Summary
Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.
Abstract
Een endogeen regeneratie programma is geïnitieerd door Müller glia in de volwassen zebravissen (Danio rerio) retina volgende neuronale schade en de dood. De Müller glia opnieuw in te voeren de celcyclus en produceren van neuronale voorlopercellen die volgende rondes van celdelingen ondergaan en differentiëren in de verloren neuronale celtypen. Zowel Müller glia en neuronale voorlopercellen celkernen repliceren hun DNA en ondergaat mitose in verschillende locaties van het netvlies, dat wil zeggen ze migreren tussen de basale Inner kernlaag (INL) en de buitenste nucleaire laag (ONL), respectievelijk in een werkwijze genaamd Interkinetic Nuclear Migratie (INM). INM is voornamelijk bestudeerd in de ontwikkelende retina. Om de dynamiek van INM in de volwassen zebravissen netvlies regenereren in detail te onderzoeken, is voor live-cell imaging van fluorescent-gelabelde Müller glia / neuronale voorlopercellen nodig. Hier bieden we de voorwaarden te isoleren en cultuur dorsale netvliezenvan Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis die werden blootgesteld aan een constante intens licht voor 35 uur. We tonen ook dat deze retinale culturen levensvatbaar live-cell imaging experimenten, continu verwerven z-stack beelden over de dikte van het netvlies explantaat tot 8 h en multifoton microscopie het migrerende gedrag van GFAP controleren: nGFP -positieve cellen . Daarnaast beschrijven we de gegevens om na de beeldvorming uit te voeren om de snelheid van apicale en basale INM bepalen. Om samen te vatten, hebben we voorwaarden aan de dynamiek van INM in een naaktmodel van neuronale regeneratie te bestuderen. Dit zal ons begrip van deze cruciale cellulaire proces te bevorderen en ons toelaten om de mechanismen die INM controle te bepalen.
Introduction
In tegenstelling tot mensen, de zebravis (Danio rerio) vertonen een robuuste regeneratie reactie op de celdood van retinale neuronen 1, 2, 3, 4. Tumor necrosis factor α, een signaalmolecuul dat vrijkomt uit stervende retinale neuronen induceert Müller glia die in de basale Inner kernlaag (INL) van het netvlies, te prolifereren 5 en produceren neuronale progenitorcellen die blijven prolifereren vóór differentiëren in de neuronale cel soorten die stierven 2, 3, 4. Tijdens de proliferatieve fase van de regeneratie respons, de kernen van Müller glia en daarvan afgeleide neuronale progenitorcellen ondergaan een zich herhalend patroon in trekkende fase van de celcyclus (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 >, 7. Kernen gepositioneerd in de basale INL repliceren hun DNA vóór de migratie naar de Outer Nuclear Layer (ONL) waar ze verdelen vóór het ontstaan kernen basaal terug te keren naar het INL. Deze werkwijze werd voor het eerst beschreven in neuro-ontwikkeling met behulp van histologische methoden, terwijl levende cellen beeldvormingsbenaderingen later de uitlegging steun Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Zowel histochemische en live-cell imaging benaderingen zijn gebruikt om mechanismen verantwoordelijk INM en zijn functie in de ontwikkeling neuroepithelia waaronder het netvlies 9, 11, 12, 13 bepalen. Echter, de mechanismen die INM in de volwassen regenererende netvlies zijn niet onderzocht in veel detailxref "> 6, 7. live-cell imaging zal een waardevolle benadering van onze kennis van de signaalwegen die INM controle in de volwassen regenererende netvlies vooruit zijn.
Tot voor kort levende cellen beeldvorming van INM in het netvlies is beperkt tot of levende zebravis embryo's of embryonale kuiken of postnatale muizen netvlies explantaten 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Terwijl netvlies explantaten van volwassen dieren van verschillende soorten, waaronder muizen, ratten en zebravis zijn gebruikt voor verschillende celbiologische benaderingen 17, 18, 19, 20, live-cell imaging experimenten met retinale explantaten have beperkt tot periodes kort en hebben niet continu gedurende enkele uren 21, 22 is uitgevoerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om de cultuur-licht beschadigd volwassen zebravissen netvlies live-cell imaging experimenten toezicht INM te voeren met behulp van multi-foton microscopie 6. Live-cell imaging benaderingen zijn gunstig ten opzichte van immunohistochemische methoden bij het onderzoek naar de mechanismen die INM, als de dynamiek van INM, bijvoorbeeld snelheden kunnen worden getroffen in plaats van de locatie van de mitose, dat zou mogelijk niet worden gedetecteerd met behulp van immunocytochemie.
In de toekomst, deze werkwijze heeft ook het potentieel om te worden aangepast aan andere dynamische processen tijdens het netvlies regeneratie, zoals fagocytose sterven fotoreceptoren Muller glia of het gedrag van microglia bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: zebravis zijn gerezen en onderhouden in de Notre Dame zebravis faciliteit in de Freimann Life Sciences Center. De in dit manuscript beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Universiteit van Notre Dame Animal Care en gebruik Comite en zijn in overeenstemming met de verklaring voor het gebruik van dieren in een visioen onderzoek door de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde.
1. Oplossingen
- Bereid 70% ethanol aan de weefselkweek kap en alle apparatuur / reagentia die worden overgebracht in de weefselkweek kap steriliseren.
- Voeg 2 ml 2-fenoxyethanol tot 1 L van het systeem water (1: 500 2-fenoxyethanol).
- Bereid 0,1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Gebruik een 10 ml spuit en een 0,2 urn poriegrootte spuitfilter aan de oplossing in een steriele weefselkweek kap steriliseren.
LET OP: NaHCO3 wordt gebruikt om efficiënt te verspreiden van de cellen en weefsels lijm over het dekglaasje oppervlak van fluorodishes (ziestap 3.2). - Bereid 1,0 M CaCl2 en 1,0 M MgCl2. Steriliseren met een 10 ml spuit en 0,2 urn poriegrootte spuitfilter gesteriliseerd in een weefselkweek kap.
- Ter voorbereiding Hank's-gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), voeg steriele CaCl2 en MgCl2 tot steriele 1x HBSS zonder Ca2 + / Mg2 +, zonder fenolrood bij een uiteindelijke concentratie van 1 mM elk. Werken in een steriele omgeving.
- Om kweekmedium te bereiden, meng 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) zonder fenol rood, 25% HBSS met CaCl2 en MgCl2 (zie paragraaf 1.4), 25% paardenserum (HS), 10 eenheden / ml penicilline, en 10 ug / ml streptomycine. Werken in een steriele omgeving.
LET OP: Vermijd medium dat fenolrood als het autofluoresces, waardoor signaal-ruis verhouding van invloed zijn. 23 - Bereid 10 ml van 1% laag smeltpunt agarose in 1x MEM zonder fenol rood. Smelt agarose / 1x MEM met behulp van een Microwave. Bereid kleine hoeveelheden agarose (bijvoorbeeld 10 ml) repetitieve opwarmen zal ionenconcentratie door vocht verdampen veranderen.
- Vóór het kweken steriliseren 1,5 ml microcentrifugebuizen autoclaaf.
2. Licht-schade Paradigm
- Dark-adaptatie
- Plaats 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis (of andere transgene zebravis of interest) bij 6-14 maanden oud in een omgeving zonder licht voor 14 d. Zie referentie 2, 6, 24, 25 voor verdere details.
- Plaats de tank met 2-3-dark aangepast transgene zebravis in het systeem water tussen twee TL-lampen die licht van 2800 lux 2, 6, 24, 25 uit te stoten. Expose zebravis constante intens licht voor 35 uur. Tijdens de blootstelling aan licht, verzekeren dat de temperatuur van het water wordt gehouden tussen 31-33 ° C.
3. Voorbereiding voor het kweken van (Op de Dag van de Retina Isolation)
- Met behulp van 70% ethanol, steriliseren de weefselkweek kap en de onderdelen / gereedschappen die worden overgebracht in de weefselkweek kap (bijvoorbeeld kolven met MEM en HBSS, pipetten, steriele pipet tips, enz.).
- Bereiding van fluorodishes
- Coat één fluorodish voor elke retina met cellen en weefsels lijm (zie tabel of Materials).
- Verdun de cellen en weefsels lijm 0,1 mM NaHCO 3 een eindconcentratie van 70 ug / ml, voeg 50 ul aan elk fluorodish en verspreid de oplossing over het midden van de fluorodish met 200 pi pipetpunt (ongeveer 1-1,2 cm diameter ).
- Incubeer de beklede fluorodishes gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur; (Alternatief, uitbroeden O / N bij 4 ° C).
- Verwijder de oplossing en spoel 3x met 500 ul van 1 x MEM voor elke wasbeurt. Om de gecoate fluorodishes uitdrogen te voorkomen, houden ze in MEM totdat netvlies explantaten zijn gemonteerd.
- Bereid kweekmedium zoals beschreven in stap 1.6. Het kweekmedium kan worden opgeslagen gedurende 1 week bij 4 ° C.
4. Isolatie en kweken van retinale explantaten
OPMERKING: Het protocol is hieronder beschreven voor de isolatie van de dorsale netvlies, de retina regio die hoofdzakelijk wordt door de laesie beschreven licht-schade paradigma. Derhalve-schade geïnduceerde proliferatie en de bijbehorende Bij interkinetic nucleaire migratie optreden in de dorsale netvlies. Echter, de isolatie procedure ingesteld netvlies regio bereid volgens de specifieke eisen van de onderzoeker / vraagstelling.
- Euthanaseren een licht beschadigde transgene zebravis eenta tijd in 1: 500 2-fenoxyethanol.
- MEM verwijderen uit een fluorodish met 1000 pi pipet zodat slechts een dunne film van vloeibaar blijft.
- Breng de zebravis op een droge papieren handdoek, verwijder het oog met een gebogen paar Dumont pincet (pincet # 5, hoek van 45 °) en breng het op de fluorodish.
- Met behulp van een stereomicroscoop, oriënteren het oog met de pupil op het dekglas van de fluorodish zodat de achterkant van het oog met de oogzenuw zichtbaar (figuur 1D).
- Met een paar McPherson-Vannas schaar verwijder de oogzenuw, snoeien dicht bij de achterkant van het oog. Bovendien, verwijdert bindweefsel langs de buitenkant van het oog.
- Houd het oog tussen de nasale en temporale zijde met een paar # 5 tang tijdens het maken van een snede in de optische steel door doorboren met één schaarblad door de lamina cribrosa en snijden langs zowel de nasale en temporale zijde van het oog (zie figuur 1E , gesegmenteerde line).
- Met behulp van twee paren van # 5 tang, één voor het vasthouden van de dorsale zijde van de retina en het andere paar op de ventrale scheiden van de dorsale netvlies, trekt het weefsel.
LET OP: Het is raadzaam om de dorsale netvlies oriënteren, zodat de lens en de ganglion cellaag het gezicht van de dekglaasje terwijl de sclera naar boven wordt geconfronteerd. - Verwijder de sclera uit de dorsale netvlies met een paar van # 5 tang, terwijl de lens die is verbonden met de retina met een tweede paar van # 5 tang (Figuur 1H, I).
- Om de lens te verwijderen, gebruikt McPherson-Vannas schaar en achter de lens te snijden zonder beschadiging van het netvlies (figuur 1 I, J). Soms is de lens scheidt in stap 4,7. In dit geval verwijdert de sclera voorzichtig met een tang die door het netvlies een snijrand met een tweede paar van # 5 tang.
- Verwijder het glasvocht tijdens het verwijderen van de lens zonder beschadiging van de retina. Plat het netvlies met de ganglion cellaag geconfronteerd met het deksel slipvan de fluorodish (figuur 1L, M).
- Omring het netvlies met 10 pl van 1% laag smeltpunt agarose en laat de agarose stollen.
- Let dat de vloeistof agarose het netvlies niet opneemt als ook een geringe verhoging kan het vermogen om diep concentreren in het weefsel beïnvloedt. Als tillen wordt waargenomen, gebruik dan een pipet agarose te verwijderen. Laat resterende agarose set voordat u meer toe te voegen.
- Herhaal stap 4.12 meerdere malen voor het toevoegen van 1% laag smeltpunt agarose om de hele fluorodish dekken. Nadat de agarose is gestold, voeg 1,5 ml kweekmedium.
- Handhaaf de retinale explantaatkweek in een 5% CO2 / lucht milieu ingesteld op 32 ° C gedurende ongeveer 12 uur om de retina te herstellen van de stress die de isolatiewerkwijze. Stel de temperatuur tot 32 ° C te netvliezen bij dezelfde temperatuur als het licht behandeld zebravis handhaven (zie stap 2.3).
5. Multiphoton Microscopie
Tabel Materials), een 40X Apo interlokale water immersie objectief (NA 1,15), een galvanometer scanner en een klimaatkamer dat een insert van vier 35 mm petrischalen bevat. De beelden werden verkregen met een niet-descanned detector (R-NDD).
- Voorafgaand aan beeldvorming evenwicht de klimaatkamer een 5% CO2 / lucht atmosfeer te komen. Zorg ervoor dat lege petrischaaltjes in de houder worden geplaatst om lekkage van gas in de kamer te vermijden.
- Schakel het microscopiesysteem.
- Zodra de klimaatkamer wordt in evenwicht gebracht, voeg brekingsindex vloeistof op het 40X Apo lange afstand water immersie objectief (NA 1.15).
OPMERKING: De brekingsindex vloeistof met optische eigenschappen vergelijkbaar met water wordt de verdamping van water tijdens langdurige imaging voorkomen. - plaats grieporodishes met retinale explantaten in de kamer. Met behulp van helderveld licht, de positie van het monster in het lichtpad en breng de middenregio van de dorsale netvlies in het vlak van focus.
- Met GFP epifluorescerende licht te concentreren op GFAP: nGFP -positieve Müller glia kernen (Figuur 2A, C).
LET OP: Als explantaten niet plat zijn of agarose opgehoopt onder de explantatie zijn gemonteerd, zal het moeilijk zijn om zich te concentreren op de GFAP: nGFP-positieve kernen of ze zullen vaag fluoresceren.- Controleer of verhuizen naar een andere regio binnen dezelfde retinale explantatie zal de focus probleem te overwinnen. Anders naar een andere netvlies explantaat.
- In de afbeelding acquisitie software, opent u de 'A1 MP GUI', de 'TiPad', de 'A1 Compact GUI' en de 'ND overname' ramen. Voor multiphoton imaging, ervoor te zorgen dat de optie 'IR NDD' is gekozen in de 'A1 Compact GUI'.
- In de 'setting 'veld, selecteert u IR-DM voor de 1 e dichroïsche spiegel en kies de band pass filter 525/50 om GFP fluorescentie te verwerven.
- Schakel de IR-laser in het venster label 'A1MP GUI'. Het zal een paar minuten duren voordat de laser klaar te zijn. Stel de golflengte van 910 nm tot GFP fluorescentie prikkelen en lijn de laser door op de 'Auto alignment' knop in het venster 'A1 MP GUI'.
- Zorg ervoor dat de ruimte en apparatuur verlichting zijn uitgeschakeld of bedekt vóór het openen van de sluiter in de 'A1 MP GUI' om overbelichting van de fotomultiplicator buis te voorkomen. Om geluidsoverlast te beperken, het huis van de microscoop in een donkere omgeving.
- Acquire beelden van een gezichtsveld van 300 x 300 pixels, met een zoom van twee en een pixel verblijftijd van 4,8 ps / pixel. Ruwweg het opzetten van de laser macht door het veranderen van de 'overname gebied' in de 'A1MP GUI en de winst in het venster' A1 Compact GUI '.
- Instellen van de z-stack
- Focus op de ganglion cellaag aan de top brandvlak van de z-stack in de set 'Z'-deelvenster in het' window ND overname '. Aantal GFAP: nGFP -positieve cellen bevinden zich gewoonlijk in het ganglion cellaag, waardoor de basale beperking van de retina (Figuur 2A, D) te identificeren.
- Beweeg het brandvlak door het niveau van de ONL (Figuur 2A, B), die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van zwak gelabeld GFAP: nGFP -positieve cellen die zijn rond en vergroot ten opzichte van hun tegenhangers in de INL (Figuur 2A, C) .
- Stel dit vlak als de onderkant van de z-stack. Zorg ervoor dat de gehele ONL zal worden afgebeeld (Figuur 2A, B).
- Als ze last hebben focal plane verschuivingen die vereisen opnieuw aanpassen tijdens de beeldvorming periode, dubbelklikt u op de middelste positie in de 'z' subwindow toe te wijzen als 'thuis' positie. Wissel naar 'symmetrische wijze gedefinieerd'en klik op 'relatief'.
- De grootte z-stap tussen 0,7 tot 1 pm.
- Z-intensiteit correctie:
- Solliciteer z-intensiteit correcties om te compenseren voor het verlies van pixel intensiteit als gevolg van lichtverstrooiing bij beeldvorming in diepe lagen van het weefsel.
- Voor het instellen van de correctie, opent u het venster 'z-intensiteit correctie'. Om de 'z-stack range', kies 'Uit ND' in te stellen.
- Op de bodem brandpuntsvlak het venster 'z-intensiteit correction' (in dit geval overeen met de ganglion cellaag) en stel de laserintensiteit ( 'aankoop oppervlakte in de' A1MP GUI ") en versterking (A1 Compact GUI ).
- Klik op de pijl naast het 'z-waarden' in het venster 'z-intensiteit correctie' om de instellingen die vervolgens onder 'apparaat instellingen' in het venster 'z-intensiteit correctie' voor de gekozen focal plane worden getoond bevestigen.
- Herhaal deze procedure voor het midden eennd top vliegtuigen, het verhogen van het laservermogen en gewin. Extra focale vliegtuigen kunnen indien nodig worden toegevoegd. Zie Tabel 1 voor de specifieke laser en versterkingsinstellingen voor experimenten in Figuren 2-4.
- Stel de 'overname gebied' in het venster 'A1 MP GUI'. Vermijd selecteren van een aankoop oppervlakte groter dan 15 en een toename hoger dan 126 aan het begin van de beeldvorming te omzeilen fotobleken en verhoogde geluidsniveaus.
LET OP: Als lasers en fotomultiplicatorbuizen verschillen tussen microscopie systemen testen laser en gain-instellingen om optimale beeldvorming voorwaarden voor de set-up, terwijl het vermijden fotobleken microscoop te verkrijgen. - Kies 'relatieve intensiteit correctie' in het venster 'z-intensiteit correctie'.
- In de subwindow 'tijdreeks' in het venster 'ND acquisitie', stelt de duur tot 8 uur en het interval om 'zonder vertraging'. Dan, zorg ervoor dat op de 'Run z-correctie' in thij 'z-stack' sub-venster in de 'ND overname' window-knop om de 3-D tijdreeksen te verwerven.
- Handhaaf netvlies explantaten bij een temperatuur van 27-29 ° C gedurende de looptijd van het beeld acquisitie.
- Gedurende de gehele afbeelding overname, indien nodig, bijstellen het vermogen en winst in om de beeldkwaliteit voor post-imaging analyse te handhaven. Voor aanpassingen uit te voeren stappen 5.11.2 - 5.11.4.
- Als de focal plane verschuivingen, pauzeren of stoppen met de run en voer stap 5.11 opnieuw.
LET OP: Als relatieve z-correctie 'in stap 5.12.7 werd gekozen en stap 5.11.4 werd uitgevoerd zou het niet nodig zijn om macht en gewin niveaus passen, tenzij uitgebreide fotobleken opgetreden.
6. Analyse van Velocity
- Pak de tijd, het instellen van een 'regio van belang' op de afbeelding. Gebruik de 'tijdmeting' gereedschap en de uitvoer van de tijd waarden naar een spreadsheet.
- Crop een regio die een di bevatviding GFAP: nGFP -positieve kern.
- Kies de bijgesneden regio, zodat deze ten minste één kern die INM niet ondergaan om een referentiepunt ingesteld vervolgens de afstanden die de scheidslijn kern gemigreerd ten opzichte van de basale INL meten bevat. OPMERKING: Om een kern die in de basale INL blijft ook kiest, het helpt om een 3-D reconstructie van de tijdreeksen te bereiden.
- Alternatief, indien een GFAP: nGFP-positieve cellen waargenomen in de ONL gehele acquisitieperiode Gebruik een verticale lijn van vaste lengte, beginnende in de ONL kern naar het basale INL om een referentiepunt te identificeren.
- Met de functie 'Show plakjes view', het genereren van orthogonale projecties. Vervolgens wijzigt u de modus van 'slice' naar 'maximale intensiteit projectie'.
- Schakel de 'xy' uitzicht op de orthogonale maximale projectie. Afhankelijk van de richting waarin de migrerende / delen nucleus is het best zichtbaar, eenLSO uit te schakelen ofwel de 'xz'- of "yz'-view.
- Klik op de resterende afbeelding met de rechter muisknop en haal de 'XZ' of 'yz' beeld-serie met de' functie Maak nieuw document vanuit deze visie '. Indien nodig, het beeld te roteren.
- Met de functie 'handmatige meting ", trek een horizontale lijn over de afbeelding op het onderste niveau van de kern die overblijft in de basale INL en niet INM ondergaan (= referentiepunt; figuur 4A - E, rode horizontale lijn).
- Meet de afstand tussen de referentie lijn en de basale punt van de migrerende kern van de tijdreeks met behulp van de 'line meting' instrument in de analyse software (zie Figuur 4A - E).
- Zodra de nucleaire envelop afbreekt, het meten van de basale positie van de soma wanneer deze identificeerbaar zijn naar aanleiding van de diffusie van GFP in de gehele cel.
- Met behulp van een spreadsheet-software, plot van de afstand een nucleus gemigreerd tegen de tijd verstreek (Figuur 4F).
- Om de apicale migratie snelheid (v a), grafiek van de afgelegde kilometers voor de periode vóór de nucleaire envelop afbraak optreedt (figuur 4G) te bepalen.
- Selecteer de gegevens serie binnen de grafiek met de rechtermuisknop op de muis en plaats een lineaire regressie curve inclusief de bijbehorende functie 'y = mx + c'. De helling 'm' in de functie staat voor de snelheid, tegen een (figuur 4G).
- Herhaal stap 6.11.1 en 6.11.2 van de eerste fase van snelle basale migratie naar de basale migratie snelheid Vb (figuur 4H) te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De isolatie van het netvlies volgens de procedure in het schema weergegeven in figuur 1 maakt het kweken van een afgeplatte dorsale netvlies tegen licht beschadigde adult Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis gedurende ten minste 24 uur in een 5% CO 2 / lucht-omgeving. Deze flat-gemonteerde netvlies explantaten kan worden gebruikt om het focale vliegtuigen bij diepe weefsel niveaus. Een voorbeeld is Müller glia / neuronale voorlopercellen celkernen gelabeld met GFP van de Müller glia-promotor GFAP (glia fibrillair zuur eiwit) die zich in de ONL tijdens mitose in de licht-beschadigde retina (Figuur 2A - D, 3). Om verder te bevestigen dat deze aanpak is van toepassing op imago van de verschillende retinale cel lagen, werden acuut geïsoleerde netvlies explantaten bereid uit onbeschadigd Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebravis ogen die EGFP onder uitdrukken in rod fotoreceptorende rhodopsine promotor. Figuur 2E - H blijkt dat het mogelijk is om beelden van GFP-positieve staaf fotoreceptor en de binnensegmenten verwerven. Zoals staaf binnensegmenten zich tussen conus fotoreceptoren naar het retinale pigmentepitheel, zouden deze gegevens impliceren dat het ook mogelijk beeld kegel fotoreceptoren. Dit werd echter niet verder onderzocht.
Het hebben waargenomen Müller glia / neuronale voorlopercellen cel kernen in de ONL in het licht beschadigde netvlies, we gekenmerkt hun trekgedrag in detail (figuur 3 en Movie 1). Müller glia / neuronale voorlopercellen celkernen gelabeld door GFP te migreren bi-directioneel tussen de basale positie van het INL, waar ze meestal verblijven en de ONL, de site van afdrukband verlies. Typisch, GFAP: nGFP -positieve kernen gemigreerd een korte afstand in de INL (figuur 3A - C) voordat ze ondergingenkernenvelop analyse, terwijl gepositioneerd in de INL, gebaseerd op de herverdeling van GFP in het cytoplasma van de gehele Müller glia / neuronale voorlopercellen cellen (Figuur 3D). Na celdeling in de ONL, twee GFAP: nGFP-positieve kernen werden zichtbaar in de ONL (figuur 3F, G) die terug naar de basale INL (Figuur 3H - J). Bij celdeling, de nieuw ontstaan kernen aanvankelijk erg zwak en daarom moeilijk te identificeren (Figuur 3G). Echter, binnen een tot twee termijnen na mitose, werd nucleaire GFP fluorescentie helder, waardoor de visualisatie van nucleaire migratie (figuur 3H - J) geactiveerd. Live-cell imaging ook toegestaan de visualisatie van de deling vlak (figuur 3F, G), die horizontaal opgetreden op het apicale oppervlak van het netvlies van de in figuur 3 cel. Het is ook mogelijk om andere transgene zebravis lijnen zoals gebruiktde Tg [GFAP: EGFP] nt11 zebravissen die GFP in het cytoplasma tot expressie (gegevens niet getoond). Hoewel het mogelijk is om apicale beweging en horizontale celdelingen betrouwbaar te bepalen, is het vaak moeilijk om de positie van het basaal migrerende dochter kernen en verticale celdelingen in de Tg identificeren precies [GFAP: EGFP] nt11 zebravissen netvlies (gegevens niet getoond).
Om de snelheid te bepalen, een GFAP: nGFP -positieve kern die niet migreren gedurende de opnameperiode werd gekozen als referentiepunt (ster, figuur 4A - E). De afstand van de migrerende nucleus (verticale rode lijn, figuur 4A - E) werd bepaald in verhouding tot de referentie GFAP: nGFP -positieve nucleus (horizontale rode lijn, figuur 4A - E) op elk tijdstip van de afbeelding serie over maximaal xz of yz-uitsteeksels (afhankelijk van welke hoek de kernen kon visualihet meest efficiënt zed). De afstand die de kern gemigreerd werd uitgezet tegen de tijd in een spreadsheet (figuur 4F - H). Kernmembraan analyse werd vaak waargenomen in de grafiek als een eerste basalward beweging ten gevolge van de herverdeling van GFP in de gehele cel (basaal grootste deel van het cellichaam in dit geval). De apicale snelheid werd vastgesteld voordat de nucleaire envelop afbraak, het monteren van een lineaire regressie curve (grijze gestippelde lijn, figuur 4G) om de afstand uitgezet tegen de tijd voor de periode vóór envelop afbraak nucleaire (rode ruit, figuur 4G). De helling 'm' van de lineaire regressie curve (y = mx + c) vertegenwoordigt de snelheid "dx / dt. De apicale snelheid van de cel getoond in Figuur 4 was 10,89 micrometer / uur. Dezelfde benadering werd toegepast om de snelheid van de snelle initiële basale beweging (Vb) van de nieuw gevormde dochterkernen die (Figuur 4F berekenen, H). De basale migratie snelheden v b van -67,71 en 33,51 um / h van de dochter cellen D1 en D2, respectievelijk, waren relatief sneller dan de apicale snelheid. Helaas was het niet mogelijk de apicale snelheid na envelop verdeling nucleaire als GFP verspreid door de gehele cel bepalen. In plaats daarvan, werd de instantane snelheid berekend op basis van het tijdstip en de positie van de kern vóór kern envelop afbraak en de eerste visualisatie van de nieuw gevormde dochter kernen. De momentane snelheid van 7,9 um / h voor de in figuur 4 cellen waarschijnlijk een onderschatting als chromatine bereikt de ONL vóór telofase van mitose, wanneer de dochter kernen zichtbaar.
Samenvattend, de cultuur van retinale explantaten maakt levende cellen beeldvorming van INM in de volwassen zebravissen netvlies regenereren en de bepaling van de migratie en celdeling parameters van de afzonderlijke kernen.
Figuur 1: Netvlies Isolation Procedure. A) Schematische ter illustratie van een zebravis kop met zijn oog. B) Het oog is van de zebravis verwijderd en gericht naar de voorkant van het oog met de pupil tonen. C) Zet het oog 180 °, zodat de achterkant van het oog met de optische steel (gevulde cirkel) zichtbaar in (D) en de pupil naar beneden wijst. De grijze kleur geeft de aanwezigheid van de sclera van het oog. E) Een blad van een paar McPherson-Vannas schaar wordt in de optische steel van het oog (gevulde cirkel) om te snijden in de dorsale en ventrale zijde die wordt aangegeven door de gesegmenteerde witte lijn. F) dorsale helft van het oog na de ventrale helft werd verwijderd. De zwarte halve cirkel geeft tHij resterende deel van de optische steel. G) Draai het oog 90 ° naar achteren te tonen (H) de binnenkant van het oog met de retina (bruin), kunstmatige (niet getoond) en de lens (L, lichtgrijs cirkel) die nog wordt omhuld door de sclera (grijze lijn ). I) De sclera werd losgemaakt (let op, grijze lijn ontbreekt) en J), de lens en het glasvocht verwijderd die aanleiding geven tot alleen het netvlies (bruin). K) Retina gedraaid 90 ° naar voren die aanleiding geven tot een flatscreen-mount uitzicht op de dorsale netvlies (L). M) Dorsale retinale explantatie flatscreen-gemonteerd op een glazen bodem fluorodish. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: 3-D reconstructie vanRetinale Multiphoton Z-Stacks. A) 3-D reconstructie van een multiphoton z-stapel serie GFAP: nGFP- positieve cellen in het netvlies whole-mount culturen uit de zebravis na 48 uur van licht-schade. B - D) Single multiphoton xy-afbeeldingen GFAP: nGFP -positieve cellen in de 3D-reconstructie van (A) ter hoogte van de ONL (B), de INL (C), die overeenkomt met de laag die bevat Müller glia soma en de GCL (D). Pijl in (B) geeft een vergrote round Müller glia in de ONL na envelop afbraak kernenergie. E) 3-D reconstructie van een multiphoton z-stack afbeelding serie van een netvlies explantaat van een onbeschadigde Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebravis. F - H) Single multiphoton xy-beelden op het niveau van de staaf binnensegmenten (RIS, F), staaf kernlaag (G) En ter hoogte van de binnenste retina (H). GCL, Ganglion cellaag; INL, Inner Nuclear Layer; ONL, Outer Nuclear Layer; RIS, Rod Inner Segment. Schaalbalk in A, D, E en H, 10 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Timelapse Afbeelding Series of INM. A - J) Afbeelding reeks van 3D-reconstructie van z-stack timelapse serie tonen van Tg [GFAP: nGFP] mi2004 -positieve kernen die INM ondergaan om te verdelen in de ONL in retinale explantaten (bovenste rij). De positie van een apicaal migreren kern en de basaal migreren dochterkernen die wordt aangegeven door rode pijlen. Rode ster geeft aan nucleaire envelop afbraak tijdens de mitose. A - J, onderste rij) Dehetzelfde beeld series als in de bovenste rij was oververzadigd en bijgesneden om zich te concentreren op de delende cellen in de ONL. INL, Inner Nuclear Layer; IPL, Inner Plexiform Layer; ONL, Outer Nuclear Layer. Schaal bar in A, 10 pm en is hetzelfde voor B - J. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van Apicale en Basal Migratie Snelheden. A - E) Maximale YZ-projectie van een z-stapel serie Tg [GFAP: nGFP] mi2004 netvlies explantaten op verschillende tijdstippen van de timelapse opname overgenomen door multi-foton microscopie. Met behulp van de line tool onder de functie 'handmatige meting', werd een horizontale lijn geplaatst ter hoogte van de referentie-cel, aangegeven met een ster. Een verticale measurement lijn werd gepositioneerd te beginnen bij de horizontale lijn en uit te breiden tot de basale positie van de migrerende GFAP: nGFP -positieve kern. De lengte van de meetlijn wordt gegeven in de witte dozen op de foto en leesbaar zijn wanneer de beelden. L1 = lengte die dochter cel 1 gemigreerd; L2 = lengte die dochter cel 2 gemigreerd. F) Afstand die de cel (F0) gemeten in (A - E) gemigreerd apicaal en dat het ontstaan dochtercellen D1 en D2 gemigreerd basaal in de multiphoton timelapse opname. De rode lijn geeft de metingen die de apicale migratie snelheid (v a) berekend, terwijl de zwarte en grijze lijnen geven de metingen gebruikt om de basale migratie snelheden te berekenen (v b) D1 en D2 respectievelijk. G, H) de afstand is uitgezet tegen de tijd in Excel voor apicale migratie vóór kernenvelop verdeling (G) en de fase van snelle basalemigratie voor de dochter cel D1 (H). Lineaire regressie curven werden gefit en de functies onder de grafieken met de helling die de snelheid gegeven. INL, Inner Nuclear Layer; IPL, Inner Plexiform laag; ONL, Outer Nuclear Layer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tg [GFAP: EGFP] nt11 | Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 | ||||||||
| laservermogen | krijgen | laservermogen | krijgen | ||||||
| Top (staaf fotoreceptor) | 13 | 126 | 3.5 | 118 | Midden (Müller glia) | 10 | 126 | 2.8 | 118 |
| Bottom (GCL) | 8 | 126 | 2.1 | 118 | |||||
Tabel 1: Laser en Gain niveaus gebruikt voor Z-Intensity Correcties bij de verschillende gebieden voor experimenten getoond in de figuren 2-4.
Film 1: live-cell imaging van retinale explantaten door Multiphoton Microscopy. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studies die de mechanismen die de regeneratie van beschadigde volwassen zebravissen netvlies overwegend gebruikte immunocytochemische werkwijzen 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Voorwaarden worden vastgesteld om cultuur netvlies explantaten en live-cell imaging voeren op verschijnselen, zoals INM, geven ons een techniek te verkrijgen grondig ruimtelijke en temporele informatie. Deze techniek maakt het bepalen van de migratie snelheden, het tijdstip en de positie van de omhulling verdeling nucleaire tijdens profase van de mitose en de lengte en de positie van celdeling. Bovendien is het mogelijk de verdeling vlak en het lot van het ontstaan dochtercellen vast met betrekking tot de latere locatie. Uiteindelijk zal deze krachtige aanpak bepalen of M2; ller glia en neurale stamcellen zich anders gedragen ten aanzien van INM tijdens het netvlies regeneratie. Het gebruik van transgene zebravis lijnen die prolifererende cellen te identificeren in de regenererende netvlies verschillende stadia van de regeneratie reactie zal helpen ontcijferen differentieel gedrag 6. Bij de multifoton microscoop hier gebruikt, wordt GFP reporter zebravis lijnen voorkeur als excitatie van rood fluorescent eiwit (RFP) is niet efficiënt; echter kunnen andere systemen multiphoton efficiënte excitatie van RFP of gelijkwaardige fluoroforen mogelijk.
Een van de meest kritische stappen in het retinale isolatiewerkwijze wordt bevestiging van het netvlies. Netvliezen moeten zo vlak gemonteerd te worden mogelijk te maken voor de multiphoton licht om te kunnen doorgeven aan de diepere z-niveaus van de ONL. Kromming van het netvlies met name in het randgebied, overblijvende glasachtige en / of accumulatie van agarose onder het netvlies cultuur, die wordt gebruikt om het immobiliserenweefsel, meestal introduceren extra ruimte tussen het deksel slip en de retinale cultuur. Bovendien verhoogde laservermogen en versterking moeten worden gebruikt om beelden verkrijgt na het netvlies niet vlak en dit zal derhalve doen toenemen fotobleken en verminderde levensvatbaarheid van de retinale cultuur. Onjuiste montage vaak ook resulteert in een slechtere beeldkwaliteit dankzij verminderde lichtinval en de mogelijkheid om de afstanden nucleus van de berekening van de migratie snelheden gemigreerd en bijgevolg meten beïnvloeden.
De snelheden van apicale migratie voordat envelop afbraak nucleaire en van basale migratie betrouwbaar kan worden vastgesteld in een reeks beelden van Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis netvlies explantaten. Echter is het momenteel niet mogelijk om de snelheid van apicale migratie van het chromatine na kernenvelop onderverdeling vast in deze transgene zebravis lijn als de GFP opnieuw verdeeld in het gehele cytoplasma. Labellng netvlies explantaten met de nucleaire kleurstof Hoechst resulteerde bij weinig opname in Müller glia kernen die de verandering in golflengte vereist 830 nm (Lahne & Hyde, ongepubliceerde gegevens), die de levensvatbaarheid van het weefsel aangetast en veroorzaakt blokkering van de celcyclus ( Lahne & Hyde, ongepubliceerde gegevens). Tijdens retinale ontwikkeling Tg [h2afva: h2afva-GFP] hebben kca6 zebravissen die GFP gefuseerd aan histon 2 drukken met succes gebruikt voor het bewaken en vaststellen INM migratie snelheden in de verschillende fasen van de celcyclus 12, 31. In de toekomst, retinale explantaten van Tg [h2afva: h2afva-GFP] is kca6 zebravis Ook kan de visualisatie van chromatine gedurende de celcyclus en de analyse van de apicale migratie snelheid na kernmembraan verdeling in de volwassen zebravissen netvlies regeneratie mogelijk.
Na te hebben vastgesteld de voorwaarden te controleren INM doorLive-cell imaging in het netvlies explantaten van licht-beschadigde volwassen zebravissen en de bijbehorende analyse van snelheden zal de basis vormen voor de mechanismen die INM onderzoeken vormen. Sommige studies begonnen met het onderzoeken van de mechanismen van INM in de volwassen netvlies regenereren door immunocytochmie de positie van mitotische fosfo-histon 3-positieve kernen 6, 7 bepalen. Echter interfereren met signaalroutes kan de positie van mitose niet maken, maar kunnen beïnvloeden parameters zoals snelheid, timing van mitose en divisie die onmogelijk / zeer moeilijk te onderscheiden van immunocytochemie zou zijn. Eerder werd aangetoond dat fosfo-histon 3-positieve kernen mitotische mislocalized meer basale posities in de ontwikkelende retina in dynactin mutanten en morphants 11. Echter, de daaropvolgende live cell imaging bleek dat de nucleaire migratie voorafgaand aan de celdeling werd vertraagd in-dynactin gecompromitteerde cels, terwijl een grotere apicale migratie snelheid ingeschakeld kernen bereikt en celdeling ondergaan het apicale oppervlak 11, 12. Dit voorbeeld illustreert het vermogen van levende cellen imaging. Ook wanneer het ontrafelen van de mechanismen die INM faciliteren in de volwassen zebravissen netvlies regenereren, wordt live-cell imaging studies aan te vullen, en in diverse gevallen zal voordelig ten opzichte van, immunocytochemische benaderingen.
Zoals hierboven besproken, live-cell imaging biedt vele voordelen ten opzichte immunohistochemische / statische methoden; echter niet uit het oog worden gehouden dat het netvlies explantaten zijn een ex vivo model. Als zodanig schade tijdens de isolatie procedure opgelopen en / of kweekomstandigheden van invloed kunnen zijn cellulaire processen. Bovendien kan de beeldvormende procedure zelf toxische effecten die celgedrag 23, 32 invloed kunnen uitoefenen. Hoewel er disadvantages naar live-cell imaging van retinale culturen, het is momenteel onze beste methode om dynamische informatie van INM verkrijgen. Belangrijk is dat de levende cellen imaging procedure van retinale explantaten voor andere biologische vragen tijdens retinale regeneratie. Op basis van immunocytochemische gegevens werd eerder gesuggereerd dat Müller glia fagocyteren sterven fotoreceptoren / puin na licht veroorzaakte schade fotoreceptor 33. parameters aanpassen om het proces levende zullen nagaan of fagocytose sterven fotoreceptoren optreedt in de regenererende zebravis netvlies en kan worden gebruikt om de onderliggende mechanismen te bestuderen. Heeft aangetoond dat beelden op het niveau van staafvormige kernen en stang binnensegmenten kunnen worden verworven Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebravis, moet het mogelijk om de omstandigheden aan te fotoreceptor fagocytose passen. Evenzo kennis beperkt is wat betreft het dynamische gedrag van microglia en de mechanismen die defunctie in de degenererende en regenereren retina 34, 35. Benutting van microglia-specifieke transgene zebravis in combinatie met live-cell imaging zal ook ons begrip van de functie van microglia in de volwassen zebravissen netvlies regenereren 36, 37 te verhogen. Samenvattend, live-cell imaging van retinale explantaten is een krachtig middel om dynamische informatie van cellulaire processen te krijgen en het gedrag en functie van verschillende celtypes in de regenererende retina bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij waarderen de steun van William Archer en de Notre Dame Integrated Imaging Facility. Speciale dank zijn gericht op de Freimann Life Sciences technici voor hun voortdurende hulp en hun zorg en verzorging van de zebravis. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute van de NIH om DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) en het Centrum voor zebravis Research, Universiteit van Notre Dame, de Notre Dame, IN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
- Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
- Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
- Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
- Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
- Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
- Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
- Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
- Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
- Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
- Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
- Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
- Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
- Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
- Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
- Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
- Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
- Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).
