качестве начального движения basalward за счет перераспределения GFP в пределах всей клетки (базальные большая часть тела клетки в данном случае). Верхушечный скорость была определена перед пробоем ядерной оболочки, установки линейной регрессии кривая (серая пунктирная линия, рисунок 4G) на расстоянии в виде зависимости от времени за период до распада ядерной оболочки (красный алмаз, рис 4G). Наклон 'м' линейной кривой регрессии (у = х + с) представляет скорость 'йх /'. Верхушечный скорость для ячейки , представленной на рисунке 4 был 10,89 мкм / ч. Такой же подход был применен для расчета скорости первоначального быстрого базальной движения (v б) новообразованной дочерних ядер (рис 4F, H). Миграции базальных скорости v Ъ -67.71 и 33.51 мкм / ч дочерних клеток D1 и D2, соответственно, были сравнительно быстрее , чем апикальной скорости. К сожалению, не удалось определить верхушечную скорость после пробоя ядерной оболочки как GFP рассеянным по всей камере. Вместо этого была рассчитана мгновенная скорость на основании времени и положения ядра до распада ядерной оболочки и первой визуализации вновь образовавшихся дочерних ядер. Мгновенная скорость 7,9 мкм / ч для ячейки , показанной на рисунке 4, вероятно, занижена , как хроматин достигает ОНЛ до телофаза митоза, когда дочерние ядра становятся видимыми.

Подводя итог, культура эксплантов сетчатки позволяет живых клеток визуализации INM во взрослом регенерирующим данио сетчатку и определение миграции и деления клеток в годраметры отдельных ядер.

Рисунок 1
Рисунок 1: Ретинальная Процедура изоляции. А) Схематическое иллюстрирующей данио голову с глазом. Б) Глаз удаляется из данио и ориентированы , чтобы показать переднюю часть глаза с учеником. C) Поверните глазу на 180 ° , так что задняя часть глаза с оптической стебле (заполняется черный круг) становится видимым в (D) и ученик обращена вниз. Серый цвет указывает на наличие склеру глаза. Е) Один ножевой пары МакФерсон-Vannas ножниц вставляется в зрительном стебле глаза (заполненный черный кружок) , чтобы разрезать его на его дорзальной и вентральной сторон , которое обозначено белой сегментированной линией. F) Спинной половина глаза после того, как вентральный половина была удалена. Черный полукруг указывает тон остаточная часть глазного стебля. G) , Turn глаз 90 ° назад , чтобы выявить (H) внутреннюю часть глаза с сетчаткой (коричневый), стекловидное тело (не показано) , и линза (L, светло - серый круг) , который до сих пор , заключенная в склере (серая линия ). I) склеры отделилась (примечание, серая линия отсутствует) и J) линза и стекловидное тело удаляется порождая только сетчатки (коричневый). K) Retina повернута на 90 ° вперед, приводящее к плоскому монтажа вид на дорсальной части сетчатки (L). Эксплантов M) Спинной сетчатки глаза плоские установленные на стеклянным дном fluorodish. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: 3-D РеконструкцияСетчатки Многофотонная Z-стеки. А) 3-D реконструкция многофотонном г-стека серии изображений из GFAP: nGFP- положительных клеток в культурах сетчатки целом смонтировать данио после 48 часов светового повреждения. B - D) Single Многофотонные Оху изображения GFAP: nGFP -положительные клетки , отображаемые в 3D-реконструкции в позиции (А) на уровне ONL (В), БМНП (C), что соответствует слою, содержащему Müller глии сома и ВКТ (D). Стрелка в (B) показывает увеличенный круглый глии Мюллера в ONL после пробоя ядерной оболочки. E) 3-D реконструкция многофотонном г-стека серии изображений из эксплантата сетчатки глаза с неповрежденной Tg [Rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 данио. F - H) Single многоквантовые XY-изображения на уровне стержневых внутренних сегментов (RIS, F) стержень ядерного слоя (G) И на уровне внутренней сетчатки (H). GCL, ганглионарный слой; INL, внутренний ядерный слой; ONL, внешний ядерный слой; RIS, Род внутренний сегмент. Шкала бар в A, D, Е и Н, 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Timelapse Series Изображение INM. A - J) серии Изображение 3D-реконструкции г-стека Timelapse серии отображения Tg [GFAP: nGFP] mi2004 -положительным ядер , которые претерпевают INM разделить в ONL в эксплантатах сетчатки (верхний ряд). Положение одного апикально мигрирующего ядра и его базально мигрирующей дочерних ядер обозначается красными стрелками. Красная звезда указывает на распад ядерной оболочки во время митоза. A - J, нижняя строка)такой же серии изображений, как в верхнем ряду был перенасыщен и обрезано, чтобы сосредоточиться на делящихся клеток в ONL. INL, внутренний ядерный слой; IPL, Внутренний Plexiform слой; ONL, внешний ядерный слой. Шкала в баре, 10 мкм и является одинаковым для B - J. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Анализ апикального и миграции базальных скоростей. A - E) Максимальная уг-проекция серии изображений Z-стека Tg [GFAP: nGFP] mi2004 эксплантов сетчатки глаза при различных временных точках в записи Timelapse приобретенное многофотонной микроскопии. С помощью инструмента линии под функцией "ручное измерение", горизонтальная линия была помещена на уровне опорной ячейки, указанной звездой. Вертикальная мнеasurement линия была расположена , начиная с горизонтальной линии и расширение базисной позиции мигрирующей GFAP: nGFP -положительным ядра. Длина линии измерения дается в белых боксах на изображениях и для удобства чтения под изображениями. L1 = длина, что дочерние клетки мигрировали 1; L2 = длина, что дочерние клетки мигрировали 2. F) Расстояние , что ячейка (F0) измеряется в (А - Е) мигрировали апикально и что возникающие дочерние клетки D1 и D2 мигрировали базально в записи многофотонная Timelapse. Красная линия показывает измерения , для которого вычислен верхушечный скорость миграции (v а) в то время как черные и серые линии показывают измерения , используемые для расчета базальные скорости миграции (v б) для D1 и D2, соответственно. G, H) Расстояние наносили на график против времени в Excel для апикальной миграции до пробоя ядерной оболочки (G) и фаза быстрого базальнойМиграция для дочерних клеток D1 (H). Кривые линейной регрессии были установлены и функции приведены ниже графиков с наклоном, представляющей скорость. INL, внутренний ядерный слой; IPL, Внутренний слой Plexiform; ONL, внешний ядерный слой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Tg [GFAP: EGFP] NT11 Tg [Rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19
мощность лазера усиление мощность лазера усиление
Верхняя часть (стержень фоторецепторов) 13 126 3.5 118 Средний (Müller глии) 10 126 2.8 118
Дно (ВКТ) 8 126 2.1 118

Таблица 1: Лазер и получать уровни , используемые для Z-Intensity Исправления в разных плоскостях для экспериментов , представленные на рис 2 - 4.

фигура 2
Фильм 1: Live-ячейки изображения сетчатки эксплантов многофотонной микроскопии. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследования , расследующие механизмы , регулирующие регенерацию поврежденных взрослых данио сетчатки глаза преимущественно используются иммуноцитохимической методы 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Создание условий для эксплантов культуры сетчатки глаза и для выполнения визуализации живых клеток на явлениях, таких как INM, дают нам технику, чтобы получить в глубину пространственной и временной информации. Этот метод позволяет определить скорости миграции, сроки и место пробоя ядерной оболочки во время профазы митоза и длины и положения клеточного деления. Кроме того, можно установить плоскость разделения и судьбу дочерних клеток, возникающих в связи с их последующим расположением. В конечном счете, этот мощный подход будет определять, является ли М2; Меллера глии и нейрональные клетки-предшественники ведут себя по-разному в отношении INM в процессе регенерации сетчатки. Использование трансгенных данио линий , которые идентифицируют пролиферирующих клеток в регенерирующей сетчатки на различных стадиях реакции регенерации будет способствовать расшифровке дифференциальное поведение 6. В случае многофотонного микроскопа, используемого здесь, GFP репортер данио линии являются предпочтительными в качестве возбуждения красный флуоресцентный белок (RFP) является не очень эффективным; Тем не менее, другие многоквантовые системы могут обеспечить эффективное возбуждение RFP или эквивалентных флуорофоров.

Одним из наиболее важных этапов в процессе выделения ретиналь монтажа сетчатки. Сетчатка должны быть установлены как можно более плоской для многофотонность света, чтобы иметь возможность перейти на более глубокие Z-уровней ONL. Искривлением сетчатки особенно в краевой области, остаточной части стекловидного тела и / или накопление агарозы под культуры ретинального, который используется для иммобилизацииткани, наиболее часто вводить дополнительное пространство между покровным и культуры ретинального. Кроме того, увеличение мощности лазера и усиления должны быть использованы для получения изображений, если сетчатка не плоская, и это будет, следовательно, вызвать увеличение фотообесцвечивание и снижение жизнеспособности культуры сетчатки глаза. Неправильная установка также часто приводит к ухудшению качества изображения из-за проникновения света и пониженной будет влиять на способность измерять расстояния, что ядра мигрировали и, следовательно, расчет миграционных скоростей.

Скорости апикальной миграции до распада ядерной оболочки и базального миграции может быть надежно определена в серии изображений из Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио эксплантатов сетчатки глаза. Тем не менее, в настоящее время не представляется возможным определить скорость апикальной миграции хроматина после пробоя ядерной оболочки в этой трансгенной линии данио, как и GFP перераспределяет в течение всего цитоплазме. Labeliнг эксплантатов сетчатки с ядерным красителем Hoechst привело к тусклом поглощения в ядрах глии Мюллера, которые требуют изменения длины волны 830 нм (Lahne & Hyde, неопубликованные данные), что отразилось на жизнеспособности ткани и вызванной пробуксовыванием клеточного цикла ( Lahne & Hyde, неопубликованные данные). Во время развития сетчатки глаза, Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 данио , которые выражают GFP , слитый с гистона 2 были успешно использованы для мониторинга INM и определения скорости миграции на разных стадиях клеточного цикла 12, 31. В будущем, эксплантаты сетчатки глаза от Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 данио также позволит визуализировать хроматина на протяжении всего клеточного цикла и позволит анализ вершинной скорости миграции после распада ядерной мембраны у взрослых регенерирующим данио сетчатку.

Установив условия для мониторинга INM поживых клеток в эксплантатах сетчатки глаза от света поврежденных взрослых данио и соответствующего анализа скоростей будет служить основой для исследования механизмов, регулирующих INM. В некоторых исследованиях начал рассматривать механизмы INM у взрослых регенерирующего сетчатку с помощью иммуноцитохимии для определения положения митотический фосфо-гистона 3-положительных ядер 6, 7. Тем не менее, препятствуя сигнальных путей не может сделать положение митоза, но может повлиять на другие параметры, такие как скорость, времени митоза и деления, что было бы невозможно / очень трудно различить иммуноцитохимически. Ранее было показано , что фосфо-гистона 3-положительных митоза ядер mislocalized более базальное положение в развивающейся сетчатки у dynactin мутантов и морфантов 11. Однако после формирования изображения живых клеток показало, что ядерная миграция до клеточного деления была задержана в dynactin ослабленным клеткис, в то время как увеличение верхушечный скорость миграции позволило ядра , чтобы достигнуть и пройти деление клеток на апикальной поверхности 11, 12. Этот пример иллюстрирует мощь живых клеток. Аналогичным образом, когда разгадке механизмы, способствующие INM во взрослом регенерирующим данио сетчатку, исследования живых клеток будет дополнять, а также в различных случаях будет выгодно более, иммуноцитохимических подходов.

Как обсуждалось выше, живых клеток предлагает много преимуществ по сравнению с иммуногистохимических / статические методы; Тем не менее, он должен иметь в виду , что эксплантаты сетчатки экс естественных условиях модель. По мере их возникновения, таких, повреждения во время процедуры выделения и / или культурные условия могут влиять на клеточные процессы. Кроме того, процесс создания образа сама может оказывать токсическое действие , которые могут влиять на клеточное поведение 23, 32. Хотя есть disadvantages жить-клеточной визуализации культур сетчатки, в настоящее время наш лучший метод получения динамической информации о INM. Важно отметить, что процедура визуализации живых клеток эксплантатов сетчатки будет применяться к другим биологическим вопросам во время регенерации сетчатки. На основе иммуноцитохимических данных, ранее было предложено , что Мюллер глии фагоцитируют умирающих фоторецепторов / мусора после повреждения светоиндуцированная фоторецепторов 33. Настройка параметров изображения этот процесс жить будет проверять, если фагоцитоз умирающих фоторецепторов происходит в регенерирующим данио сетчатки и могут быть использованы для изучения основных механизмов. Показав , что изображения могут быть получены на уровне ядер стержня и стержня внутренних сегментов в Tg [Rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 данио, оно должно быть возможным скорректировать условия для изображения фоторецепторов фагоцитоза. Кроме того, знание ограничено относительно динамического поведения микроглии и механизмов, регулирующих ихфункция в дегенерирующей и регенерации сетчатки глаза 34, 35. Эксплуатируя микроглии специфические трансгенного данио в сочетании с изображениями живых клеток также увеличит наше понимание функции микроглии у взрослых регенерирующим данио сетчатку 36, 37. Подводя итог, живых клеток изображений эксплантов сетчатки является мощным инструментом для получения динамической информации клеточных процессов и определить поведение и функции различных типов клеток в регенерирующей сетчатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы высоко ценим поддержку, оказываемую Уильяма Арчер и Нотр-Дам Комплексная изображений фонда. Особая благодарность направлены на техников Freimann Life Sciences за их постоянную помощь и их ухода и животноводства в данио. Это исследование было поддержано грантами от Национального института глаза НИЗ к DRH (R01-R01, EY018417-EY024519) и Центра исследований данио, Университет Нотр-Дам, Нотр-Дам, IN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 120 эксплантов сетчатки глаза многофотонная микроскопия визуализация живых клеток данио интеркинетического ядерная миграция культура регенерация Мюллер глии митоз скорость
Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter