Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Culture of Adult transgene zebrafisk Retinal Eksplantater til Live-celle Imaging af multifoton Microscopy

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335

Summary

Zebrafisk retinal regenerering er for det meste blevet undersøgt ved hjælp af faste nethinder. Imidlertid dynamiske processer såsom interkinetic nuklear migration forekomme under den regenerative respons og kræver live-cell imaging at undersøge de underliggende mekanismer. Her beskriver vi kultur og billedbehandling betingelser for at overvåge Interkinetic Nuclear Migration (INM) i realtid ved hjælp multifoton mikroskopi.

Abstract

Et endogene regenerering program er initieret af Müller glia i den voksne zebrafisk (Danio rerio) nethinden efter neuronal beskadigelse og død. Müller glia genindtræde i cellecyklus og producere neuronale stamceller, der undergår efterfølgende runder af celledelinger og differentiere til de tabte neuronale celletyper. Både Müller glia og neuronal progenitor cellekerner replikere deres DNA og undergår mitose i forskellige steder i nethinden, dvs. de vandrer mellem den basale Inner Nuclear Layer (INL) og den ydre kernelag (ONL) henholdsvis i en fremgangsmåde beskrevet som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM er overvejende blevet undersøgt i udviklingslandene nethinden. For at undersøge dynamikken i INM i den voksne regenerere zebrafisk nethinden i detaljer, er live-cell imaging af fluorescensmærkede Müller glia / neuronale progenitorceller påkrævet. Her giver vi betingelserne for at isolere og kultur dorsale nethinderfra Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk, der blev udsat for konstant intense lys for 35 timer. Vi viser også, at disse retina kulturer er rentabelt at udføre levende celle billeddannelse eksperimenter, løbende erhverve z-stak billeder i hele tykkelsen af nethinden eksplantatet i op til 8 timer ved hjælp multifoton mikroskopi til at overvåge vandrende adfærd GFAP: nGFP -positive celler . Derudover beskriver vi detaljerne til at udføre post-imaging-analyse for at bestemme hastigheden af ​​apikale og basale INM. For at opsummere, vi etableret betingelser for at studere dynamikken i INM i en voksen model af neuronal regenerering. Dette vil fremme vores forståelse af denne vigtige cellulære proces og give os mulighed for at bestemme de mekanismer, der styrer INM.

Introduction

I modsætning til mennesker, zebrafisk (Danio rerio) udviser en robust regenerering respons ved celledød af retinale neuroner 1, 2, 3, 4. Tumornekrosefaktor α, et signalmolekyle, der frigives fra døende retinale neuroner inducerer Müller glia bosiddende i den basale Inner Nuclear Layer (INL) af nethinden, at proliferere 5 og producere neuronale progenitorceller, der fortsat proliferere før differentiere til neuroncellen typer, der døde 2, 3, 4. Under den proliferative fase af regenereringen respons, kernerne i Müller glia og afledte neuronale progenitorceller undergår en gentagen trækmønster i fase med cellecyklussen (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 > 7. Kerner placeret i den basale INL replikere deres DNA før overgangen til den ydre Nuclear Layer (ONL), hvor de deler før der opstår kerner tilbage basalt til INL. Denne fremgangsmåde blev først beskrevet under neuroepitel udvikling ved hjælp histologiske fremgangsmåder, mens live-cell billedteknik senere bekræftet fortolkningen af Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Både histokemiske og live-cell imaging fremgangsmåder er blevet anvendt til at bestemme mekanismerne bag INM og dens funktion i udviklingen neuroepithelia herunder nethinden 9, 11, 12, 13. Imidlertid har de mekanismer, der styrer INM i den voksne regenerere nethinden ikke undersøgt i mange detaljerxref "> 6, 7. live-cell imaging vil være en uvurderlig tilgang til fremme vores viden om de signalveje, der styrer INM i den voksne regenerere nethinden.

Indtil for nylig var live-cell imaging af INM i nethinden begrænset til enten levende zebrafisk embryoner eller embryonale kylling eller postnatal mus retinale eksplantater 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mens retinale eksplantater fra voksne dyr af forskellige arter, herunder mus, rotter og zebrafisk har været brugt i forskellige celle biologiske metoder 17, 18, 19, 20, live-celle eksperimenter imaging hjælp retinale eksplantater have blevet begrænset til korte perioder, og er ikke blevet gennemført kontinuerligt over flere timer 21, 22. Her beskriver vi en detaljeret protokol til kultur lys-beskadigede voksne zebrafisk nethinder at optræde live-cell imaging eksperimenter overvågning INM ved hjælp af multi-foton mikroskopi 6. Live-cell imaging tilgange er fordelagtige i forhold immunhistokemiske metoder, når undersøger de mekanismer, der styrer INM, da dynamikken i INM, fx hastigheder kan være påvirket i stedet for placeringen af mitose, hvilket ville potentielt ikke påvises ved anvendelse immuncytokemi.

I fremtiden, denne metode har også potentiale til at blive modificeret til at studere andre dynamiske processer i retinal regenerering, såsom fagocytose af døende fotoreceptorer af Müller glia eller adfærd mikroglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Zebrafisk blevet rejst og vedligeholdes i Notre Dame Zebrafisk facilitet i Freimann Life Sciences Center. Beskrevet i dette manuskript metoder er godkendt af University of Notre Dame Animal Care og brug Udvalg og er i overensstemmelse med erklæringen om anvendelse af dyr til vision forskning af foreningen for Forskning i Vision og Ophthalmology.

1. Opløsninger

  1. Forbered 70% ethanol for at sterilisere vævskultur hætte og alt udstyr / reagenser, som afspejler sig på vævskultur hætte.
  2. Tilsæt 2 ml 2-phenoxyethanol til 1 I systemet vand (1: 500 2-phenoxyethanol).
  3. Forbered 0,1 mM NaHCO3, pH 8,0. Anvend en 10 ml sprøjte og en 0,2 um porestørrelse sprøjtefilter at sterilisere opløsningen i en steriliseret vævskultur hætte.
    BEMÆRK: NaHCO3 anvendes til effektivt at sprede celler og væv klæbemiddel hen over dækglasset overflade fluorodishes (setrin 3.2).
  4. Forbered 1,0 M CaCl2 og 1,0 M MgCI2. Sterilisere med en 10 ml sprøjte og 0,2 um porestørrelse sprøjtefilter i en steriliseret vævskultur hætte.
  5. Til fremstilling Hank's-balanceret saltopløsning (HBSS), der tilsættes sterilt CaCl2 og sterilt MgCl2 til 1x HBSS uden Ca 2+ / Mg2 +, uden phenolrødt i en slutkoncentration på 1 mM hver. Arbejde i et sterilt miljø.
  6. Til fremstilling dyrkningsmedium, bland 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) uden phenolrødt, 25% HBSS indeholdende CaCl2 og MgCl2 (se afsnit 1.4), 25% hesteserum (HS), 10 enheder / ml penicillin og 10 ug / ml streptomycin. Arbejde i et sterilt miljø.
    BEMÆRK: Undgå medium indeholdende phenolrødt som det autofluoresces og dermed påvirke signal-støj-forhold. 23
  7. Forbered 10 ml 1% agarose med lavt smeltepunkt i 1x MEM uden phenolrødt. Smelt agarose / 1x MEM anvendelse af en microwave. Forbered små volumener af agarose (f.eks 10 ml) som gentagne genopvarmning vil ændre ion koncentrationer på grund af væske fordampning.
  8. Forud for dyrkning, sterilisere 1,5 ml mikrocentrifugerør ved autoklavering.

2. Light-skader Paradigm

  1. Dark-tilpasning
    1. Placer 2 - 3 i Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk (eller andet transgene zebrafisk af interesse) ved 6 - 14 måneder i et miljø blottet for lys for 14 d. For yderligere detaljer se reference 2, 6, 24, 25.
  2. Placer tank, der indeholder 2 - 3 i dark-tilpassede transgene zebrafisk i systemet vand mellem to lysstofrør, der udsender lys 2800 lux 2, 6, 24, 25. Udsætte zebrafisk til konstant intense lys i 35 timer. Under lyseksponering, sikre, at der opretholdes vandtemperaturen mellem den 31. - 33 ° C.

3. Forberedelse til Dyrkning (På dagen for retinal Isolation)

  1. Anvendelse af 70% ethanol, sterilisere vævskultur hætte og komponenterne / værktøjer, der overføres i vævskultur hætte (f.eks kolber indeholdende MEM og HBSS, pipetter, sterile pipettespidser, osv.).
  2. Fremstilling af fluorodishes
    1. Coat én fluorodish for hver nethinden med celler og væv lim (se tabel of Materials).
    2. Fortynd celler og væv lim i 0,1 mM NaHCO3 til en slutkoncentration på 70 ug / ml, tilsættes 50 pi til hver fluorodish og sprede opløsningen hen over midten af fluorodish med en 200 uL pipettespids (ca. 1 - 1.2 cm diameter ).
    3. Inkuber de overtrukne fluorodishes til 1 - 3 timer ved stuetemperatur(Alternativt inkuber O / N ved 4 ° C).
    4. Fjern opløsningen og skylles 3 gange med 500 pi 1x MEM for hver vask. For at undgå de coatede fluorodishes fra udtørring, vedligeholde dem i MEM indtil retinale eksplantater er monteret.
  3. Forbered dyrkningsmedium som beskrevet i trin 1.6. Dyrkningsmediet kan opbevares i op til 1 uge ved 4 ° C.

4. Isolering og dyrkning af retinale Eksplantater

BEMÆRK: protokollen beskrevet nedenfor, er til isolering af den dorsale nethinden, som er den retinal region, der overvejende læderede ved den beskrevne lys-skader paradigme. Derfor beskadigelse-induceret proliferation og den tilknyttede hændelse af interkinetic nuklear migration forekommer i den dorsale nethinden. Dog kan den procedure, isolation indstilles til at give retinale regioner i henhold til de specifikke krav i forskerens / problemstilling.

  1. Aflive en lysskadede transgene zebrafisk ata gang i 1: 500 2-phenoxyethanol.
  2. Fjern MEM fra én fluorodish med en 1.000 pi pipette, således at kun en tynd film af væske rester.
  3. Overfør zebrafisk på et tørt stykke køkkenrulle, fjerne øjet med en buet par Dumont pincet (pincet # 5, 45 ° vinkel) og overføre det på fluorodish.
  4. Anvendelse af et stereomikroskop, orientere øjet med eleven på dækglasset af fluorodish så bagsiden af øjet med synsnerven er synlig (figur 1D).
  5. Med et par McPherson-Vännäs saks fjerne synsnerven, skæres tæt på bagsiden af ​​øjet. Desuden fjernes bindevæv foring ydersiden af ​​øjet.
  6. Hold øje mellem sin nasale og tidsmæssig side med et par # 5 pincet, samtidig med at et indsnit på den optiske stilk ved gennemboring med en saks klinge gennem lamina cribrosa og skæring langs både den nasale og tidsmæssige sider af øjet (se figur 1E , segmenteret line).
  7. Bruger to par # 5 pincet, en til at holde den dorsale side af nethinden og det andet par for at adskille den ventrale fra den dorsale nethinden, trække vævet.
    BEMÆRK: Det er tilrådeligt at orientere dorsale nethinden, så linsen og ganglion cellelag står dækglasset mens sclera vender opad.
  8. Fjern sclera fra den dorsale nethinden med et par # 5 pincet, mens du holder linsen, der er sluttet til nethinden med et andet par # 5 pincet (figur 1H, I).
  9. For at fjerne linsen, bruge McPherson-Vännäs saks og klippe bag linsen uden at beskadige nethinden (figur 1 l, J). Undertiden linsen adskiller i trin 4.7. I dette tilfælde, skal du fjerne sclera forsigtigt med en pincet ved at holde nethinden på et snit kant med et andet par af # 5 pincet.
  10. Fjern glaslegemet samtidig fjerne linsen uden at beskadige nethinden. Glat nethinden med ganglion cellelag vendende dækglassetaf fluorodish (fig 1L, M).
  11. Surround nethinden med 10 pi 1% agarose med lavt smeltepunkt og lad agarose størkne.
  12. Se, at den flydende agarose ikke løfter retina som selv en let forhøjelse kan påvirke evnen til at fokusere dybt ind i vævet. Hvis der observeres løft, brug en pipette til at fjerne agarose. Lad resterende agarose sæt, før du forsøger at tilføje mere.
  13. Gentag trin 4.12 flere gange før tilsætning af 1% agarose med lavt smeltepunkt til at dække hele fluorodish. Når agarosen er størknet, tilsættes 1,5 ml dyrkningsmedium.
  14. Fastholde retinal eksplantat kultur i en 5% CO2 / luft miljø indstillet ved 32 ° C i ca. 12 timer for at tillade nethinden at komme sig fra stress afholdt af isolation procedure. Indstil temperaturen til 32 ° C for at opretholde nethinder ved samme temperatur som lys-behandlede zebrafisk (se trin 2.3).

5. multifotonexcitation Microscopy

tabel Materialer), en 40X Apo langdistance nedsænkning i vand mål (NA 1,15), en galvanometer scanner og en miljøkammer, som indeholder et insert i fire 35 mm petriskåle. Billederne er erhvervet med en ikke-descanned detektor (R-NDD).

  1. Før billeddannelse, ækvilibrere miljøkammeret at opnå en 5% CO2 / luft atmosfære. Sørg for, at tomme petriskåle indsættes i holderen for at undgå udsivning af gas i rummet.
  2. Tænd mikroskopi systemet.
  3. Når den miljømæssige kammer er i ligevægt, tilsættes brydningsindeks væske på 40X Apo langdistance nedsænkning i vand mål (NA 1.15).
    BEMÆRK: Brydningsindekset væske med optiske egenskaber svarende til vand anvendes for at undgå fordampning af vand under langvarig billeddannelse.
  4. Place influenzaorodishes med retinal eksplantater ind i kammeret. Brug brightfield lys, placere prøven ind i strålegangen og bringe midterområdet af dorsale nethinden i fokusplanet.
  5. Brug GFP epifluorescerende lys at fokusere på GFAP: nGFP-positive Müller glia kerner (figur 2A, C).
    BEMÆRK: Hvis eksplantater ikke er monteret flad eller agarose akkumuleret under eksplantatet, vil det være vanskeligt at fokusere på GFAP: nGFP -positive kerner eller de vil fluorescerer svagt.
    1. Kontroller, om at flytte til en anden region i samme retinal eksplantatet vil overvinde fokus problemet. Ellers flytte til et andet retinal eksplantat.
  6. I købet billedet software, åbne 'A1 MP GUI ", den" TiPad ", den" A1 Compact GUI «og» ND erhvervelse "vinduer. For multifoton billeddannelse, at den »IR NDD '-tilvalget er valgt i" A1 Compact GUI'.
  7. I 'setting 'felt, skal du vælge IR-DM for 1. dichroic spejl og vælg båndpasfilter 525/50 at erhverve GFP-fluorescens.
  8. Tænd IR laser i vinduet mærket "A1MP GUI«. Det vil tage et par minutter for laser til at være klar. Indstil bølgelængden til 910 nm til ophidse GFP-fluorescens og justere laseren ved at klikke på knappen "Auto tilpasning 'i' A1 MP GUI 'vindue.
  9. Sørg for, at rum og udstyr lys er slukket eller dækket, før du åbner lukkeren i 'A1 MP GUI "for at undgå overeksponering af fotomultiplikatorrørets. For at reducere støjniveauet, huse mikroskopet i et mørkt miljø.
  10. Erhverve billeder af et synsfelt på 300 x 300 pixels, ved en zoom på to, og en pixel opholdstid på 4,8 mikrosekunder / pixel. Groft oprettet laser magt ved at ændre 'køb område' i 'A1MP GUI "og gevinsten i' A1 Compact GUI 'vindue.
  11. Opsætning af z-stack
    1. Fokus på ganglion cellelag at indstille det øverste fokalplan z-stakken i »Z'-undervindue i» ND erhvervelse 'vinduet. Nogle GFAP: nGFP -positive celler er typisk placeret i ganglion cellelag, som hjælper med at identificere den basale grænse af nethinden (figur 2A, D).
    2. Flyt fokale plan gennem det niveau af ONL (figur 2A, B), der er kendetegnet ved nærvær af svagt mærket GFAP: nGFP -positive celler, som er runde og forstørret i forhold til deres modparter i INL (figur 2A, C) .
    3. Indstil denne plan som bunden af ​​z-stakken. Sørg for, at hele ONL vil blive afbildet (figur 2A, B).
    4. Når oplever brændplan skift, der kræver re-regulerende i imaging periode, skal du dobbeltklikke på den midterste position i 'z' undervindue at tildele det som 'hjem' position. Skift til 'symmetrisk tilstand defineres'og klik på 'relativ'.
    5. Indstil z-trinstørrelsen mellem 0,7 til 1 um.
  12. Z-intensitet korrektion:
    1. Påfør z intensitet korrektioner til udligning af pixel intensitet skyldes lysspredning når billeddannelse i dybe lag af vævet.
    2. For at opsætte korrektion, åbne 'z-intensitet korrektion' vinduet. For at indstille "z-stack rækkevidde", vælg "Fra ND«.
    3. Klik på den nederste brændplanet i vinduet 'z-intensitet korrektion "(i dette tilfælde, svarer til ganglion cellelag) og indstille laseren intensitet (' køb område 'i' A1MP GUI) og gain (A1 Compact GUI ).
    4. Klik på pilen ud til 'z-værdier' ​​i 'z-intensitet korrektion "vinduet for at bekræfte indstillingerne, der efterfølgende vises under' enhedsindstillinger" i "z-intensitet korrektion 'vindue for den valgte brændplanet.
    5. Gentag processen for den midterste ennd top fly, stigende laser magt og vinding. Yderligere fokalplaner kan tilsættes om nødvendigt. Se tabel 1 for bestemte laser og gain indstillinger for eksperimenter i figur 2 - 4.
    6. Indstil 'køb område' i 'A1 MP GUI' vindue. Undgå at vælge en erhvervelse område større end 15 og en gevinst højere end 126 ved starten af ​​billeddannelse at omgå fotoblegning og forøget støjniveau.
      BEMÆRK: Som lasere og fotomultiplikatorrør variere mellem mikroskopi systemer, test laser og gain-indstillinger for at opnå optimale billeddiagnostiske betingelser for mikroskop sat op samtidig undgå fotoblegning.
    7. Vælg 'relative intensitet korrektion' i 'z-intensitet korrektion' vinduet.
  13. I "Timeseries 'undervindue i vinduet' ND erhvervelse«, indstille varigheden til 8 timer og intervallet til "ingen forsinkelse". Så sørg for at klikke på "Kør z-korrektion 'i than z-stack 'sub vindue i vinduet knappen' ND overtagelse "at erhverve de 3-D Timeseries.
  14. Oprethold retinale eksplantater ved en temperatur på 27 - 29 ° C under hele varigheden af ​​billedoptagelse.
  15. Hele billede erhvervelse periode, hvis det er nødvendigt, justere effektniveauet og forstærkning for at bevare billedkvaliteten for post-imaging analyse. For justeringer udføre trin 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Hvis brændplanet skift, pause eller stoppe kørslen og udføre trin 5.11 igen.
    BEMÆRK: Hvis "relative z-korrektion" blev valgt i trin 5.12.7 og trin 5.11.4 blev udført det burde ikke være nødvendigt at justere magt og gain-niveauer, med mindre omfattende fotoblegning indtraf.

6. Analyse af Velocity

  1. Ekstraher tid og fastsætter en 'region of interest' på billedet. Brug 'tidsmåling' værktøj og eksportere tidsværdier til et regneark.
  2. Beskære en region, der indeholder en dividing GFAP: nGFP -positiv kerne.
  3. Vælg den beskårne regionen, så den indeholder mindst én kerne, der ikke undergår INM for at sætte et referencepunkt for efterfølgende at måle afstande, skillelinjen kerne migrerede i forhold til det basale INL. BEMÆRK: Hvis du vil vælge en kerne, der forbliver i den basale INL, hjælper det at forberede en 3-D rekonstruktion af Timeseries.
  4. Alternativt, hvis en GFAP: iagttages nGFP -positiv celle i ONL hele erhvervelse periode anvende en lodret linie af fast længde spænder fra ONL kerne til det basale INL for at identificere et referencepunkt.
  5. Ved hjælp af 'show skiver udsigt' funktion, generere ortogonale projektioner. Efterfølgende ændre tilstanden fra "skive" til "maksimal intensitet projektion '.
  6. Sluk "xy" billede af den ortogonale maksimale projektion. Afhængigt af orienteringen ved hvilken migrerende / dividere kerne er bedst synlig, enLSO slukke enten 'xz'- eller' yz'-view.
  7. Klik på den resterende billedet med højre museknap og udtrække "xz" eller "yz'-image serie med 'Opret nyt dokument fra dette synspunkt' funktion. Hvis det er nødvendigt, rotere billedet.
  8. Ved hjælp af 'manuel måling' funktion, tegne en vandret linje på tværs af billedet nederst niveau af kernen, der forbliver i den basale INL og ikke undergår INM (= referencepunkt; figur 4A - E, red vandrette linje).
  9. Måle afstanden mellem referencelinjen og den basale punkt af migrerende nucleus for Timeseries ved hjælp af "line måling" værktøj i analysen software (se figur 4A - E).
  10. Når kernekappen bryder ned, måle basal position af soma hvis det er identificerbart efter diffusionen af ​​GFP i hele cellen.
  11. Ved hjælp af et regneark software, plotte den afstand, en nucleus migreret mod tiden gik (Figur 4F).
    1. For at bestemme den apikale migration hastighed (v a), graf afstandene rejste for perioden før nukleare kuvert opdeling forekommer (figur 4G).
    2. Vælg den dataserie i diagrammet, højreklikke på musen og indsætte en lineær regression kurve herunder den tilsvarende funktion y = mx + c '. Hældningen »m« i funktionen repræsenterer hastigheden, v en (figur 4G).
    3. Gentag trin 6.11.1 og 6.11.2 for den første fase af hurtig basal migration at bestemme den basale migrering hastighed, Vb (Figur 4H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isoleringen af nethinden ifølge fremgangsmåden angivet i diagrammet i figur 1 muliggør dyrkning af en fladtrykt dorsal nethinden fra lysskadede voksen Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk over en periode på mindst 24 timer i en CO 5% 2 / luft. Disse faste monterede retinale eksplantater kan anvendes til at afbilde brændplaner på dybe vævsniveauer. Et eksempel er Müller glia / neuronale stamceller kerner mærket med GFP fra Müller glia-specifik promotor GFAP (glial fibrillært surt protein), der er placeret i ONL under mitose i lysskadede retina (figur 2A - D, 3). For yderligere at bekræfte, at denne tilgang kan anvendes på billedet af de forskellige retinale cellelag, blev akut isolerede retinale eksplantater fremstillet af ubeskadiget Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebrafisk øjne, der udtrykker EGFP i stang fotoreceptorer underrhodopsin promotoren. Figur 2E - H viser, at det er muligt at erhverve billeder af GFP-positive stang fotoreceptor og deres indre segmenter. Som stang indre segmenter strækker sig mellem kegle fotoreceptorer mod nethindepigmentepitelet ville disse data antyder, at det også er muligt at afbilde kegle fotoreceptorer. Dette var dog ikke undersøgt yderligere.

Have observeret Müller glia / neuronale stamceller kerner i ONL i lyset-beskadigede nethinden, vi karakteriseret deres vandrende adfærd i detaljer (Figur 3 og Movie 1). Müller glia / neuronale progenitor cellekerner mærket med GFP migrere tovejs mellem den basale position af INL hvor de typisk bor og ONL, stedet for fotoreceptor tab. Typisk GFAP: nGFP -positive kerner migreret en kort afstand i INL (figur 3A - C), før de undergikopdeling nuklear kappe, mens den stadig placeret i INL, baseret på omfordeling af GFP ind i cytoplasmaet af hele Müller glia / neuronal progenitorcelle (figur 3D). Efter celledeling i ONL, to GFAP: nGFP -positive kerner blev synlige i ONL (figur 3F, G), der vendte tilbage til det basale INL (figur 3H - J). Ved celledeling, de nyligt opstået kerner var oprindeligt meget svagt, og derfor vanskeligt at identificere (Figur 3G). Men inden for en til to tidsrammer efter mitose, nuklear GFP-fluorescens blev lyse, hvilket gjorde det muligt for visualisering af nukleare migration (figur 3H - J). Live-cell imaging tillod også visualisering af inddelingen plan (figur 3F, G), som forekom vandret til den apikale overflade af nethinden for cellen vist i figur 3. Det er også muligt at bruge andre transgene zebrafisk linjer sådannesom Tg [GFAP: EGFP] NT11 zebrafisk, der udtrykker GFP i cytoplasmaet (data ikke vist). Selv om det er muligt at foretage en pålidelig vurdering apikal bevægelse og horisontale celledelinger, er det ofte vanskeligt nøjagtigt at identificere positionen af basalt migrerende datter kerner og vertikale celledelinger i Tg [GFAP: EGFP] NT11 zebrafisk nethinden (data ikke vist).

For at bestemme hastigheden, en GFAP: blev nGFP -positiv kerne, der ikke migrere hele optageperioden valgt som referencepunkt (stjerne, figur 4A - E). Afstanden til vandrende kerne (lodret rød linje, figur 4A - E) blev bestemt i forhold til referencen GFAP: nGFP -positiv kerne (vandret rød linie, figur 4A - E) ved hvert tidspunkt af billedet serien på maksimal xz eller YZ-projektioner (afhængigt på hvilken vinkel kernerne kunne være visualized mest effektivt). Afstanden at kernen migrerede blev afbildet mod tiden i et regneark (Figur 4F - H). opdeling kernemembranen blev ofte observeret i grafen som en indledende basalward bevægelse på grund af omfordeling af GFP i hele cellen (basal meste af cellen organ i dette tilfælde). Den apikale hastighed blev bestemt før nukleare kuvert sammenbrud, montering en lineær regression kurve (grå stiplet linje, figur 4G) til afstanden afbildes mod tiden for perioden før sammenbrud nukleare kuvert (rød diamant, figur 4G). Hældningen »m« for den lineære regression kurve (y = mx + c) repræsenterer hastigheden 'dx / dt «. Den apikale hastighed for cellen vist i figur 4 var 10,89 um / time. Den samme fremgangsmåde blev anvendt til at beregne hastigheden af initiale hurtige basal bevægelse (v b) af den nyligt dannede datter kerner (figur 4F, H). Den basale migration hastigheder v b fra -67,71 og 33.51 gm / time datterceller D1 og D2 henholdsvis var sammenligneligt hurtigere end den apikale hastighed. Desværre var det ikke muligt at bestemme den apikale hastighed efter opdeling nukleare kuvert som GFP spredt i hele cellen. I stedet blev den øjeblikkelige hastighed beregnet baseret på timingen og position af kernen før opdeling nuklear kappe og den første visualisering af de nydannede datter kerner. Den øjeblikkelige hastighed på 7,9 um / time for cellen vist i figur 4 er sandsynligvis en undervurdering som kromatin når ONL før telofase af mitose, når datter kerner bliver synlige.

For at opsummere, kulturen af ​​retinale eksplanteret tillader live-cell imaging af INM i den voksne regenerere zebrafisk nethinden og bestemmelse af migration og celledeling parametre enkelte kerner.

figur 1
Figur 1: Retinal Isolation Procedure. A) Skematisk illustration af en zebrafisk hoved med øjet. B) Øjet fjernes fra zebrafisk og orienteret til at vise den forreste del af øjet med eleven. C) Drej øjet 180 °, således at bagsiden af øjet med den optiske stilk (udfyldt sort cirkel) bliver synlig i (D) og eleven vender nedad. Den grå farve viser tilstedeværelsen af ​​sclera af øjet. E) En blad af et par McPherson-Vännäs saks indsættes i den optiske stilk af øjet (udfyldt sort cirkel) for at skære det i sin dorsale og ventrale sider, der er angivet ved den hvide segmenteret linje. F) Dorsal halvdel af øjet efter den ventrale halvdel blev fjernet. Den sorte halv cirkel angiver than resterende del af den optiske stilk. G) Drej øjet 90 ° tilbage for at afsløre (H) indersiden af øjet med nethinden (brun), glaslegemet (ikke vist) og linsen (L, lysegrå cirkel), der stadig omsluttet af sclera (grå linie ). I) Sclera blev fritliggende (bemærk, er grå linje mangler) og J) linsen og glaslegemet fjernet giver anledning til kun nethinden (brun). K) Retina drejet 90 ° frem giver anledning til en flad-mount billede af dorsale nethinden (L). M) Dorsal retinal eksplantat fladskærms-monteret på en glas-bund fluorodish. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: 3-D Rekonstruktion afRetinal multifotonexcitation Z-stakke. A) 3-D rekonstruktion af et multifoton z-stak billede serie af GFAP: nGFP- positive celler i retinale hel-mount kulturer fra zebrafisk efter 48 timers lys-skader. B - D) Single multifoton xy-billeder af GFAP: nGFP -positive celler vises i 3D-rekonstruktion i (A) på niveau med den ONL (B), INL (C), som svarer til lag, der indeholder Müller glia soma og GCL (D). Pil i (B) angiver et forstørret runde Müller glia i ONL efter opdeling nuklear kappe. E) 3-D rekonstruktion af en multifoton z-stak billedserier af en retinal eksplantat fra en ubeskadiget Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebrafisk. F - H) Enkeltværelse multifoton xy-billeder på niveau med stangen indre segmenter (RIS, F), stang nukleare lag (G) Og på niveau med den indre nethinde (H). GCL, gangliecelle Layer; INL, Indre Nuclear Layer; ONL, Ydre Nuclear Layer; RIS, Rod Inner Segment. Scale bar i A, D, E og H, 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Timelapse Billede Series of INM. A - J) Billede serie af 3D-rekonstruktion af z-stack timelapse serie viser Tg [GFAP: nGFP] mi2004 -positive kerner som undergår INM at opdele i ONL i retinale eksplantater (øverste række). Positionen af ​​en apikalt at migrere kerne og dens basalt migrerende datter kerner er angivet med røde pile. Rød stjerne angiver nukleare kuvert sammenbrud under mitose. A - J, nederste række) Densamme billede serie som i den øverste række var overmættede og beskåret at fokusere på de delende celler i ONL. INL, Indre Nuclear Layer; IPL, Indre PLEXIFORM Layer; ONL, Udvendigt Nuclear Layer. Skala bar i A, 10 um og er den samme for B - J. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Analyse af apikale og Basal Migration Hastigheder. A - E) Maksimal yz-projektion af en z-stak billedserier af Tg [GFAP: nGFP] mi2004 retinale eksplantater på forskellige tidspunkter af timelapse optagelse erhvervet af multi-foton mikroskopi. Brug af linje værktøj under "manuel måling" -funktion, blev en vandret linie placeret på niveauet for referencecellen, angivet med en stjerne. En lodret migasurement linje var placeret starter ved den vandrette linje, og strækker sig til den basale position vandrende GFAP: nGFP -positiv kerne. Længden af ​​målingen linje er givet i de hvide kasser på billederne og for læsbarhed under billederne. L1 = længde, dattercelle 1 migreret; L2 = længde, datter celle 2 migreret. F) Afstand at cellen (F0) målt i (A - E) migrerede apikalt og at der opstår datterceller D1 og D2 migrerede basalt i multifoton timelapse optagelse. Den røde linje angiver målingerne, som apikale migration hastighed (v a) blev beregnet, mens de sorte og grå linjer angiver de målinger, der anvendes til at beregne de basale hastigheder migration (v b) for D1 og D2 henholdsvis. G, H) Afstanden blev plottet mod tiden i Excel til apikal migration før nukleare kuvert opdeling (G) og den fase af hurtig basalmigration til datter celle D1 (H). Lineær regression blev fittet og funktioner er anført nedenfor graferne med hældningen repræsenterer hastigheden. INL, Indre Nuclear Layer; IPL, Indre PLEXIFORM lag; ONL, Udvendigt Nuclear Layer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tg [GFAP: EGFP] NT11 Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19
lasereffekt gevinst lasereffekt gevinst
Top (stang fotoreceptor) 13 126 3,5 118 Mellemøsten (Müller glia) 10 126 2.8 118
Bund (GCL) 8 126 2.1 118

Tabel 1: Laser og Gain Niveauer Bruges til Z intensitet Rettelser på forskellige planer for forsøg vises i figur 2 - 4.

Figur 2
Movie 1: Levende-celle Imaging af retinale Eksplantater ved multifoton Microscopy. (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Undersøgelser undersøger de mekanismer for regenerering af beskadigede voksne zebrafisk nethinden overvejende brugte immuncytokemiske metoder 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Etablering betingelser til kultur retinale eksplantater og til at udføre live-cell imaging på fænomener, såsom INM, giver os en teknik til at opnå i dybden rumlige og tidsmæssige oplysninger. Denne teknik gør det muligt at bestemme migrationen hastigheder, timing og placering af sammenbrud nuklear kappe under profase af mitose og længden og placeringen af ​​celledeling. Desuden er det muligt at etablere opdelingen plan og skæbnen for de opstår datterceller med hensyn til deres efterfølgende placering. I sidste ende vil dette stærke tilgang afgøre, om M2; ller glia og neuronale stamceller opfører sig anderledes med hensyn til INM under retinal regenerering. Anvendelsen af transgene zebrafisk linjer, der identificerer prolifererende celler i regenererende retina i særskilte trin af regenerering respons vil hjælpe dechifrere forskellen adfærd 6. I tilfælde af multifoton mikroskop anvendes her, er GFP reporter zebrafisk linjer foretrækkes som excitation af Red Fluorescent Protein (RFP) er ikke særlig effektiv; dog kan andre multifotonexcitation systemer tillader effektiv excitation af RFP eller tilsvarende fluoroforer.

En af de mest kritiske trin i retinal isolation procedure montering af nethinden. Nethinder skal monteres så flad som muligt for multifoton lys for at kunne passere til de dybere z-niveauer i ONL. Krumning af retina især i den marginale region, residual glaslegemet, og / eller akkumulering af agarose under retinal kultur, som anvendes til at immobiliserevæv, mest almindeligt indføre ekstra plads mellem dækglasset og retinal kultur. Derudover steg lasereffekt og forstærkning skal anvendes til at erhverve billeder, hvis nethinden er ikke flad, og dette vil derfor medføre øgede fotoblegning og reduceret levedygtighed retinal kultur. Forkert montering ofte også resulterer i dårligere billedkvalitet på grund af reduceret lysgennemtrængning og vil påvirke evnen til at måle afstande, kerner havde migreret, og derfor beregningen af ​​migration hastigheder.

De hastigheder apikal migration før opdeling nukleare kuvert og for basal migration kan opgøres pålideligt i et billede serie fra Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk retinale eksplantater. Imidlertid er det i øjeblikket ikke muligt at bestemme hastigheden af ​​apikale vandring af kromatin efter cellekernekappen opdeling i denne transgene zebrafisk linje som GFP re-distribuerer i hele cytoplasmaet. Labeling af retinale eksplantater med nukleare farvestof Hoechst resulterede i dim optagelse i Müller glia kerner, der krævede ændringen i bølgelængden til 830 nm (Lahne & Hyde, upubliceret data), hvilket påvirkede levedygtighed af vævet og forårsagede blokering af cellecyklussen ( Lahne & Hyde, upublicerede data). Under retinal udvikling, Tg [h2afva: h2afva-GFP] har kca6 zebrafisk, der udtrykker GFP fusioneret til histon 2 med succes blevet brugt til at overvåge INM og bestemme migration hastigheder på de forskellige stadier af cellens cyklus 12, 31. I fremtiden retinale eksplantater fra Tg [h2afva: h2afva-GFP] vil kca6 zebrafisk også muliggøre visualisering af kromatin hele cellecyklus og vil tillade analysen af den apikale migration hastighed efter opdeling kernemembranen i den voksne regenererende zebrafisk nethinden.

Efter at have konstateret betingelserne for at overvåge INM aflive-cell imaging i retinale eksplanteret fra lys-beskadigede voksne zebrafisk og den tilsvarende analyse af hastigheder vil danne grundlag for at undersøge de mekanismer, der gælder INM. Nogle undersøgelser begyndte at undersøge mekanismerne i INM i den voksne regenerere retina ved anvendelse immuncytokemi at bestemme positionen af mitotisk phospho-histon 3-positive kerner 6, 7. Men forstyrre signalveje kan ikke gøre stilling mitose, men kan påvirke andre parametre som hastighed, timing af mitose og division, som ikke ville være muligt / meget vanskeligt at skelne fra immunocytokemi. Tidligere blev det vist, at phospho-histon 3-positive mitotiske kerner mislocalized til mere basale positioner i udviklingslandene nethinden i dynactin mutanter og morphants 11. viste imidlertid, efterfølgende live-cell imaging at nuklear migration før celledeling blev forsinket i dynactin-kompromitteret celles, mens en forøget apikal migrering hastighed aktiveret kerner til at nå og at undergå celledeling på den apikale overflade 11, 12. Dette eksempel eksemplificerer magt live-cell imaging. Tilsvarende, når optrevling de mekanismer, der letter INM i den voksne regenerere zebrafisk nethinden, vil levende celle billeddiagnostiske undersøgelser supplerer, og i forskellige tilfælde vil være en fordel i, immuncytokemiske tilgange.

Som diskuteret ovenfor, live-cell imaging giver mange fordele i forhold til immunohistokemiske / statiske metoder; imidlertid skal det erindres, at retinale eksplantater er en ex vivo model. Som sådan skade afholdt i isolation procedure og / eller dyrkningsbetingelser kan påvirke cellulære processer. Derudover kan den billeddannende selve proceduren udøve toksiske virkninger, der kan påvirke cellulær adfærd 23, 32. Mens der er disadvantages at leve-cell imaging af retinale kulturer, er det i øjeblikket vores bedste metode til at opnå dynamisk information af INM. Vigtigt er det, vil den levende celle procedure af retinale eksplantater imaging gælde for andre biologiske spørgsmål under retinal regenerering. Baseret på immuncytokemiske data blev det tidligere foreslået, at Müller glia fagocyterer døende fotoreceptorer / snavs efter lysinduceret fotoreceptor skade 33. Justering parametre af billedet denne proces levende kontrollerer hvis fagocytose af døende fotoreceptorer forekommer i regenererende zebrafisk nethinden og kan anvendes til at undersøge de underliggende mekanismer. Efter at have vist, at billeder kan erhverves på niveau med stangen kerner og stang indre segmenter i Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebrafisk, bør det være muligt at tilpasse betingelserne for billedet fotoreceptor fagocytose. Tilsvarende viden er begrænset med hensyn til dynamiske opførsel mikroglia og mekanismerne for deresfunktion i udarter og regenererende retina 34, 35. Udnyttelse mikroglia-specifikke transgene zebrafisk sammenholdt med live-cell imaging vil også øge vores forståelse af funktionen af mikroglia i den voksne regenererer zebrafisk nethinden 36, 37. For at opsummere, live-cell imaging af retinale eksplantater er et effektivt værktøj til at opnå dynamisk information af cellulære processer og at bestemme adfærd og funktion af forskellige celletyper i regenererende nethinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi sætter pris på den støtte, som William Archer og Notre Dame Integrated Imaging Facility. En særlig tak rettes til Freimann Life Sciences teknikere for deres fortsatte hjælp og deres pleje og opdræt af zebrafisk. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Eye Institute of NIH til DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) og Center for zebrafisk Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

Tags

Developmental Biology retinal eksplantat multifoton mikroskopi live-cell imaging zebrafisk interkinetic nukleare migration kultur regenerering Müller glia mitose hastighed
Culture of Adult transgene zebrafisk Retinal Eksplantater til Live-celle Imaging af multifoton Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter