Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Summary

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

Abstract

תוכנית התחדשות אנדוגני הוא שיזם גליה מולר של דג הזברה מבוגר (Danio rerio) הרשתית בעקבות נזקים עצביים ומוות. גליה מולר להזין מחדש את מחזור התא לייצר ובתאים עצביים העוברים סיבובים הבאים של חלוקות תא להתמיין לסוגי התאים העצביים האבודים. שתי גליה מולר ו תא אב עצבי גרעינים לשכפל DNA שלהם ועוברים מיטוזה ב מיקומים שונים של הרשתית, כלומר הם נודדים בין השכבה הפנימית גרעין הבסיס (INL) ואת השכבה החיצונית הגרעינית (ONL), בהתאמה, בתהליך המתואר Interkinetic הגירה גרעינית (INM). INM נחקרה בעיקר ברשתית מתפתחת. כדי לבחון את הדינמיקה של INM ב מבוגר התחדשות רשתית דג זברה בפירוט, הדמית תא החי של גליה fluorescently שכותרתו מולר / ובתאים עצביים נדרשה. כאן, אנו מספקים את התנאים לבודדי רשתיות הגבו תרבותמ Tg [GFAP: nGFP] דג הזברה mi2004 שנחשפו אור חזק מתמיד במשך 35 שעות. כמו כן, אנו מראים כי בתרבויות רשתית אלה הם קיימא לבצע ניסויי הדמיה לחיות תאים, רכישה ברציפות Z- מחסנית תמונות ברחבי העובי של explant הרשתית עד 8 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton לפקח על התנהגות הנדידה של GFAP: nGFP תאי -positive . בנוסף, אנו מתארים את הפרטים לבצע ניתוח הדמיה פוסט כדי לקבוע את המהירות של INM apical ואת הבסיס. לסיכום, הקמנו תנאים כדי ללמוד את הדינמיקה של INM במודל בוגרת ההתחדשות הנוירונים. זה יקדם את הבנתנו בתהליך הסלולר המכריע הזה ולאפשר לנו לקבוע את המנגנונים השולטים INM.

Introduction

בניגוד לבני האדם, דג זברה (Danio rerio) תערוכת תגובת התחדשות חזקה על מוות של תאים של נוירונים ברשתית 1, 2, 3, 4. Α גורם גידול הנימק, מולקולת איתות כי הוא שוחרר מהמוות נוירונים ברשתית גורמת גליה מולר המתגוררת השכבה הפנימית גרעין הבסיס (INL) של הרשתית, להתרבות 5 ולייצר ובתאים עצבים ממשיכים להתרבות לפני ההבחנה לתוך התאים העצביים סוגים כי מת 2, 3, 4. בשלב השגשוג של תגובת ההתחדשות, הגרעינים של גליה מולר ו ובתאים העצביים הנגזרות מהם לעבור דפוס נודד חוזר בשלב עם מחזור התא (ההגירה הגרעינית Interkinetic, INM) 6 >, 7. גרעינים מיקומו של INL הבזליים לשכפל DNA שלהם לפני המעבר לשכבה החיצונית גרעיני (ONL) שבו הם מחלקים לפני הגרעינים הנובעים לחזור basally אל INL. תהליך זה תואר לראשונה במהלך התפתחות neuroepithelial בשיטות היסטולוגית, תוך גישות הדמית תא חי מאוחר יותר אשרו את הפרשנות על ידי סואר 8, 9, 10, 11, 12. שתי הגישות הדמיה histochemical ולחיות תאים שימשו כדי לקבוע המנגנונים INM ותפקודו בפיתוח neuroepithelia כולל הרשתית 9, 11, 12, 13. עם זאת, המנגנונים השולטים INM ב המבוגר התחדשות הרשתית לא נחקרו בפירוט רבXref "> 6, 7. הדמיה של תא חי תהיה גישה לא יסולא בפז כדי לקדם את הידע שלנו של מסלולי איתות השולטים INM ברשתית התחדשות מבוגר.

עד לאחרונה, הדמית תא החי של INM ברשתית הוגבלה או עוברי דג זברה לחיות או חומוס עוברי או עכבר לאחר לידת explants רשתית 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. בעוד explants רשתית מחיות בוגרת מגוון של מינים, כוללים עכבר, חולדת דג זברה כבר נוצל עבור תאים שונים גישות ביולוגיות 17, 18, 19, 20, ניסויי הדמיה לחיות תאים באמצעות חה explants הרשתיתve הוגבלה לתדרך את פרקי הזמן בהם ולא הוצאו להורג באופן רציף ולאורך כמה שעות 21, 22. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי רשתית דג זברה מבוגרת אור פגוע התרבות לבצע ניסויי הדמיה לחיות תאי INM ניטור באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון 6. גישות הדמיה תאים חיים הם יתרון על פני שיטות immunohistochemical כאשר חוקרים את מנגנוני השליטה INM, הדינמיקה של INM, למשל, מהירויות עלול להיפגע במקום המיקום של מיטוזה, אשר באופן פוטנציאלי לא יהיה מזוהה באמצעות immunocytochemistry.

בעתיד, בשיטה זו יש גם פוטנציאל להיות שונה כדי לחקור תהליכים דינמיים אחרים במהלך רגנרציה רשתית, כגון phagocytosis למות קולטני האור על ידי גליה מולר או התנהגות של שריר כלשהו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: דג הזברה הועלו ומתוחזק במתקן דג הזברה נוטרדאם במרכז מדעי החיים פריימן. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מאושרים על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים נוטרדאם ועדת שימוש ונמצאים עמידה הצהרה לשימוש בבעלי חיים למחקר חזון ידי האגודה לחקר חזון עיניים.

1. פתרונות

  1. כן אתנול 70% לעקר את מכסה המנוע בתרבית רקמה וכל ציוד / חומרים כימיים המועברים לתוך מכסה המנוע בתרבית הרקמה.
  2. הוסף 2 מ"ל של 2-phenoxyethanol עד 1 ליטר של מים מערכת (1: 500 2-phenoxyethanol).
  3. הכן 0.1 מ"מ NaHCO 3, pH 8.0. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר נקבוביות בגודל כדי לעקר את הפתרון במנדף בתרבית רקמה מעוקרים.
    הערה: 3 NaHCO משמש להפיץ את דבק תאים ורקמות ביעילות על פני השטח coverslip של fluorodishes (ראהצעד 3.2).
  4. כן 1.0 M CaCl 2 ו 1.0 M MgCl 2. לעקר עם מזרק 10 מיליליטר ו 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק נקבובי בגודל במנדף בתרבית רקמה מעוקר.
  5. כדי להכין Hank's מאוזן מלח פתרון (HBSS), להוסיף סטרילי CaCl 2 וסטרילי MgCl 2 עד 1x HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2+, ללא פנול אדום בריכוז סופי של 1 מ"מ כל אחד. עבודה בסביבה סטרילית.
  6. כדי להכין מדיום תרבות, לערבב 50% 1x המינימום ההכרחי בינוני (MEM) ללא פנול אדום, 25% HBSS המכיל CaCl 2 ו MgCl 2 (ראה סעיף 1.4), 25% סוס סרום (HS), 10 יחידות / פניצילין מ"ל, ו -10 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל. עבודה בסביבה סטרילית.
    הערה: הימנע בינוני המכיל פנול אדום כפי שהוא autofluoresces, ובכך להשפיע אות יחס רעש. 23
  7. הכן 10 מ"ל של נקודת התכה נמוכה agarose 1% ב 1x MEM ללא פנול אדום. ממיסים agarose / 1x MEM באמצעות למיקרוגליםave. כן בנפחים קטנים של agarose (למשל, 10 מיליליטר) כמו reheating החוזרת ישתנה ריכוזי יון עקב התאדות נוזלת.
  8. לפני culturing, לעקר צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ידי מעוקר.

פרדיגמה אור-נזק 2.

  1. הסתגלות כהה
    1. מניחים 2 - 3 Tg [GFAP: nGFP] דג הזברה mi2004 (או דג הזברה מהונדס אחרים בעלי עניין) בשעה 6 - 14 חודשים של גיל לתוך סביבה נטולת אור במשך 14 ד. לפרטים נוספים ראה התייחסות 2, 6, 24, 25.
  2. מקם את המכל המכיל 2 - 3 דג זברה מהונדסת מותאם כהה במי מערכת בין שתי מנורות פלורסנט אשר פולטות אור של 2,800 לוקס 2, 6, 24, 25. לחשוף דג זברה לאור מתמיד אינטנסיבי במשך 35 שעות. במהלך החשיפה לאור, להבטיח כי טמפרטורת המים נשמרת בין 31 - 33 ° C.

3. הכנה עבור Culturing (ביום של בידוד רשתית)

  1. באמצעות אתנול 70%, לעקר את מכסה המנוע בתרבית רקמה ואת הרכיבים / כלים מועברים לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה (למשל, צלוחיות המכילות MEM ו HBSS, טפטפות, טיפים פיפטה סטרילית, וכו.).
  2. הכנת fluorodishes
    1. Fluorodish המעייל אחד לכל רשתית עם תא דבק רקמות (ראה טבלה של חומרים).
    2. לדלל את הדבק תאים ורקמות של 0.1 מ"מ NaHCO 3 לריכוז סופי של 70 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 50 μL לכל fluorodish ולהפיץ את הפתרון על פני במרכז fluorodish עם קצה פיפטה 200 μL (כ 1 - 1.2 ס"מ קוטר ).
    3. דגירה fluorodishes מצופה 1 - 3 שעות ב RT; (לחילופין, דגירה O / N ב 4 ° C).
    4. הסר את הפתרון ולשטוף 3x עם 500 μL של 1x MEM עבור כל שטיפה. כדי למנוע את fluorodishes מצופה מהתייבשות, לשמור אותם MEM עד explants הרשתית הם רכובים.
  3. כן בינוני תרבות כמתואר בשלב 1.6. בינוני התרבות ניתן לאחסן עד 1 שבוע ב 4 ° C.

בידוד 4. Culturing של Explants רשתית

הערה: פרוטוקול המפורטים להלן עבור בידוד של הרשתית הגבי, שבו הוא האזור ברשתית כי הוא lesioned בעיקר על ידי הפרדיגמה אור הנזק המתואר. לכן, התפשטות-induced נזק והאירוע הקשורים ההגירה גרעיני interkinetic להתרחש ברשתית הגב. עם זאת, הליך הבידוד ניתן להתאים להניב אזורים ברשתית בהתאם לדרישות הספציפיות של השאלה החוקרת / מחקר.

  1. להרדים אחד דג זברה מהונדס אור פגוםזמן ת"א 1: 500 2-phenoxyethanol.
  2. הסר MEM מ fluorodish אחד עם טפטפת 1,000 μL כך שכבה דקה בלבד של שרידי נוזל.
  3. מעביר את דג הזברה על מגבת נייר יבשה, להסיר את העין עם זוג מעוגל של מלקחי דומון (מלקחיים # 5, 45 ° זווית) ולהעביר אותו על fluorodish.
  4. שימוש סטראו, כוון את העין עם התלמיד על להחליק את המכסה של fluorodish כך שהחלק האחורי של העין עם עצב הראייה גלוי (איור 1D).
  5. עם זוג מספריים מקפרסון-Vannas להסיר את עצב הראייה, חיתוך קרוב לחלק האחורי של העין. בנוסף, להסיר רקמת חיבור רירי החיצונית של העין.
  6. החזק את העין בין האף שלה ואת הצד זמני עם זוג # 5 מלקחיים תוך ביצוע חתך בבית הגבעול האופטי על ידי פירסינג עם להב מספריים אחד דרך cribrosa lamina והחיתוך לאורך שני אף צדדים זמניים של העין (ראה האיור 1E , li מפולחיםne).
  7. באמצעות שני זוגות # 5 מלקחיים, אחד מחזיק את הצד הגבי של הרשתית ואת הזוג השני להפריד את הגחון מהרשתית הגבה, למשוך את הרקמות.
    הערה: רצוי לכוון את הרשתית הגבה כך שהעדשה ואת שכבת תא גנגליון להתמודד עם coverslip בעוד בלובן העין פונה מעלה.
  8. הסר את בלובן העין מהרשתית הגב עם זוג אחד של # 5 מלקחיים, תוך כדי לחיצה על עדשה מחוברת הרשתית עם זוג נוסף של # 5 מלקחיים (איור 1H, I).
  9. כדי להסיר את העדשה, להשתמש במספרי מקפרסון-Vannas לחתוך מאחורי העדשה ללא פגיעה ברשתית (איור 1 ט, י). לפעמים, העדשה מפרידה בשלב 4.7. במקרה זה, הסר את בלובן העין בזהירות עם מלקחיים על ידי החזקת הרשתית בכל קצה לחתוך עם זוג נוסף של מלקחיים 5 #.
  10. הסר את הזגוגית תוך הסרת העדשה ללא פגיעה ברשתית. שטחו את הרשתית עם שכבת תא גנגליון מול להחליק את המכסה של fluorodish (איור 1 ליטר, ז).
  11. הקף הרשתית עם 10 μL של נקודת התכה נמוכה agarose 1% ולתת לחזק את agarose.
  12. Watch כי agarose הנוזל אינו להרים את הרשתית כמו גם מעלה קל עלול להשפיע על היכולת להתמקד עמוק לתוך הרקמה. אם הרמת הוא ציין, להשתמש פיפטה להסיר agarose. תן סט agarose שיורית לפני שתנסה להוסיף יותר.
  13. 4.12 כמה פעמים חזור על שלב לפני הוספת 1% התכה נמוכה נקודות agarose לכיסוי fluorodish כולו. לאחר agarose יש הקרושה, להוסיף 1.5 מדיום תרבות מ"ל.
  14. שמירה על תרבות explant הרשתית בסביבת 5% CO 2 / אוויר הקבוע ל 32 מעלות צלזיוס למשך כ 12 שעות כדי לאפשר הרשתית להתאושש מן הלחץ שנגרם הליך הבידוד. כוונו את הטמפרטורה ל -32 מעלות צלזיוס לשמור הרשתיות באותה טמפרטורה כמו דג הזברה אור שטופלו (ראה שלב 2.3).

5. מיקרוסקופיה multiphoton

s = "jove_content"> הערה: הניסויים שבוצעו בכתב היד הזה היו אופטימיזציה עבור מיקרוסקופ multiphoton מצויד לייזר אינפרא אדום (ראו טבלה של חומרים), טבילה אובייקטיבי מים למרחקים ארוכים 40X Apo (NA 1.15), סורק גלונומטר ו בתא סביבתי המכיל אינסרט במשך ארבע 35 מ"מ צלחות פטרי. התמונות נרכשו עם גלאים הלא descanned (R-NDD).

  1. לפני הדמיה, לאזן את בתא סביבתי להשיג אווירה 5% CO 2 / אוויר. ודא כי כלים ריקים פטרי מוכנסים לתוך מחזיק כדי למנוע דליפה של גז אל תוך החדר.
  2. הפעל את מערכת מיקרוסקופיה.
  3. לאחר בתא הסביבתי הוא equilibrated, להוסיף נוזל מקדם שבירה על מטרת טבילה במים למרחקים ארוכים 40X Apo (NA 1.15).
    הערה: הנוזל מקדם השבירה עם תכונות אופטיות דומה למים משמש כדי למנוע אידוי של מים במהלך ההדמיה לטווח ארוך.
  4. שפעת מקוםorodishes עם explants רשתית לתוך התא. באמצעות אור brightfield, מקם את הדגימה לתוך נתיב האור ולהביא את midregion של הרשתית הגבה לתוך המטוס של מוקד.
  5. השתמש אור GFP epifluorescent להתמקד GFAP: nGFP -positive גרעינים גליה מולר (איור 2 א, ג).
    הערה: אם explants הם לא מקובעים שטוח או שנצברו agarose תחת explant, זה יהיה קשה להתמקד על GFAP: nGFP -positive גרעינים או שהם יהיו לזרוח באור עמום.
    1. בדקו אם לעבור לאזור אחר בתוך אותו explant הרשתית תצליח להתגבר על בעית ההתמקדות. אחרת לעבור explant רשתית שונה.
  6. בתוכנה רכישת התמונה, פתח את 'GUI MP A1', את 'TiPad', את 'GUI קומפקט A1' והחלונות 'ND הרכישה ". עבור הדמיה multiphoton, ודא שהאפשרות 'IR NDD "נבחר ב" GUI קומפקט A1.
  7. בשנות ה settinשדה 'ז, בחר IR-DM עבור המראה dichroic -1 ולבחור את מסנן מעביר פס 525/50 לרכוש GFP הקרינה.
  8. הפעילו את לייזר IR בחלון שכותרתו 'A1MP GUI'. זה ייקח כמה דקות עבור לייזר כדי להיות מוכנים. קבע את אורך הגל עד 910 ננומטר לרגש GFP הקרינה וליישר את הלייזר על ידי לחיצה על כפתור "Auto יישור 'בחלון' A1 MP GUI '.
  9. ודא כי אורות בחדר וציוד כבויים או מכוסים לפני פתיחת התריס ב 'GUI MP A1 "כדי להימנע מחשיפת יתר של הצינור המכפיל. כדי להפחית את רמות הרעש, לשכן המיקרוסקופ בסביבה חשוכה.
  10. לרכוש תמונות של שדה הראייה של 300 x 300 פיקסלים, בכל הזום של שני, ועת הדירה פיקסל של 4.8 מיקרו-שניות / פיקסל. בערך להגדיר את כוח לייזר על ידי שינוי 'באזור רכישת' ב 'GUI A1MP' ורווח בחלון 'GUI קומפקט A1.
  11. הגדרת Z- מחסנית
    1. דגש על שכבת תא גנגליון להגדיר את מישור המוקד העליון של מחסנית z ב 'z'-subwindow בתוך "חלון ND הרכישה". חלק GFAP: תאי -positive nGFP בדרך כלל ממוקמים בשכבת תא גנגליון, אשר מסייעת לזהות את מגבלת הבסיס של הרשתית (איור 2 א, ד).
    2. הזז את המטוס מוקד דרך הרמה של ONL (איור 2 א ', ב'), אשר מאופיין על ידי הנוכחות של GFAP שכותרתו במעומעם: תאי -positive nGFP כי ביחס עגול מוגדל כדי עמיתיהם INL (איור 2 א, ג) .
    3. הגדר את המטוס הזה כמו החלק התחתון של Z- מחסנית. ודא כי ONL כולו יהיה צלם (איור 2 א ', ב').
    4. כאשר חווים מוקדי משמרות המטוס שדורשים מחדש התאמת בתקופת הדמיה, לחץ פעמיים על המיקום הבינוני subwindow 'z' כדי להקצות אותו כעמדה "הביתה". שינוי ל 'במצב סימטרי מוגדר'ולחץ "יחסים".
    5. הגדרת גודל z-צעד בין 0.7 כדי 1 מיקרומטר.
  12. תיקון Z בעצימות:
    1. החל תיקונים z בעצימות כדי לפצות על אובדן של עוצמת פיקסל בשל פיזור אור כאשר הדמיה בשכבות העמוקות של רקמות.
    2. כדי להגדיר את התיקון, לפתוח את החלון 'Z-עוצמת תיקון'. כדי להגדיר את 'טווח Z- מחסנית', בחר 'מאת ND'.
    3. הקישו על המטוס התחתון מוקדי בחלון 'Z-עוצמת התיקון "(במקרה זה, תואמת את שכבת תא גנגליון) ולהגדיר את עוצמת הלייזר (" אזור הרכישה' ב 'GUI A1MP') ורווח (GUI קומפקט A1 ).
    4. לחץ על החץ שליד 'ערכי z-' בחלון 'Z-עוצמת התיקון "כדי לאשר את ההגדרות לאחר מכן מוצגות תחת' הגדרות מכשיר 'בחלון' Z-עוצמת התיקון" עבור המטוס שנבחר המוקדים.
    5. חזור על התהליך עבור האמצעמטוסים העליון nd, הגדלת כוח ורווח לייזר. ניתן להוסיף מטוסים מוקד נוסף במידת הצורך. ראה טבלה מס '1 עבור הגדרות לייזר ורווח ספציפיים לניסויים איורים 2 - 4.
    6. הגדר את 'אזור הרכישה' בחלון 'GUI MP A1. הימנע בחירת שטח רכישה גדול מ -15 ונרשם רווח גבוה יותר מאשר 126 בתחילת ההדמיה לעקוף photobleaching וגדילת רמות רעש.
      הערה: ככל לייזרי צינורות מכפילים שונים בין מערכות מיקרוסקופיה, ליזר מבחן והגדרות רווח כדי להשיג תנאי הדמיה אופטימליים עבור מיקרוסקופ להגדיר תוך הימנעות photobleaching.
    7. בחר 'תיקון עצמה יחסי' בחלון 'Z-עוצמת התיקון'.
  13. בשנות ה subwindow 'סדרות עתיות' בחלון 'ND רכישת', לקביעת משך 8 שעות ואת המרווח ל 'ללא דיחוי'. לאחר מכן, הקפד ללחוץ על 'Z-תיקון הפעל' ב t"Z- מחסנית" הוא חלון משנה על הכפתור בחלון 'ND רכישת' לרכוש את סדרות עתיות 3-D.
  14. שמור explants רשתית בטמפרטורה של 27 - 29 מעלות צלזיוס לאורך כל תקופת רכישה של תמונה.
  15. במשך כל תקופת רכישת התמונה, במידת הצורך, להתאים מחדש את רמת כוח ורווח על מנת לשמור על איכות תמונה לניתוח שלאחר הדמיה. לקבלת התאמות לבצע שלבים 5.11.2 - 5.11.4.
  16. אם משמרות מישור המוקד, להשהות או להפסיק את הריצה ולבצע צעד 5.11 שוב.
    הערה: אם 'ביחס z-תיקון' נבחר בשלב 5.12.7 ו 5.11.4 צעד בוצע זה לא אמור להיות צורך להתאים מחדש רמות כוח והרווח, אלא אם photobleaching הנרחב התרחש.

6. ניתוח של מהירות

  1. חלץ את הזמן, הגדרת "אזור של אינטרס 'על התמונה. השתמש בכלי 'זמן המדידה' ולייצא את ערכי הזמן לגיליון אלקטרוני.
  2. חיתוך באזור המכיל dividing GFAP: גרעין -positive nGFP.
  3. בחר את האזור החתוך כך שהוא מכיל לפחות גרעין אחד אינו עובר INM כדי להגדיר נקודת התייחסות לאחר מכן למדוד את המרחקים כי הגרעין המפריד הגר ביחס INL הבזליים. הערה: כדי לבחור הגרעין שנשאר INL בסיס, הוא עוזר להכין שחזור 3-D של סדרות עתיות.
  4. לחלופין, אם GFAP: תא -positive nGFP הוא ציין ONL לאורך כל תקופת הרכישה, להשתמש בקו אנכי באורך קבוע פורש מהגרעין ONL אל INL הבסיס כדי לזהות נקודת התייחסות.
  5. באמצעות הפונקציה "להראות פרוסות נוף ', ליצור תחזיות מאונכות. בהמשך לכך, לשנות את מצב מ 'פרוסה' ל 'הקרנת העוצמה המקסימלית.
  6. להשבית את תצוגת 'XY' של הקרנת מקסימלית המאונכת. בהתאם לכיוון שבו גרעין הנודדות / חלוקת גלוי טוב,הסימפונית לכבות גם את 'xz'- או' yz'-נוף.
  7. לחץ על התמונה הנותרים עם הכפתור הימני של העכבר ולחלץ את סדרת דימוי yz' עם '' XZ 'או מסמך חדש צור מעין זו'. במידת הצורך, לסובב את התמונה.
  8. שימוש בפונקציה 'המדידה ידנית', למתוח קו אופקי על פני התמונה ברמה התחתונה של הגרעין שנשאר INL הבסיס, ואינו עובר INM (= נקודת התייחסות; איור 4 א - E, קו אופקי אדום).
  9. למדוד את המרחק בין קו ההפניה ואת נקודת הבסיס של הגרעין הנודד עבור הסדרות עתיות שימוש באפשרות 'קו המדידה' בתוכנת הניתוח (ראה איור 4 א - ה).
  10. לאחר מעטפת הגרעין מתפרקת, למדוד את מיקום הבסיס של סומה אם הוא בא, המאפשר זיהוי דיפוזיה של GFP לתוך התא כולו.
  11. באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני, העלילה מרחוק נוcleus היגרו נגד הזמן חלף (איור 4F).
    1. כדי לקבוע את מהירות העברת הפסגה (נ א), גרף המרחקים נסעו לתקופה לפני התמוטטות מעטפת הגרעין מתרחשת (איור 4G).
    2. בחר בסדרת הנתונים בתוך התרשים, לחץ לחיצה ימנית על העכבר וכנס עקום רגרסיה ליניארית כולל 'y = mx + ג' הפונקציה המתאימה. השיפוע 'm' בפונקציה מייצג את המהירות, נ א (איור 4G).
    3. חזור על שלבי 6.11.1 ו 6.11.2 עבור השלב הראשון של גירת הבזליים מהירה כדי לקבוע את מהירות העברת הבסיס, ב נ (איור 4H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הבידוד של הרשתית על פי ההליך המתואר ב סכמטית באיור 1 מאפשר culturing של הרשתית הגבי בברוטליות ממבוגר אור פגועי Tg [GFAP: nGFP] דג הזברה mi2004 על פני תקופה של 24 שעות לפחות ב 5% CO סביבת 2 / אוויר. שטוח הרכוב אלה explants הרשתית ניתן להשתמש כדי מטוסי מוקדי תמונה ברמות רקמות עמוקות. דוגמה לכך היא גליה מולר / גרעיני תאים ובתאים עצביים שכותרתו עם GFP מן GFAP אמרגן גליה ספציפית מולר (גליה fibrillary החלבון חומצי) כי ממוקם ONL במהלך מיטוזה ברשתית האור פגומה (האיורים 2A - D, 3). כדי להמשיך לאשר כי גישה זו ישימה תמונת שכבות תאים ברשתית השונה, בחריפות explants רשתית המבודדת הוכנה מ ניזוק Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 עיני דג זברת מבטאי EGFP ב photoreceptors מוט תחתpromotor לרודופסין. 2E איור - H מראה שזה אפשרי לרכוש תמונות של קולטי אור מוט GFP חיובי והקטעים הפנימיים שלהם. כמגזרים פנימיים מוט להאריך בין קולטני אור קונוס כלפי אפיתל הפיגמנט ברשתית, נתונים אלה ירמזו שזה גם אפשרי כדי קולטני אור חרוט תמונה. זה היה אולם לא לבחון אותה.

לאחר גליה מולר ציינו / גרעיני תאים ובתאים עצביים ONL ברשתית האור פגום, אפיינו התנהגות הנדידה שלהם בפירוט (איור 3 ו סרט 1). מולר גליה / עצבי גרעיני תאים ובתאים שכותרתו ידי GFP להעביר דו-כיוונית בין עמדת הבסיס של INL שם הם בדרך כלל מתגוררים ואת ONL, האתר של אובדן קולטי אור. בדרך כלל, GFAP: גרעינים -positive nGFP היגרו במרחק קצר של INL (איור 3 א - ג) לפני שהם עברופירוט מעטפת הגרעין, תוך מיקומו של INL, מבוסס על חלוקה מחדש של GFP לתוך הציטופלסמה של התא מולר גליה / העצבית ובתאים כולה (איור 3D). בעקבות חלוקת התא בתוך ONL, שני GFAP: גרעינים -positive nGFP הפך גלוי ONL (איור 3F, G) כי חזר INL הבזליים (3H איור - J). לאחר חלוקת התא, הגרעינים לעלות ושהיה היו בתחילה מאוד עמום ולכן קשה לזהות (איור 3G). עם זאת, בתוך מסגרת אחת כדי שהשניים הספיקו לאחר מיטוזה, GFP קרינה גרעינית הפכה בהירה, מה שאפשר ההדמיה של הגירה גרעינית (האיור 3H - J). הדמית תא חי גם מותר להדמיה של המטוס החלוק (האיור 3F, G), אשר התרחש אופקי כדי למשטח הפסגה של הרשתית עבור התא שמוצג באיור 3. זה גם אפשרי להשתמש קווי דג זברה מהונדסים אחרים כגוןכמו Tg [GFAP: EGFP] דג הזברה nt11 המבטאים GFP בציטופלסמה (מידע לא מוצג). למרות שניתן לקבוע התנועה הפסגה באמינות חלוקות תא אופקי, היא לעתים קרובות קשה בדיוק לזהות את המיקום של גרעינים הבת נודדות basally ו חלוקות תא אנכי Tg [GFAP: EGFP] nt11 דג הזברה הרשתית (מידע לא מוצג).

כדי לקבוע את המהירות, GFAP: גרעין -positive nGFP שלא הועבר לאורך כל תקופת ההקלטה נבחר כנקודת התייחסות (כוכב, איור 4 א - ה). המרחק של הגרעין הנודד (קו אדום אנכי, איור 4 א - ה) נקבע ביחס GFAP ההפניה: גרעין -positive nGFP (קו אדום אופקי, איור 4 א - ה) בכל timepoint של סדרת התמונה על XZ המרבי או YZ-תחזיות (תלוי בו זווית הגרעינים יכולים להיות visualized באופן היעיל ביותר). המרחק כי הגרעין הגר היה להתוות נגד הזמן בגיליון אלקטרוני (האיור 4F - H). פירוט קרום גרעין לעתים קרובות נצפה בגרף כתנועת basalward ראשונית בשל החלוקה מחדש של GFP בתוך התא כולו (לרוב בסיס של גוף התא במקרה זה). מהירויות הפסגה נקבעו שקדמו להתמוטטות מעטפת גרעין, התאמה עקומה רגרסיה ליניארית (קו מקווקו אפור, איור 4G) למרחק זמם נגד הזמן לתקופה לפני התמוטטות מעטפת גרעין (היהלום אדום, איור 4G). השיפוע 'm' של עקומת רגרסיה ליניארית (y = mx + ג) מייצג את מהירות 'DX / dt'. מהירויות הפסגה עבור התא מוצג באיור 4 היו 10.89 מיקרומטר / h. אותה גישה יושמה לחשב את המהירות של תנועת הבסיס המהירה הראשונית (נ ב) של גרעינים הבת שהוקמה זה עתה (איור 4F, H). המלון של לינה נ הגירה מהירויות הבסיס של -67.71 ו 33.51 מיקרומטר / h של לתאי הבת D1 ו- D2, בהתאמה, היו מהירים יותר comparably מאשר מהירות הפסגה. למרבה הצער, לא ניתן היה לקבוע את מהירות הפסגה לאחר התמוטטות מעטפת גרעין כמו GFP מתפזרת ברחבי התא כולו. במקום זאת, המהירות הרגעית חושבה בהתבסס על העיתוי והמיקום של הגרעין שקדם להתמוטטות מעטפת גרעין והדמיון המודרך הראשון של גרעינים הבת שהוקמו זה עתה. המהירות הרגעית של 7.9 מיקרומטר / h עבור התא שמוצג באיור 4 צפויה אומדן חסר כמו הכרומטין מגיע ONL לפני telophase של מיטוזה, כאשר הגרעינים הבת להיות גלויים.

לסיכום, תרבות explants רשתית מאפשרת הדמיה לחיות תאים של INM ב מבוגר התחדשות רשתית דג זברה וקביעת חלוקת גירת תא parameters של גרעינים בודדים.

איור 1
איור 1: נוהל בידוד רשתית. א) סכמטי המדגים ראש דג זברה עם העין שלה. B) העין יוסר דג הזברה אוריינטציה להראות את החלק הקדמי של העין עם התלמיד. C) סובבתי את העין 180 ° כך שהחלק האחורי של העין עם הגבעול האופטי (העיגול שחור מלא) הופך לגלוי (D) ואת התלמיד פונה כלפי מטה. הצבע האפור מעיד על קיומו של בלובן העין של העין. ה) אחת להב של זוג המספרי מקפרסון-Vannas מוכנסת לתוך הגבעול האופטי של העין (העיגול שחור מלא) כדי לחתוך אותו לתוך הגב שלה ואת צדדי גחון אשר מסומן על ידי קו המקוטע הלבן. F) חצי הגבי של העין שרק השופט לסיום המחצית הגחון הוסר. חצי העיגול השחור מורה tהוא חלק השיורית של הגבעול האופטי. G) סובבו את העין 90 ° אחורה כדי לחשוף (H) בחלק הפנימי של העין עם הרשתית (חום), זגוגי (לא מוצג) ואת העדשה (L, עיגול אפור בהיר) כי הוא עטוף עדיין על ידי בלובן העין (הקו האפור ). I) בלובן העין היה מנותק (שימו לב, קו אפור חסר) ו- J) העדשה זגוגי הוסרו והוליד רק הרשתית (חום). K) רשתית פנתה 90 ° קדימה והוליד נוף שטוח הר של הרשתית הגבה (L). M) הגבה רשתית explant שטוח רכוב על fluorodish זכוכית תחתונה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: 3-D שחזוררשתית multiphoton Z- ערימות. א) שחזור 3-D של סדרה התמונה multiphoton Z- מחסנית של GFAP: nGFP- תאים חיוביים בתרבויות ברשתית כל הר מן דג הזברה לאחר 48 שעות של נזק קל. B - D) יחיד multiphoton XY-תמונות של GFAP: תאים -positive nGFP המוצג-שחזור 3D ב (א) ברמה של ONL (ב), INL (C), אשר תואמת את השכבה המכילה מולר סומה גליה ואת GCL (D). החץ (B) מצביע על גליה מולר בסיבוב שהורחבה ONL לאחר התמוטטות מעטפת הגרעין. E) שיחזור 3-D של סדרה התמונה Z- מחסנית multiphoton של explant רשתית מתוך Tg ניזוק [rho: Eco.NfsB-EGFP] דג הזברה nt19. F - H) xy-תמונות multiphoton היחיד ברמה של המגזרים הפנימיים המוט (RIS, F), שכבת גרעין מוט (Gו) ברמה של הרשתית הפנימית (H). GCL, שכבת תא גנגליון; INL, שכבת הגרעין הפנימית; ONL, שכבת הגרעין החיצונית; RIS, מגזר Inner רוד. בר סולם ב A, D, E ו- H, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: סדרה תמונה בהילוך איטי של INM. א '- י') סדרת תמונה של 3D-מחדש של סדרת timelapse Z- מחסנית מוצגות Tg [GFAP: nGFP] mi2004 גרעינים -positive שעוברים INM לחלק את ONL ב explants הרשתית (בשורה העליונה). עמדת גרעין אחד apically נודד הגרעינים הבת שלה basally הנודדות מותווה על ידי חצים אדומים. כוכב אדום מציין פירוט מעטפת גרעין במהלך מיטוזה. A - J, בשורה התחתונה) אתסדרת תמונה זהה בשורה העליונה הייתה oversaturated וקצוצה להתמקד תאים המתחלקים ב ONL. INL, שכבת הגרעין הפנימית; IPL, שכבת Plexiform הפנימית; ONL, שכבת הגרעין החיצונית. בר סולם ב A, מיקרומטר 10 והיא זהה עבור B - ג'יי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: ניתוח של מהירויות הגירה apical ואת הבסיס. א '- ה') מקסימום הקרנת YZ של סדרת תמונת Z- מחסנית של Tg [GFAP: nGFP] mi2004 explants רשתית timepoints השונה של הקלטת timelapse נרכשה על ידי מיקרוסקופיה רב פוטון. באמצעות כלי הקו תחת פונקצית 'המדידה ידנית', קו אופקי הוצב ברמה של תא ההתייחסות, שמסומנת על ידי כוכב. לי אנכיקו asurement הוצב החל משעת הקו האופקי והאריך לעמדת הבסיס של GFAP הנודדת: גרעין -positive nGFP. אורכו של קו המדידה ניתן בתיבות הלבנות על תמונות ועל קריאות תחת התמונות. L1 = אורך שבת התא 1 הגר; L2 = אורך שבת תא 2 הגר. F) מרחק שהתא (F0) נמדד (א - ה) היגרו apically וכי לתאי הבת הנובעים D1 ו- D2 היגרו basally בהקלטה timelapse multiphoton. הקו האדום מציין את המידות שבו מהירות הגירה הפסגה (נ א) חושבה ואילו קווים שחורים האפורים מציינים את המידות המשמשות לחישוב מהירויות הגירה הבזליים (נ ב) עבור D1 ו- D2, בהתאמה. G, H) המרחק היה להתוות נגד הזמן ב- Excel for גירת פסגה שקדמו להתמוטטות מעטפת גרעין (G) ואת השלב של בסיס מהירהגירה לבת בתא D1 (H). עקומות רגרסיה לינארית צוידו והפונקציות ניתנים להלן בתרשימים את המדרון המייצג את המהירות. INL, שכבת הגרעין הפנימית; IPL, שכבת Plexiform פנימית; ONL, שכבת הגרעין החיצונית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Tg [GFAP: EGFP] nt11 Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19
כוח לייזר לְהַשִׂיג כוח לייזר לְהַשִׂיג
למעלה (קולטי אור מוט) 13 126 3.5 118 תיכון (גליה מולר) 10 126 2.8 118
תחתית (GCL) 8 126 2.1 118

טבלה 1: ליזר רמות רווח משמשות Z-Intensity תיקונים בבית המישורים השונים לניסויים הוצגו איורים 2 - 4.

איור 2
סרט 1: דימות תאי חיים של רשתית Explants ידי multiphoton מיקרוסקופי. (קליק ימני להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים חוקרים את המנגנונים השולטים התחדשות של המבוגר הפגום רשתית דג זברה בעיקר שיטות immunocytochemical משומשות 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. קביעת תנאים כדי explants תרבות ברשתית לבצע הדמיה תא חי על תופעות, כגון INM, לספק לנו טכניקה להשיג לעומק מרחבית מידע הזמני. טכניקה זו מאפשרת קביעת מהירויות ההגירה, העיתוי והמיקום של התמוטטות מעטפת גרעין במהלך prophase של מיטוזה והאורך ומיקום של חלוקת תא. יתר על כן, אפשר להקים את מטוס חלוקה ואת הגורל לתאי בת שנוצרו התייחס לבעיית המיקום הבא שלהם. בסופו של דבר, גישה חזקה זו תקבע אם M2; ller גליה ובתאים עצביים מתנהגים באופן שונה בכל הנוגע INM במהלך רגנרציה רשתית. שימוש קווי דג זברה מהונדסים, כי לזהות תאים מתרבים ברשתית ההתחדשות ב שלבים שונים של תגובת ההתחדשות יסייע בפענוח הפרש התנהגות 6. במקרה של מיקרוסקופ multiphoton משמש כאן, קווי דג הזברה כתב ה- GFP עדיפים כמו עירור של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) אינה יעילה מאוד; עם זאת, מערכות multiphoton אחרות עשויות לאפשר עירור יעיל של RFP או fluorophores המקבילה.

אחד השלבים הקריטיים ביותר בהליך בידוד הרשתית גובר של הרשתית. רשתיות צריכות להיות מותקנות שטוח ככל האפשר עבור אור multiphoton להיות מסוגל להעביר הלאה את הרמות-z העמוקים יותר של ONL. מתעקל של הרשתית במיוחד באזור השולי, זגוגי שיורית, ו / או הצטברות של agarose תחת התרבות ברשתית, אשר ממשמשת כדי לשתק אתרקמות, לרוב מציגות שטח נוסף בין להחליק את המכסה ואת תרבות הרשתית. בנוסף, כוח הליזר מוגבר ועלייה צריכות לשמש כדי לרכוש תמונות אם הרשתית אינה שטוחה וזה וכתוצאה מכך יגרום photobleaching מוגברת כדאיות מופחתת של התרבות ברשתית. הרכבה שגויה לעתים קרובות גם תוצאות איכות תמונה עניה עקב חדירת אור מופחתת תשפיע על היכולת למדוד את המרחקים כי גרעינים נדדו ולכן בחישוב מירויות הגירה.

מהירויות של הגירה הפסגה שקדמו להתמוטטות מעטפת הגרעין ושל הגירה הבזליים ניתן לקבוע באופן מהימן בסדרה תמונה מתוך Tg [GFAP: nGFP] mi2004 explants רשתית דג הזברה. עם זאת, בשלב זה לא ניתן לקבוע את המהירות של הגירה הפסגה של הכרומטין לאחר התמוטטות מעטפת הגרעין בתור דג הזברה מהונדס זה כמו GFP מקצה מחדש בכל הציטופלסמה כולה. Labeling של explants רשתית עם הצבע הגרעיני Hoechst הביא ספיגה עמומה לתוך גרעיני גליה מולר כי נדרשו השינוי אורך גל 830 ננומטר (Lahne & הייד, נתונים שלא פורסמו), אשר השפיע על יכולת הקיום של הרקמה וגרם השתהות של מחזור התא ( Lahne & הייד, נתונים שלא פורסמו). במהלך התפתחות הרשתית, Tg [h2afva: h2afva-GFP] דג הזברה kca6 המבטאים GFP התמזגו היסטון 2 שימשו בהצלחה לפקח INM ולקבוע מהירויות הגירה בשלבים שונים של מחזור התא 12, 31. בעתיד, explants הרשתית מן Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 דג הזברה גם יאפשר הדמיה של הכרומטין לאורך כל מחזור התא ויאפשר ניתוח של מהירות הגירה הפסגה לאחר התמוטטות קרום הגרעין הבוגר התחדשות הרשתית דג הזברה.

לאחר שקבע את התנאים לפקח INM ידיLive- תא הדמיה ב explants רשתית מן דג זברה מבוגר אור שניזוק הניתוח המתאים של מהירויות תהווה את הבסיס כדי לחקור את המנגנונים שולט INM. מחקרים אחדים החלו לבדוק את מנגנוני INM ב מבוגר התחדשות רשתית באמצעות immunocytochemistry כדי לקבוע את המיקום של גרעיני 3 חיובי mitotic phospho-היסטון 6, 7. עם זאת, מפריע מסלולי איתות לא יכול לעבד את עמדת מיטוזה, אך עשוי להשפיע ופרמטרים נוספים כגון מהירות, עיתוי של מיטוזה וחלוקה כי לא תהיה אפשרי / קשה מאוד להבחין ידי immunocytochemistry. בעבר, זה היה מראה כי גרעיני mitotic phospho-היסטון 3 חיובי mislocalized לעמדות בסיס יותר ברשתית מתפתחות dynactin מוטנטים morphants 11. עם זאת, הדמיה לחיות תאים עוקבות גילתה כי הגירה גרעינית לפני חלוקת התא התעכבה בתא dynactin שנפרץs, בעוד מהירות הגירה הפסגה מוגברת מופעלת גרעינים להגיע וכדי לעבור חלוקת התא על פני השטח הפסגה 11, 12. דוגמה זו מדגימה את כוחו של הדמיה תא חי. באופן דומה, כאשר נפרמים המנגנונים המאפשרים INM ב מבוגר התחדשות רשתית דג זברה, בדיקות הדמיה לחיות תאים תשלמנה, ובמקרים שונים תהיה יתרון על פני, גישות immunocytochemical.

כפי שציינו קודם לכן, הדמיה תא חי מציעה יתרונות רבים על פני immunohistochemical / שיטות סטטיות; עם זאת, זה חייב להישמר לזכור כי explants הרשתית הוא מודל vivo לשעבר. ככזה, ניזק שנגרם להם במהלך הליך הבידוד ו / או תנאי תרבות עשויים להשפיע על תהליכים תאיים. בנוסף, הליך ההדמיה עצמו גורם להשפעות רעילות שעלולות להשפיע על התנהגות הסלולר 23, 32. אמנם יש disadvantages לחיות תאים הדמיה של תרבויות רשתית, הוא כרגע השיטה הטובה ביותר שלנו כדי לקבל מידע דינמי של INM. חשוב לציין כי הליך דימות תאים חיים של explants הרשתית זה יחול על שאלות ביולוגיות אחרות במהלך רגנרציה רשתית. בהתבסס על נתוני immunocytochemical, הוצע בעבר כי גליה מולר phagocytose גוססת קולטני אור / פסולת בעקבות ניזקי קולטי אור אור מושרה 33. התאמת הפרמטרים התמונה התהליך הזה לחיות יוודא אם phagocytosis של קולטני האור גוסס מתרחשת ברשתית דג הזברה התחדשות וניתן להשתמש בו כדי ללמוד את המנגנונים. לאחר הראה כי ניתן לרכוש תמונות ברמה של גרעיני מוט וקטעים פנימיים מוט Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] דג זברת nt19, זה צריך להיות אפשרי כדי להתאים את תנאי phagocytosis קולטי אור בתמונה. באופן דומה, ידע מוגבל לגבי ההתנהגות הדינמית של המיקרוגליה המנגנונים השולטים שלהםפונקציה המתנוונת ואת התחדשות רשתית 34, 35. ניצול דג הזברה מהונדס ספציפי microglia בשיתוף עם Live- תא הדמיה גם להגביר את ההבנה שלנו של הפונקציה של המיקרוגליאה המבוגר התחדשות הרשתית דג הזברה 36, 37. לסיכום, הדמיה תא חי של explants רשתית הוא כלי רב עוצמה כדי לקבל מידע דינמי של תהליכים תאיים ולקבוע את התנהגות ותפקוד של תאים מסוגים שונים ברשתית התחדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מעריכים את התמיכה שמספקת ויליאם ארצ'ר ואת מתקן ההדמיה המשולבת נוטרדאם. תודה מיוחדת מופנים הטכנאים מדעי החיים פריימן לעזרה רציפה שלהם וטיפול בבעלי שלהם של דג הזברה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי עין של NIH כדי DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) והמרכז דג הזברה מחקר, אוניברסיטת נוטרה דאם, נוטרה דאם, IN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 120 explant רשתית מיקרוסקופיה multiphoton הדמית תא חי דג זברה הגירה גרעינית interkinetic תרבות התחדשות גליה מולר מיטוזה מהירות
תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,… More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter