Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Summary

ومعظمها تم دراستها تجديد شبكية العين الزرد باستخدام شبكية العين الثابتة. ومع ذلك، والعمليات الحيوية مثل الهجرة النووية interkinetic تحدث خلال استجابة التجدد وتتطلب التصوير الخلية الحية للتحقيق في الآليات الكامنة. هنا، نحن تصف الظروف والثقافة وتصوير لمراقبة Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية) في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر multiphoton.

Abstract

يبدأ برنامج تجديد الذاتية من قبل مولر الدبقية في الزرد الكبار (دانيو rerio) الشبكية التالية تلف الخلايا العصبية والموت. مولر الدبقية إعادة إدخال دورة الخلية وتنتج الخلايا الاولية العصبية التي تخضع لجولات لاحقة من انقسامات الخلية والتمايز إلى أنواع الخلايا العصبية المفقودة. كل من مولر الدبقية والخلايا الاصلية العصبية نوى تكرار الحمض النووي وتخضع الانقسام في مواقع متميزة من شبكية العين، أي أنها تهاجر بين القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL)، وطبقة النووية الخارجي (ONL)، على التوالي، في عملية وصفت بأنها Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية). وقد الغالب درست الحركة الوطنية العراقية في شبكية العين النامية. لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين الزرد في التفاصيل، مطلوب التصوير الخلية الحية من مولر الدبقية الخلايا الاولية fluorescently المسمى / العصبية. هنا، ونحن توفير الظروف لعزل وشبكية العين الثقافة الظهريةمن تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد التي تعرضت للضوء الشديد المستمر لمدة 35 ساعة. وتبين لنا أيضا أن هذه الثقافات الشبكية هي قابلة للتطبيق لإجراء تجارب التصوير الخلية الحية، والحصول بشكل مستمر الصور ض المكدس في جميع أنحاء سمك يزدرع الشبكية لمدة تصل إلى 8 ساعات باستخدام المجهر multiphoton لمراقبة سلوك الهجرة من GFAP: خلايا -positive nGFP . وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تفاصيل لإجراء تحليل ما بعد التصوير لتحديد سرعة الحركة الوطنية العراقية قمي والقاعدية. لتلخيص، أنشأنا الظروف لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في نموذج الكبار من تجديد الخلايا العصبية. هذا وسوف تقدم فهمنا لهذه العملية الخلوية حاسمة وتسمح لنا لتحديد الآليات التي تتحكم في الحركة الوطنية العراقية.

Introduction

وخلافا للبشر، الزرد (دانيو rerio) تبدي استجابة التجدد قوية على موت الخلية في الخلايا العصبية للشبكية 1، 2، 3، 4. عامل نخر الورم α، وهو جزيء إشارة التي يتم تحريرها من الموت الخلايا العصبية للشبكية يدفع مولر الدبقية المقيمين في القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL) من شبكية العين، لتتكاثر 5 وإنتاج الخلايا الاولية العصبية التي لا تزال تتكاثر قبل التفريق في الخلية العصبية الأنواع التي توفي 2، 3، 4. خلال المرحلة التكاثري للاستجابة التجدد، نوى مولر الدبقية والمستمدة الخلايا الاولية العصبية التي تخضع لنمط الهجرة المتكرر في مرحلة مع دورة الخلية (Interkinetic الهجرة النووية، الحركة الوطنية العراقية) 6 > 7. نوى المتمركزة في INL القاعدية تكرار الحمض النووي قبل أن يهاجر إلى طبقة النووية الخارجي (ONL) حيث أنها تقسم قبل العودة نوى الناشئة باسالي إلى INL. وقد وصفت هذه العملية لأول مرة خلال تطوير الظهارية العصبية باستخدام أساليب النسيجية، فيما أكد النهج التصوير الخلية الحية في وقت لاحق تفسير سوير 8، 9، 10، 11، 12. وقد استخدمت كلا النهجين التصوير النسيجية والعيش خلية لتحديد الآليات الكامنة وراء الحركة الوطنية العراقية وظيفتها في تطوير neuroepithelia بما في شبكية العين 9، 11، 12، 13. ومع ذلك، فإن الآليات التي تحكم الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين لم تدرس في الكثير من التفاصيلسوف XREF "> 6 و 7. التصوير حية على خلية يكون نهجا لا تقدر بثمن للمضي قدما معرفتنا مسارات الإشارات التي تتحكم في الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين.

حتى وقت قريب، والتصوير الخلية الحية من الحركة الوطنية العراقية في شبكية العين كان محدودا إما الأجنة الزرد حية أو إلى كتكوت الجنينية أو الماوس بعد الولادة إإكسبلنتس الشبكية 9، 10، 11، 12، 14، 15، 16. في حين استخدمت إإكسبلنتس الشبكية من الحيوانات البالغة من مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الجرذان والفئران والزرد لخلية مختلفة النهج البيولوجية 17، 18، 19، 20، تجارب التصوير الخلية الحية باستخدام إإكسبلنتس الشبكية هكتارلقد تم يقتصر على اطلاع فترات من الزمن والتي لم يتم تنفيذها بشكل مستمر على مدى عدة ساعات 21 و 22. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لثقافة الكبار شبكية العين الزرد التي تضررت الضوء على أداء الخلية الحية التصوير تجارب مراقبة الحركة الوطنية العراقية باستخدام متعددة الفوتون المجهري 6. النهج التصوير الخلية الحية هي مفيدة على الطرق المناعية عند التحقيق في آليات السيطرة على الحركة الوطنية العراقية، وديناميات الحركة الوطنية العراقية، على سبيل المثال، قد تتأثر سرعات بدلا من موقع الانقسام، والتي من المحتمل أن لا يتم الكشف عن استخدام مناعية.

في المستقبل، وهذه الطريقة أيضا لديه القدرة على أن يتم تعديل لدراسة العمليات الحيوية الأخرى أثناء تجديد شبكية العين، مثل البلعمة الموت خلايا مستقبلة للضوء عن طريق مولر الدبقية أو سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: أثيرت الزرد والمحافظة عليها في مرفق نوتردام الزرد في مركز علوم الحياة في Freimann. تمت الموافقة على الطرق الموضحة في هذه المخطوطة من جامعة نوتردام رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وتكون في الامتثال لبيان لاستخدام الحيوانات في البحوث الرؤية من قبل جمعية البحوث في الرؤية والعيون.

1. حلول

  1. إعداد 70٪ من الإيثانول لتعقيم هود زراعة الأنسجة وأية معدات / الكواشف التي يتم نقلها إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
  2. إضافة 2 مل من 2 فينوكسييثانول إلى 1 لتر من الماء النظام (1: 500 2-فينوكسييثانول).
  3. إعداد 0.1 مم NaHCO 3، ودرجة الحموضة 8.0. استخدام 10 مل حقنة و 0.2 ميكرون تصفية-حجم المسام حقنة لتعقيم الحل في نسيج الثقافة هود تعقيمها.
    ملاحظة: NaHCO 3 يستخدم لنشر كفاءة الخلية والأنسجة لاصقة على سطح ساترة من fluorodishes (انظرالخطوة 3.2).
  4. تحضير 1.0 M CaCl 2 و 1.0 M MgCl 2. تعقيم مع حقنة 10 مل و 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية حقنة في نسيج الثقافة هود تعقيمها.
  5. لإعداد Hank's متوازن محلول الملح (HBSS)، إضافة العقيمة CaCl 2 ومعقمة MgCl 2 ل1X HBSS دون الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+، دون أحمر الفينول بتركيز نهائي من 1 ملم لكل منهما. العمل في بيئة معقمة.
  6. لإعداد مستنبت، مزيج 50٪ 1X الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) دون الفينول الأحمر، و 25٪ HBSS تحتوي على CaCl 2 و MgCl 2 (انظر القسم 1.4)، و 25٪ الحصان المصل (HS)، و 10 وحدة / مل البنسلين، و 10 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. العمل في بيئة معقمة.
    ملاحظة: تجنب المتوسط ​​تحتوي على الفينول الأحمر كما autofluoresces، مما يؤثر إشارة إلى نسب الضوضاء. 23
  7. إعداد 10 مل من 1٪ انصهار منخفضة الاغاروز نقطة في 1X MEM دون الفينول الأحمر. تذوب الاغاروز / 1X MEM باستخدام أفران الميكرافي. إعداد كميات صغيرة من الاغاروز (على سبيل المثال، 10 مل)، وإعادة تسخين المتكررة سوف يتغير تركيز أيون بسبب تبخر السوائل.
  8. قبل زراعة، وتعقيم 1.5 مل أنابيب microcentrifuge قبل التعقيم.

2. الضرر ضوء النموذج

  1. داكنة التكيف
    1. ضع 2-3 تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد (أو غيرها من الزرد المعدلة وراثيا من الفائدة) في 6-14 شهرا من العمر في بيئة خالية من ضوء لمدة 14 د. لمزيد من التفاصيل انظر المرجع 2، 6، 24، 25.
  2. وضع خزان يحتوي على 2-3-تكييفها الظلام الزرد المعدلة وراثيا في المياه النظام بين اثنين من مصابيح الفلورسنت التي تنبعث منها ضوء 2800 لوكس 2 و 6 و 24 و 25. كشف الزرد للضوء الشديد المستمر لمدة 35 ساعة. خلال التعرض للضوء، وضمان أن يتم الحفاظ على درجة حرارة الماء بين 31-33 درجة مئوية.

3. إعداد لالتثقيف (على يوم من عزل الشبكية)

  1. باستخدام الايثانول 70٪، وتعقيم هود زراعة الأنسجة ومكونات / الأدوات التي يتم تحويلها إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة (على سبيل المثال، قوارير تحتوي على MEM وHBSS، الماصات، نصائح ماصة معقمة، الخ.).
  2. إعداد fluorodishes
    1. معطف fluorodish واحد لكل شبكية العين مع الخلايا والأنسجة لاصق (انظر الجدول المواد).
    2. تمييع لاصقة الخلايا والأنسجة في 0.1 مم NaHCO 3 إلى تركيز النهائي من 70 ميكروغرام / مل، إضافة 50 ميكرولتر من كل fluorodish ونشر الحل عبر وسط fluorodish مع 200 ميكرولتر ماصة (تقريبا 1 - 1.2 سم قطر ).
    3. احتضان fluorodishes المغلفة لل1-3 ساعة عند RT؛ (بدلا من ذلك، واحتضان O / N عند 4 درجة مئوية).
    4. إزالة الحل وشطف 3X مع 500 ميكرولتر من 1X MEM عن كل غسل. لتجنب fluorodishes المغلفة من الجفاف، والحفاظ عليها في MEM حتى هي التي شنت إإكسبلنتس الشبكية.
  3. إعداد مستنبت كما هو موضح في الخطوة 1.6. مستنبت يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية.

4. عزل والتثقيف من إإكسبلنتس الشبكية

ملاحظة: بروتوكول المبينة أدناه هي لعزل الشبكية الظهرية، وهي المنطقة الشبكية التي lesioned في الغالب من قبل وصف نموذج-اضرار طفيفة. لذلك، الناجم عن الضرر انتشار والحدث المرتبطة الهجرة النووية interkinetic تحدث في شبكية العين الظهرية. ومع ذلك، فإن إجراء العزل يمكن تعديلها لتسفر عن المناطق الشبكية وفقا لمتطلبات محددة من السؤال الباحث / البحوث.

  1. الموت ببطء واحدة تلف خفيف المعدلة وراثيا الزرد لالوقت تا في 1: 500 2-فينوكسييثانول.
  2. إزالة MEM من fluorodish واحد مع ماصة 1000 ميكرولتر ذلك أنه ليس هناك سوى طبقة رقيقة من بقايا السوائل.
  3. نقل الزرد على منشفة ورقية جافة، وإزالة العين مع زوج المنحني من ملقط دومون (ملقط # 5، 45 درجة زاوية) ونقله على fluorodish.
  4. باستخدام مجهر تشريحي، توجيه العين مع التلميذ على زلة غطاء fluorodish بحيث الجزء الخلفي من العين مع العصب البصري مرئيا (الشكل 1D).
  5. مع زوج من مقص ماكفرسون-Vannas إزالة العصب البصري، وقطع بالقرب من الجزء الخلفي من العين. وبالإضافة إلى ذلك، إزالة النسيج الضام بطانة خارج العين.
  6. عقد العين بين الأنف والجانب الزمني مع زوج من ملقط # 5 في حين جعل شق في القصبة البصرية التي خارقة مع واحد شفرة المقص من خلال المصفوية الصفيحة وقطع على طول كل من الأنف وجانبي الزمنية للعين (انظر الشكل 1E ، لي مجزأةشمال شرق).
  7. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط # 5، واحد لعقد الجانب الظهري من شبكية العين والزوج الآخر لفصل بطني من شبكية العين الظهرية، وسحب الأنسجة.
    ملاحظة: ينصح لتوجيه شبكية العين الظهرية بحيث العدسة وطبقة الخلايا العقدية تواجه ساترة بينما يواجه الصلبة صعودا.
  8. إزالة الصلبة من شبكية العين الظهرية مع زوج واحد من ملقط # 5، في حين الضغط على العدسة التي يتصل بها شبكية العين مع الزوج الثاني من ملقط # 5 (الشكل 1H، I).
  9. لإزالة العدسة، واستخدام مقص ماكفرسون-Vannas وقطع راء العدسة دون الإضرار شبكية العين (الشكل 1I، J). في بعض الأحيان، تفصل عدسة في الخطوة 4.7. في هذه الحالة، وإزالة الصلبة بعناية مع ملقط من خلال عقد شبكية العين في خفض الحافة مع الزوج الثاني من ملقط # 5.
  10. إزالة الجسم الزجاجي أثناء إزالة العدسة دون الإضرار شبكية العين. لشد شبكية العين مع طبقة الخلايا العقدية التي تواجه انزلاق الغطاء من fluorodish (الشكل 1L، M).
  11. تحيط شبكية العين مع 10 ميكرولتر من 1٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز والسماح للالاغاروز يصلب.
  12. ووتش إن الاغاروز السائل لا رفع شبكية العين حتى على ارتفاع طفيف قد تؤثر على القدرة على التركيز عميقا في الأنسجة. إذا لوحظ رفع، واستخدام ماصة لإزالة الاغاروز. السماح مجموعة الاغاروز المتبقية قبل محاولة إضافة المزيد.
  13. كرر الخطوة 4.12 عدة مرات قبل أن يضيف 1٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز لتغطية fluorodish كامل. مرة واحدة وقد عززت الاغاروز، إضافة 1.5 مل الثقافة المتوسطة.
  14. الحفاظ على ثقافة يزدرع الشبكية في CO 2 بيئة / الهواء 5٪ التي وضعت في 32 درجة مئوية لمدة حوالي 12 ساعة للسماح للشبكية العين للتعافي من الإجهاد التي تكبدتها إجراء العزل. ضبط درجة الحرارة إلى 32 درجة مئوية للحفاظ على شبكية العين في نفس درجة حرارة الزرد تعامل خفيفة (راجع الخطوة 2.3).

5. Multiphoton المجهر

الصورة = "jove_content"> ملاحظة: تم ضبط التجارب التي أجريت في هذا المخطوط لالمجهر multiphoton مجهزة بأشعة الليزر تحت الحمراء (انظر الجدول المواد)، مسافة طويلة الهدف الغمر بالماء 40X آبو (NA 1.15)، ماسح ضوئي الجلفانومتر و غرفة البيئية التي تحتوي على إدراج لمدة أربعة 35 ملم أطباق بتري. تم الحصول على الصور مع كاشف غير descanned (R-NDD).

  1. قبل التصوير، تتوازن الغرفة البيئية لتحقيق 5٪ CO 2 الغلاف الجوي / الهواء. تأكد من أن يتم إدراج أطباق بتري فارغة في حامل لتجنب تسرب الغاز في الغرفة.
  2. تشغيل نظام المجهر.
  3. مرة واحدة يتم معايرتها الغرفة البيئية، إضافة الانكسار السائل مؤشر على 40X آبو مسافات طويلة الهدف الغمر بالماء (NA 1.15).
    ملاحظة: السائل معامل الانكسار مع الخصائص البصرية مماثلة لمياه يستخدم لتجنب تبخر الماء أثناء التصوير على المدى الطويل.
  4. انفلونزا مكانorodishes مع إإكسبلنتس الشبكية في الغرفة. باستخدام ضوء brightfield، ضع العينة في مسار الضوء وتقديم midregion من شبكية العين الظهرية في الطائرة من التركيز.
  5. استخدام GFP الضوء epifluorescent التركيز على GFAP: nGFP -positive مولر الدبقية النوى (الشكل 2A، C).
    ملاحظة: إذا لم يتم تحميل إإكسبلنتس شقة أو تراكمت الاغاروز تحت يزدرع، سيكون من الصعب التركيز على GFAP: nGFP نوى -positive أو أنها سوف يتألق بشكل خافت.
    1. تحقق ما إذا كان الانتقال إلى منطقة أخرى داخل نفس يزدرع الشبكية سوف تغلب على مسألة التركيز. نقل ذلك إلى يزدرع الشبكية مختلفة.
  6. في البرنامج الحصول على الصور، افتح "A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية"، و "TiPad"، و "A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية" و "حيازة ND 'ويندوز. للتصوير multiphoton، تأكد من أن خيار "الأشعة تحت الحمراء NDD" يتم اختياره في 'A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية.
  7. في 'settinز "الحقل، حدد IR-DM للشارع مرآة 1 مزدوج اللون واختيار تمرير مرشح الفرقة 525/50 للحصول على GFP مضان.
  8. التبديل على يزر الأشعة تحت الحمراء في الإطار المسمى "A1MP واجهة المستخدم الرسومية. وسوف يستغرق بضع دقائق ليزر ليكون جاهزا. تعيين الطول الموجي 910 نانومتر لإثارة GFP مضان، ومحاذاة الليزر عن طريق النقر على زر 'محاذاة السيارات "في نافذة" A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية.
  9. تأكد من أن الغرفة والمعدات الأضواء مغلقا أو تغطيتها قبل فتح مصراع في 'A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية "لتجنب التعرض المفرط للأنبوب مضخم. للحد من مستويات الضجيج، وإيواء المجهر في بيئة مظلمة.
  10. الحصول على صور من مجال الرؤية من 300 × 300 بكسل، في التكبير من اثنين، ووقت بكسل مسكن 4.8 ميكرو ثانية / بكسل. وضع تقريبا تصل قوة الليزر عن طريق تغيير "منطقة الاستحواذ" في سياق "A1MP واجهة المستخدم الرسومية" والزيادة في نافذة "A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية.
  11. إعداد ض المكدس
    1. التركيز على طبقة الخلايا العقدية لضبط البؤري العليا للض المكدس في 'z'-النافذة الفرعية داخل "نافذة اكتساب ND. بعض GFAP: nGFP خلايا -positive تقع عادة في طبقة الخلايا العقدية، مما يساعد على تحديد الحد القاعدية من شبكية العين (الشكل 2A، D).
    2. نقل البؤري من خلال مستوى ONL (الشكل 2A، B)، والتي تتميز بوجود GFAP المسمى خافت: nGFP خلايا -positive التي هي المستديرة وتضخم بالنسبة لنظرائهم في INL (الشكل 2A، C) .
    3. تعيين هذه الطائرة كما أسفل ض المكدس. تأكد من أن ONL بأكمله سيتم تصوير (الشكل 2A، B).
    4. عندما تعاني من نوبات البؤري التي تتطلب إعادة ضبط خلال فترة التصوير، انقر نقرا مزدوجا فوق على موقف وسط في النافذة الفرعية 'ض' لتعيين أنها موقف "الوطن". التغيير إلى "وضع متماثل تعريف"وانقر على 'قريب'.
    5. تعيين حجم ض خطوة بين 0،7-1 ميكرون.
  12. تصحيح Z-كثافة:
    1. تطبيق التصحيحات ض كثافة للتعويض عن فقدان كثافة بكسل بسبب تشتت الضوء عند التصوير في الطبقات العميقة من الأنسجة.
    2. لإعداد التصحيح، فتح النافذة "تصحيح ض كثافة. لتعيين "مجموعة ض المكدس"، واختر "من ND.
    3. انقر على طائرة الوصل السفلي في الإطار "تصحيح ض شدة" (في هذه الحالة، يتوافق مع طبقة الخلايا العقدية) وتعيين كثافة الليزر ( 'منطقة الاستحواذ "في سياق" A1MP واجهة المستخدم الرسومية') وزيادة (A1 واجهة المستخدم الرسومية المدمجة ).
    4. انقر فوق السهم بجانب 'ض القيم "في نافذة" تصحيح ض كثافة "لتأكيد الإعدادات التي تظهر لاحقا تحت عنوان" إعدادات الجهاز "في نافذة" تصحيح ض كثافة "لطائرة التنسيق الذي تم اختياره.
    5. كرر العملية لوالمتوسطةأعلى طائرات الثانية، وزيادة قوة الليزر والكسب. ويمكن أن يضاف طائرات التنسيق إضافية إذا لزم الأمر. انظر الجدول رقم 1 لضبط الليزر وتحقيق مكاسب محددة لإجراء التجارب في أرقام 2-4.
    6. تعيين "منطقة الاستحواذ" في نافذة "A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية. تجنب اختيار منطقة اكتساب أكبر من 15، وكسب أعلى من 126 في بداية التصوير للتحايل على photobleaching من وزيادة مستويات الضوضاء.
      ملاحظة: باسم الليزر وأنابيب مضخم تختلف بين أنظمة الفحص المجهري، اختبار الليزر وإعدادات مكسب للحصول على ظروف التصوير الأمثل للمجهر اقامة مع تجنب photobleaching من.
    7. اختيار "تصحيح كثافة النسبي" في نافذة "تصحيح ض كثافة.
  13. في النافذة الفرعية "متسلسلة زمنية" في نافذة "ND الاستحواذ، وضع لمدة 8 ساعات والفاصل إلى 'أي تأخير". بعد ذلك، تأكد من النقر فوق "تشغيل ض تصحيح" في تيانه ض المكدس "نافذة فرعية في زر النافذة" ND الاستحواذ "لاكتساب متسلسلة زمنية 3-D.
  14. الحفاظ على إإكسبلنتس الشبكية عند درجة حرارة من 27-29 درجة مئوية طوال مدة الحصول على الصور.
  15. طوال فترة الحصول على الصور، إذا لزم الأمر، إعادة ضبط مستوى الطاقة وزيادة من أجل الحفاظ على جودة الصورة لتحليل ما بعد التصوير. لإجراء تعديلات تنفيذ الخطوات 5.11.2 - 5.11.4.
  16. إذا كانت التحولات البؤري، وقفة أو وقف تشغيل وتنفيذ الخطوة 5.11 ثانية.
    ملاحظة: إذا تم اختيار "النسبي ض تصحيح" في خطوة 5.12.7 وأجريت خطوة 5.11.4 يجب أن لا يكون من الضروري لتعديل مستويات السلطة والمكاسب، إلا إذا حدث photobleaching من واسع النطاق.

6. تحليل سرعة

  1. استخراج الوقت، ووضع "المنطقة من الفوائد" على الصورة. استخدام 'الوقت قياس "أداة وتصدير قيم الوقت إلى جدول بيانات.
  2. اقتصاص المنطقة التي تحتوي على ديviding GFAP: nGFP نواة -positive.
  3. اختيار المنطقة المزروعة بحيث يحتوي على نواة واحدة على الأقل أن لا يخضع الحركة الوطنية العراقية من أجل وضع نقطة مرجعية لقياس بعد المسافات التي نواة الفاصل هاجرت فيما يتعلق INL القاعدية. ملاحظة: لاختيار نواة الذي يبقى في INL القاعدية، فإنه يساعد على إعداد إعادة الإعمار 3-D من متسلسلة زمنية.
  4. بدلا من ذلك، إذا كان GFAP: لوحظ nGFP خلية -positive في ONL طوال فترة الاستحواذ، استخدم خط عمودي من طول ثابت تمتد من نواة ONL إلى INL القاعدية من أجل تحديد نقطة مرجعية.
  5. باستخدام وظيفة "إظهار شرائح"، وتوليد توقعات المتعامدة. وفي وقت لاحق، وتغيير الوضع من "شريحة" إلى "أقصى الإسقاط كثافة.
  6. إيقاف "س ص" ضوء أقصى الإسقاط المتعامد. اعتمادا على التوجه الذي المهاجرة / تقسيم نواة هي أفضل وضوحا، وهويسوتو إيقاف إما "xz'- أو" الرؤية yz'.
  7. انقر على الصورة المتبقية مع زر الفأرة الأيمن واستخراج 'XZ' أو 'سلسلة yz' صورة مع' وظيفة خلق وثيقة جديدة من وجهة النظر هذه. إذا لزم الأمر، وتناوب الصورة.
  8. باستخدام وظيفة "قياس دليل، رسم خط أفقي عبر الصورة في المستوى السفلي للنواة أن يبقى في INL القاعدية ولا يخضع الحركة الوطنية العراقية (= نقطة مرجعية، الشكل 4A - E، خط أفقي أحمر).
  9. قياس المسافة بين خط المرجعية ونقطة القاعدية من نواة المهاجرة لمتسلسلة زمنية باستخدام أداة "قياس خط" في برامج التحليل (انظر الشكل 4A - E).
  10. مرة واحدة يكسر الغلاف النووي أسفل، وقياس موقف القاعدية من سوما إذا كان التعرف بعد نشر GFP في الخلية بأكملها.
  11. باستخدام برنامج جداول البيانات، مؤامرة من مسافة نوهاجر cleus ضد مرور الوقت (الشكل 4F).
    1. لتحديد سرعة قمي الهجرة (الخامس)، سافر الرسم البياني المسافات لفترة ما قبل انهيار الغلاف النووي يحدث (الشكل 4G).
    2. حدد سلسلة البيانات ضمن المخطط، انقر بزر الماوس الأيمن في الماوس ولإدراج منحنى الانحدار الخطي بما في ذلك وظيفة المقابلة "ص = م × + ج. المنحدر 'م' في وظيفة يمثل سرعة، والخامس على (الشكل 4G).
    3. كرر الخطوات 6.11.1 و 6.11.2 للمرحلة الأولى من الهجرة القاعدية السريع لتحديد سرعة الهجرة القاعدية، والخامس ب (الشكل 4H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عزلة شبكية العين وفقا للإجراءات المبينة في التخطيطي في الشكل 1 يسمح للزراعة من شبكية العين الظهرية بالارض من أضرار خفيفة الكبار تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد خلال فترة لا تقل عن 24 ساعة في 5٪ CO 2 / بيئة الهواء. هذه إإكسبلنتس الشبكية شنت مسطحة يمكن استخدامها لطائرات التنسيق صورة في مستويات الأنسجة العميقة. مثال على ذلك هو مولر الدبقية / العصبية نواة خلية سلفية المسمى مع GFP من مولر الدبقية محددة المروج GFAP (ييفي الدبقية البروتين الحمضية) التي تقع في ONL خلال الانقسام في أضرار خفيفة شبكية العين (2A أرقام - D، 3). لمزيد من تأكيد أن هذا النهج ينطبق على صورة مختلف طبقات الخلايا في شبكية العين، وقد تم إعداد إإكسبلنتس الشبكية معزولة تماما من غير التالفة تيراغرام [رو: Eco.NfsB-EGFP] nt19 عيون الزرد التي تعبر عن EGFP في المستقبلات الضوئية قضيب تحتوPROMOTOR رودوبسين. الشكل 2E - H يدل على أنه من الممكن الحصول على صور من GFP إيجابية مبصرة قضيب وأقسامهم الداخلية. كما تمتد قضيب قطاعات الداخلية بين مبصرات مخروط نحو الظهارة الصبغية الشبكية، فإن هذه البيانات يعني أنه من الممكن أيضا أن خلايا مستقبلة للضوء صورة مخروط. وكان هذا ولكن لم يتم التحقيق أبعد من ذلك.

وبعد أن لاحظ مولر الدبقية / العصبية نواة خلية سلفية في ONL في شبكية العين بأضرار خفيفة، وتتميز نحن سلوكهم المهاجرة في التفاصيل (الشكل 3 و فيلم 1). مولر الدبقية / العصبية نواة خلية سلفية وصفت من قبل GFP تهاجر ثنائية إتجاهي بين الموقف القاعدية من القائمة العراقية الوطنية التي يقيمون فيها عادة وONL، موقع فقدان مبصرة. عادة، GFAP: nGFP نوى -positive هاجر على بعد مسافة قصيرة في INL (الشكل 3A - C) قبل أن خضع لالمغلف انهيار النووي، في حين لا يزال وضعه في القائمة العراقية الوطنية، على أساس إعادة توزيع GFP في سيتوبلازم كامل مولر الدبقية / خلية سلفية العصبية (الشكل 3D). وبعد انقسام الخلايا في ONL، وهما GFAP: أصبحت nGFP نوى -positive مرئية في ONL (الشكل 3F، G) الذي عاد إلى القاعدية INL (الشكل 3H - J). على انقسام الخلايا، وكانت نواة الناشئة حديثا في البداية قاتمة جدا، وبالتالي يصعب تحديد الشكل (3G). ومع ذلك، في غضون 1-2 الأطر الزمنية بعد الانقسام، وأصبح مضان GFP النووي مشرق، والتي مكنت من التصور الهجرة النووية (الشكل 3H - J). يسمح التصوير الخلية الحية أيضا تصور الطائرة تقسيم (الشكل 3F، G)، التي وقعت أفقيا إلى السطح القمي في شبكية العين للخلية هو مبين في الشكل (3). بل هو أيضا من الممكن استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا أخرى من هذا القبيلكما تيراغرام [GFAP: EGFP] الزرد nt11 التي تعبر عن GFP في السيتوبلازم (لا تظهر البيانات). على الرغم من أنه من الممكن تحديد موثوق حركة قمي وانقسامات الخلية أفقية، غالبا ما يكون من الصعب تحديد بالضبط موقف المهاجرة باسالي نوى ابنة وانقسامات الخلية العمودية في تيراغرام [GFAP: EGFP] nt11 الزرد شبكية العين (لا تظهر البيانات).

لتحديد السرعة، وGFAP: nGFP نواة -positive التي لم تهاجر طوال فترة تسجيل اختيرت كنقطة مرجعية (النجم، الشكل 4A - E). تم تحديد فيما يتعلق GFAP إشارة - المسافة من النواة المهاجرة (E الخط الأحمر العمودي، الشكل 4A): nGFP نواة -positive (خط أحمر أفقي، الشكل 4A - E) في كل timepoint من سلسلة الصورة على أقصى XZ أو YZ-توقعات (اعتمادا على الزاوية التي يمكن أن تكون نواة visualiزيد بأكبر قدر من الكفاءة). وقد رسم المسافة التي نواة هاجرت ضد الساعة في جدول (الشكل 4F - H). وكثيرا ما لوحظ غشاء انهيار النووي في الرسم البياني كحركة basalward الأولية بسبب إعادة توزيع GFP داخل الخلية بأكملها (القاعدية الجزء الأكبر من جسم الخلية في هذه الحالة). تم تحديد سرعة قمي قبل انهيار الغلاف النووي، من المناسب منحنى الانحدار الخطي (خط منقط الرمادي، والشكل 4G) لمسافة تآمر ضد الساعة لفترة ما قبل انهيار الغلاف النووي (الماس الأحمر، الشكل 4G). المنحدر 'م' من منحنى الانحدار الخطي (ص = م × + ج) يمثل سرعة "DX / دينارا. كانت سرعة قمي للخلية المعروضة في الشكل (4) 10.89 ميكرون / ساعة. تم تطبيق نفس النهج لحساب سرعة الحركة القاعدية أولية سريعة (ت ب) من نوى ابنة شكلت حديثا (الشكل 4F، H). والقاعدية الهجرة سرعات الخامس (ب) من -67.71 و 33.51 ميكرون / ساعة من الخلايا الوليدة D1 و D2 على التوالي، وكان نسبيا أسرع من سرعة قمي. لسوء الحظ، لم يكن من الممكن لتحديد سرعة قمي بعد انهيار الغلاف النووي كما GFP منتشرة في جميع أنحاء الخلية بأكملها. بدلا من ذلك، تم احتساب السرعة اللحظية بناء على توقيت وموقف نواة قبل انهيار الغلاف النووي والتصور الأول من نوى ابنة شكلت حديثا. سرعة لحظية من 7.9 ميكرون / ساعة للخلية هو مبين في الشكل (4) ومن المرجح أقل من الحقيقة اذ تصل لونين في ONL قبل الطور النهائي من الانقسام، عندما تصبح نواة ابنة مرئية.

وباختصار، فإن في ثقافة Explants الشبكية تسمح التصوير الخلية الحية من الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين الزرد وتحديد الهجرة وانقسام الخلايا سنوياrameters من نوى الفردية.

شكل 1
الشكل 1: إجراء عزل الشبكية. أ) تخطيطي يوضح رئيس الزرد مع العين لها. ب) يتم إزالة العين من الزرد والموجهة لإظهار الجزء الأمامي من العين مع التلميذ. C) بدوره العين 180 درجة بحيث يصبح الجزء الخلفي من العين مع ساق البصري (شغل في دائرة سوداء) واضحة في (D) والتلميذ يواجه هبوطا. اللون الرمادي يدل على وجود الصلبة من العين. E) شفرة واحدة من مقص ماكفرسون-Vannas يتم إدراج ساق البصري للعين (شغل في دائرة سوداء) لقطع عليه في ظهري وبطني الجانبين والتي دلت على ذلك خط مجزأة الأبيض. F) نصف ظهري من العين بعد إزالة نصف بطني. وتشير نصف دائرة سوداء رانه جزء المتبقي من ساق البصري. G) بدوره العين 90 درجة إلى الخلف لكشف (H) داخل العين مع شبكية العين (البني)، الزجاجي (لا يظهر) والعدسة (L، دائرة رمادي فاتح) الذي لا يزال المغطى من قبل الصلبة (خط رمادي ). I) تم فصل والصلبة (لاحظ، خط رمادي مفقود) وJ) والعدسة والجسم الزجاجي حذفه مما أدى إلى فقط في شبكية العين (البني). تحولت K) الشبكية 90 ° إعطاء الأمام الارتفاع إلى العرض المسطحة جبل الشبكية الظهرية (L). M) الظهرية يزدرع الشبكية التي شنت مسطحة على fluorodish من الزجاج السفلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: 3-D إعادة إعمارالشبكية Multiphoton Z-الأكوام. أ) إعادة الإعمار 3-D من multiphoton ض المكدس صورة سلسلة من GFAP: nGFP- خلايا إيجابية في الشبكية الثقافات كله جبل من الزرد بعد 48 ساعة من-اضرار طفيفة. ب - D) multiphoton واحد س ص-صور GFAP: nGFP خلايا -positive عرضها في 3D إعادة الإعمار في الفقرة (أ) في مستوى ONL (ب)، والقائمة العراقية الوطنية (C)، والتي تتطابق مع الطبقة التي تحتوي مولر سوما الدبقية والعمالي (D). السهم في (ب) يشير إلى الدور الدبقية مولر تضخم في ONL بعد انهيار الغلاف النووي. E) 3-D إعادة بناء multiphoton ض المكدس سلسلة صورة يزدرع الشبكية من غير التالفة تيراغرام [رو: Eco.NfsB-EGFP] الزرد nt19. F - H) multiphoton واحد س ص-الصور على مستوى قطاعات قضيب الداخلية (RIS، F)، طبقة النووية قضيب (G) وعلى مستوى شبكية العين الداخلية (H). GCL، العقدة طبقة الخليوي، INL، الداخلية طبقة النووية. ONL، طبقة النووية الخارجي. RIS، الجزء رود الداخلية. شريط النطاق في A، D، E و H، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): لقطات متتابعة سلسلة صورة الحركة الوطنية العراقية. أ - ي) سلسلة صورة 3D-إعادة بناء ض المكدس سلسلة لقطات متتابعة عرض تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 نوى -positive التي تخضع الحركة الوطنية العراقية تقسيم في ONL في إإكسبلنتس الشبكية (الصف العلوي). يشار إلى موقف واحد المهاجرة apically نواة والهجرة باسالي نوى ابنة من قبل السهام الحمراء. تشير نجمة داود الحمراء الغلاف النووي انهيار أثناء الانقسام. أ - J، الصف السفلي) ووكانت نفس السلسلة صورة كما هو الحال في الصف العلوي مشبعة واقتصاص للتركيز على تقسيم الخلايا في ONL. INL، الداخلية طبقة النووية. IPL، الداخلية ضفيري طبقة. ONL، طبقة النووية الخارجي. شريط النطاق في A، 10 ميكرون وهو نفسه بالنسبة لب - J. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تحليل السرعات الهجرة القمية وبصل. أ - E) الحد الأقصى لYZ-إسقاط ض المكدس صورة سلسلة من تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 إإكسبلنتس الشبكية في timepoints مختلفة من تسجيل لقطات متتابعة المكتسبة بواسطة المجهر متعددة الفوتون. باستخدام أداة سطر تحت وظيفة "قياس دليل، وضعت خط أفقي على مستوى الخلية المرجعية، وأشار نجم. ولي الرأسيخط asurement كان وضعه ابتداء من الخط الأفقي وتمتد إلى موقف القاعدية من GFAP المهاجرة: nGFP نواة -positive. ونظرا لطول خط القياس في المربعات البيضاء على الصور والقراءة تحت الصور. L1 = طول أن ابنة خلية 1 هاجرت. L2 = طول تلك الخلية ابنة 2 هاجرت. F) المسافة التي الخلية (F0) يقاس في (A - E) هاجرت apically وأن الخلايا الوليدة الناشئة D1 و D2 هاجرت باسالي في تسجيل multiphoton لقطات متتابعة. الخط الأحمر يشير إلى القياسات التي تم حساب سرعة الهجرة قمي (الخامس) في حين أن خطوط سوداء ورمادية تشير القياسات المستخدمة لحساب السرعات الهجرة القاعدية (ت ب) لD1 و D2 على التوالي. G، H) وتآمر المسافة ضد الساعة في Excel للهجرة قمي قبل الغلاف النووي انهيار (G) ومرحلة القاعدية السريعالهجرة لخلية ابنة D1 (H). تم تركيب منحنيات الانحدار الخطي ويتم إعطاء وظائف أقل من الرسوم البيانية مع المنحدر تمثل السرعة. INL، الداخلية طبقة النووية. IPL، الداخلية ضفيري طبقة. ONL، طبقة النووية الخارجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

TG [GFAP: EGFP] nt11 TG [رو: Eco.NfsB-EGFP] nt19
قوة الليزر ربح قوة الليزر ربح
العلوي (مبصرة قضيب) 13 126 3.5 118 الأوسط (مولر الدبقية) 10 126 2.8 118
القاع (العمالي) 8 126 2.1 118

الجدول 1: ليزر ومستويات كسب المستخدمة لZ-كثافة تصحيحات في طائرات مختلفة عن التجارب المعروضة في أرقام 2-4.

الشكل 2
فيلم 1: التصوير خلية حية من الشبكية إإكسبلنتس التي كتبها Multiphoton المجهري. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دراسات التحقيق في الآليات التي تحكم تجديد الكبار التالفة شبكية العين الزرد الطرق في الغالب تستخدم immunocytochemical 5، 25، 26، 27، 28، 29، 30. تهيئة الظروف الملائمة لثقافة إإكسبلنتس الشبكية وأداء التصوير الخلية الحية على الظواهر، مثل الحركة الوطنية العراقية، توفر لنا تقنية الحصول عليها في العمق المكاني والزماني المعلومات. هذه التقنية تتيح تحديد السرعات الهجرة، وتوقيت وموقف انهيار الغلاف النووي أثناء الطور الأول من الانقسام وطول وموضع انقسام الخلايا. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لإنشاء طائرة تقسيم ومصير الخلايا الوليدة الناشئة فيما يتعلق الموقع في وقت لاحق. في نهاية المطاف، وهذا نهج قوي تحديد ما إذا كان M2، الدبقية روزينمولر والخلايا العصبية السلف تتصرف بشكل مختلف فيما يتعلق الحركة الوطنية العراقية خلال تجديد شبكية العين. فإن استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تحدد الخلايا المتكاثرة في شبكية العين تجديد في مراحل متميزة للاستجابة التجدد مساعدة في فك رموز سلوك التفاضلية 6. في حالة المجهر multiphoton المستخدمة هنا، ويفضل GFP خطوط مراسل الزرد كما الإثارة من البروتين الأحمر نيون (RFP) ليست فعالة جدا. ومع ذلك، قد نظم multiphoton أخرى تسمح الإثارة الفعالة لطلب تقديم العروض أو fluorophores ما يعادلها.

واحدة من أهم الخطوات في إجراء العزل في شبكية العين وتركيب شبكية العين. شبكية العين يجب أن تكون مثبتة على شقة ممكن للضوء multiphoton لتكون قادرة على تمرير إلى أعمق ض مستويات ONL. التقويس الشبكية خاصة في منطقة هامشية، زجاجي المتبقية، و / أو تراكم الاغاروز تحت ثقافة الشبكية، التي تستخدم لشل حركةالأنسجة، والأكثر شيوعا إدخال مساحة إضافية بين زلة الغطاء والثقافة الشبكية. وبالإضافة إلى ذلك، وزيادة قوة الليزر ومكاسب لا بد من استخدامها للحصول على الصور إذا شبكية العين ليست مسطحة ووهذا بدوره يؤدي الى زيادة photobleaching من والإقلال من الثقافة الشبكية. صحيح تصاعد غالبا ما يؤدي أيضا إلى ضعف جودة الصورة بسبب انخفاض اختراق الضوء وسوف تؤثر على القدرة على قياس المسافات التي نوى قد هاجرت وبالتالي حساب السرعات الهجرة.

السرعات الهجرة قمي قبل انهيار الغلاف النووي والهجرة القاعدية يمكن تحديد موثوق في صورة سلسلة من تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 إإكسبلنتس الشبكية الزرد. ومع ذلك، فإنه غير ممكن حاليا لتحديد سرعة الهجرة قمي من لونين بعد انهيار الغلاف النووي في هذا الخط الزرد المعدلة وراثيا مثل GFP إعادة توزع في جميع أنحاء السيتوبلازم بأكمله. Labeliأدى نانوغرام من إإكسبلنتس الشبكية مع الصبغة النووي هويشت في امتصاص قاتمة إلى نوى الدبقية مولر التي تتطلب التغيير في الطول الموجي 830 نانومتر (Lahne وهايد، بيانات غير منشورة)، مما أثر على سلامة الأنسجة وتسبب توقف دورة الخلية ( Lahne وهايد، بيانات غير منشورة). خلال تطوير شبكية العين، تيراغرام [h2afva: h2afva-GFP] وقد استخدمت kca6 الزرد التي تعبر عن GFP تنصهر إلى هيستون 2 بنجاح لمراقبة الحركة الوطنية العراقية وتحديد السرعات الهجرة في مراحل مختلفة من دورة الخلية 12، 31. في المستقبل، إإكسبلنتس الشبكية من تيراغرام [h2afva: h2afva-GFP] سوف kca6 الزرد أيضا تمكين التصور من لونين في جميع أنحاء دورة الخلية، وسيسمح للتحليل سرعة الهجرة قمي بعد انهيار الغشاء النووي في الكبار تجديد شبكية العين الزرد.

وبعد إثبات الظروف لمراقبة الحركة الوطنية العراقية من قبلوالتصوير الخلية الحية في إإكسبلنتس الشبكية من الزرد الكبار بأضرار خفيفة وتحليل المقابلة من السرعات تشكل أساسا للتحقيق في الآليات التي تحكم الحركة الوطنية العراقية. بدأت بعض الدراسات دراسة آليات الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين باستخدام مناعية لتحديد موقف من الإنقسامية الفوسفات-هيستون النوى إيجابية 3 6 و 7. ومع ذلك، التدخل في مسارات إشارات قد لا تجعل الموقف من الانقسام، ولكنها قد تؤثر على غيرها من المعالم مثل السرعة، وتوقيت الانقسام والانقسام الذي لن يكون ممكنا / من الصعب جدا أن نستشف من مناعية. في وقت سابق، أنه قد تبين أنه نوى الإنقسامية الفوسفات-هيستون 3 الإيجابية mislocalized إلى مواقف أكثر القاعدية في شبكية العين النامية في المسوخ dynactin وmorphants 11. ومع ذلك، كشفت لاحقا التصوير الخلية الحية أن الهجرة النووية قبل انقسام الخلايا تأخر في الخلية للخطر dynactin، في حين زيادة سرعة الهجرة قمي تمكين نوى الوصول إليها، والخضوع لانقسام الخلايا على سطح قمي 11 و 12. هذا المثال يجسد قوة التصوير الخلية الحية. وبالمثل، عندما كشف الآليات التي تسهل الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين الزرد، ودراسات التصوير الخلية الحية أن تكمل، وفي حالات مختلفة ستكون مفيدة أكثر، نهج immunocytochemical.

وكما ذكر أعلاه، والتصوير الخلية الحية يوفر مزايا عديدة أكثر من المناعى / أساليب ثابتة. ومع ذلك، فإنه لابد من الأخذ في الاعتبار أن إإكسبلنتس الشبكية هي نموذج خارج الحي. كما تكبد هذا، والضرر أثناء إجراء العزل و / أو ثقافة ظروف قد تؤثر على العمليات الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الإجراء التصوير في حد ذاته قد يؤدي الى تأثيرات السامة التي قد تؤثر على سلوك الخلوي 23، 32. في حين أن هناك disadvantages أن يعيش خلية التصوير الثقافات الشبكية، هو حاليا أفضل طريقة لدينا للحصول على المعلومات الحيوية من الحركة الوطنية العراقية. الأهم من ذلك، فإن إجراء التصوير الخلية الحية من إإكسبلنتس الشبكية تكون قابلة للتطبيق على أسئلة بيولوجية أخرى أثناء تجديد شبكية العين. استنادا إلى بيانات immunocytochemical، اقترح في وقت سابق ان الدبقية مولر يبلعم الموت خلايا مستقبلة للضوء / الحطام التالية الضرر الناجم عن الضوء مبصرة 33. وتعديل معايير لصورة هذه العملية يعيش تحقق حالة حدوث البلعمة من المستقبلات الضوئية الموت في شبكية العين الزرد تجديد، ويمكن استخدامها لدراسة الآليات الكامنة. بعد أن أظهرت أن الصور يمكن الحصول عليها على مستوى نواة قضيب وقضيب قطاعات الداخلية في تيراغرام [رو: Eco.NfsB-EGFP] الزرد nt19، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن ضبط الأوضاع على البلعمة صورة مبصرة. وبالمثل، والمعرفة هي محدودة فيما يتعلق السلوك الديناميكي من الخلايا الدبقية الصغيرة وآليات إدارتهاوظيفة في المنحطة وتجديد شبكية العين 34 و 35. سوف استثمارها الخلايا الدبقية الصغيرة محددة الزرد المعدلة وراثيا بالتزامن مع التصوير الخلية الحية زيادة فهمنا لوظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الكبار تجديد شبكية العين الزرد 36 و 37. لتلخيص، والتصوير الخلية الحية من إإكسبلنتس الشبكية هو أداة قوية للحصول على المعلومات الحيوية من العمليات الخلوية وتحديد السلوك وظيفة من أنواع مختلفة من الخلايا في شبكية العين تجديد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونحن نقدر الدعم المقدم من قبل ويليام آرتشر ومرفق نوتردام المتكاملة التصوير. وتوجه بشكر خاص إلى الفنيين في Freimann علوم الحياة لمساعدة مستمرة ورعاية وتربية من الزرد. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون من المعاهد الوطنية للصحة لDRH (R01-EY018417، R01-EY024519) ومركز بحوث اسماك الزرد، جامعة نوتردام، نوتردام، IN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 120، يزدرع الشبكية، multiphoton المجهر والتصوير الخلية الحية، الزرد، والهجرة النووية interkinetic، والثقافة، والتجديد، ومولر الدبقية، الانقسام، سرعة
ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,… More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter