Summary
la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.
Abstract
Un programme de régénération endogène est initiée par Müller glie dans le poisson zèbre adulte (Danio rerio) rétine après une lésion neuronale et la mort. Les gliales Müller ré-entrer dans le cycle cellulaire et produisent des cellules progénitrices neuronales qui subissent les rondes subséquentes de divisions cellulaires et se différencient en types de cellules neuronales perdues. Les deux Müller gliales et cellules progénitrices neuronales noyaux répliquent leur ADN et subissent une mitose dans des endroits distincts de la rétine, soit ils migrent entre la basale couche intérieure nucléaire (INL) et la couche extérieure nucléaire (ONL), respectivement, dans un processus décrit comme Interkinetic migration nucléaire (INM). INM a surtout été étudié dans la rétine en développement. Pour examiner la dynamique de l'INM chez l'adulte régénérant rétine zebrafish en détail, imagerie des cellules vivantes des cellules progénitrices marquées par fluorescence Müller glie / neuronales est nécessaire. Ici, nous fournissons les conditions pour isoler et rétines culture dorsalesde Tg [GFAP: NGFP] zebrafish de mi2004 qui ont été exposés à une lumière intense constante pendant 35 h. Nous montrons également que ces cultures rétiniennes sont viables pour réaliser des expériences d'imagerie en direct des cellules, l' acquisition en continu des images z-stack dans toute l'épaisseur de l'expiant rétinienne jusqu'à 8 h par microscopie multiphoton pour surveiller le comportement migratoire des GFAP: cellules -positifs NGFP . En outre, nous décrivons les détails pour effectuer une analyse post-imagerie pour déterminer la vitesse de l'INM apicale et basale. Pour résumer, nous avons établi des conditions pour étudier la dynamique de l'INM dans un modèle adulte de la régénération neuronale. Cela fera progresser notre compréhension de ce processus cellulaire crucial et nous permettre de déterminer les mécanismes qui contrôlent l'INM.
Introduction
Contrairement aux humains, le poisson zèbre (Danio rerio) présentent une réponse de régénération robuste sur la mort cellulaire des neurones rétiniens 1, 2, 3, 4. Le facteur α de nécrose tumorale, une molécule de signalisation qui est libérée de mourir neurones de la rétine induit Müller glie résidant dans l'basales couche intérieure nucléaire (INL) de la rétine, à proliférer 5 et de produire des cellules souches neuronales qui continuent à proliférer avant de se différencier en cellule neuronale les types qui sont morts 2, 3, 4. Au cours de la phase proliférative de la réaction de régénération, les noyaux des cellules gliales Müller et de leurs cellules progénitrices neuronales dérivées subissent un motif répétitif de migration en phase avec le cycle cellulaire (Interkinetic migration nucléaire, INM) 6 > 7. Nuclei positionné dans le INL basale répliquer leur ADN avant de migrer vers la couche externe nucléaire (ONL) où ils se divisent avant les noyaux résultant retournent basally à l'INL. Ce processus a été décrit pour la première au cours du développement neuroépithélial utilisant des méthodes histologiques, alors que les approches d'imagerie en direct des cellules plus tard confirmé l'interprétation par Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Les deux approches d'imagerie histochimiques et des cellules vivantes ont été utilisées pour déterminer les mécanismes sous - jacents INM et sa fonction dans le développement neuroepithelia y compris la rétine 9, 11, 12, 13. Cependant, les mécanismes régissant INM chez l'adulte régénérant rétine n'a pas été étudiée en profondeurxref "> 6, 7. imagerie des cellules vivantes sera une approche précieuse pour faire progresser notre connaissance des voies de signalisation qui contrôlent l' INM chez l'adulte rétine régénération.
Jusqu'à récemment, l' imagerie des cellules vivantes de l' INM dans la rétine est limitée soit à des embryons de poisson zèbre vivants ou embryon de poulet ou de la souris postnatale explants rétiniens 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Alors que explants rétiniens provenant d' animaux adultes d'une variété d'espèces , y compris la souris, le rat et le poisson zèbre ont été utilisés pour la cellule différente des approches biologiques 17, 18, 19, 20, des expériences d'imagerie des cellules vivantes en utilisant des explants rétiniens have été limité à de brèves périodes de temps et n'ont pas été exécutées en continu pendant plusieurs heures 21, 22. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la culture adulte rétines poisson zèbre lumière endommagée pour effectuer des expériences d'imagerie des cellules vivantes INM de surveillance utilisant la microscopie multi-photon 6. Approches d'imagerie en direct des cellules sont avantageuses par rapport aux méthodes immunohistochimiques lors d' enquêtes sur les mécanismes de contrôle de l' INM, que la dynamique de l' INM, par exemple, les vitesses peuvent être affectées plutôt que l'emplacement de la mitose, ce qui pourrait potentiellement pas être détectée en utilisant immunocytochimie.
À l'avenir, cette méthode a aussi le potentiel d'être modifié pour étudier d'autres processus dynamiques au cours de la régénération de la rétine, comme la phagocytose de mourir photorécepteurs par Müller glie ou le comportement de la microglie.
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Protocol
Note: Zebrafish ont été soulevées et maintenu dans l'établissement Notre Dame Zebrafish dans le Freimann Life Sciences Center. Les méthodes décrites dans ce manuscrit sont approuvés par l'Université de Notre Dame de protection des animaux et l'utilisation Comité et sont en conformité avec la déclaration de l'utilisation des animaux dans la recherche de la vision par l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie.
1. Solutions
- Préparer éthanol à 70% pour stériliser la hotte de culture tissulaire et de tout équipement / des réactifs qui sont transférés dans la hotte de culture tissulaire.
- Ajouter 2 ml de 2-phénoxyéthanol à 1 L d'eau du système (1: 500 2-phénoxyéthanol).
- Préparer 0,1 mM NaHCO3, pH 8,0. Utiliser une seringue de 10 ml et un filtre de taille de pore seringue de 0,2 pm pour stériliser la solution dans une hotte de culture tissulaire stérile.
REMARQUE: NaHCO 3 est utilisé pour propager efficacement l'adhésif et le tissu cellulaire à travers la surface de la lamelle couvre - fluorodishes (voirétape 3.2). - Préparer 1,0 M de CaCl2 et 1,0 M de MgCl2. Stériliser avec une seringue de 10 mL et 0,2 um de taille de pore filtre de seringue dans une hotte de culture tissulaire stérile.
- Hank's pour préparer une solution saline équilibrée (HBSS), ajouter stérile CaCl2 et MgCl2 stérile à 1 x HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+, sans rouge de phénol à une concentration finale de 1 mM chacun. Travailler dans un environnement stérile.
- Pour préparer le milieu de culture, mélanger 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) sans rouge de phénol, 25% HBSS contenant CaCl 2 et MgCl 2 (voir section 1.4), 25% de sérum de cheval (HS), 10 unités / ml de pénicilline et 10 pg de streptomycine / ml. Travailler dans un environnement stérile.
NOTE: Éviter un milieu contenant du rouge de phénol comme il autofluoresces, affectant ainsi les rapports signal de bruit. 23 - Préparer 10 ml de 1% à bas point de fusion d'agarose dans 1x MEM sans rouge de phénol. Faire fondre l'agarose / 1 x MEM en utilisant un microWave. Préparer de petits volumes d'agarose (par exemple, 10 ml) et de réchauffage répétitive va changer la concentration en ions due à l' évaporation du fluide.
- Avant la mise en culture, stériliser 1,5 microtubes ml par autoclavage.
2. Light-dommages Paradigm
- Dark-adaptation
- Placez 2 - 3 Tg [GFAP: NGFP] zebrafish de mi2004 (ou autre poisson zèbre transgénique d'intérêt) à 6 - 14 mois dans un environnement dépourvu de lumière pendant 14 jours. Pour plus de détails , voir la référence 2, 6, 24, 25.
- Positionner le réservoir contenant 2 - 3 adapté à l' obscurité du poisson zèbre transgénique dans l' eau du système entre deux lampes fluorescentes qui émettent de la lumière de 2800 lux , 2, 6, 24, 25. Exposer zebrafish à une lumière intense constante pendant 35 h. Au cours de l'exposition à la lumière, assure que la température de l'eau est maintenue entre 31 - 33 ° C.
3. Préparation de la mise en culture (Le jour de l'isolement rétinienne)
- En utilisant 70% d' éthanol, stériliser la hotte de culture tissulaire et des composants / des outils qui sont transférés dans la hotte de culture tissulaire (par exemple des flacons contenant du MEM et de la HBSS, pipettes, embouts de pipette stériles, etc.).
- Préparation de fluorodishes
- Revêtez un FluoroDish pour chaque rétine avec la cellule et de l' adhésif de tissu (voir le tableau des matériaux).
- Diluer la colle tissulaire et cellulaire dans 0,1 mM NaHCO 3 à une concentration finale de 70 pg / ml, ajouter 50 ul à chaque FluoroDish et étaler la solution à travers le centre de la FluoroDish avec une pointe de pipette de 200 pi (environ 1 à 1,2 cm de diamètre ).
- Incuber les fluorodishes enduits pour les 1 - 3 h à RT; (Alternativement, incuber O / N à 4 ° C).
- Retirer la solution et rincer 3 fois avec 500 pi de MEM 1x pour chaque lavage. Pour éviter les fluorodishes enduits de sécher, de les maintenir dans MEM jusqu'à explants rétiniens sont montés.
- Préparer un milieu de culture tel que décrit à l'étape 1.6. Le milieu de culture peut être stocké pendant jusqu'à 1 semaine à 4 ° C.
4. Isolement et culture des explants rétiniens
NOTE: Le protocole décrit ci-dessous pour l'isolement de la rétine dorsale, qui est la région de la rétine qui est principalement lésée par la lumière est décrit dommage paradigme. Par conséquent, la prolifération induite par les dommages et l'événement associé de la migration nucléaire interkinetic se produisent dans la rétine dorsale. Toutefois, la procédure d'isolement peut être ajustée pour donner des régions rétiniennes en fonction des exigences spécifiques de la question chercheur / recherche.
- Euthanasier une lumière endommagée transgénique zebrafish untemps ta en 1: 500 2-phénoxyéthanol.
- Retirer MEM d'un FluoroDish avec une pipette de 1000 pi de sorte que seul un mince film de fluide reste.
- Transférer le poisson zèbre sur une serviette en papier sec, retirer l'œil avec une paire de pinces courbe Dumont (pince n ° 5, angle de 45 °) et de le transférer sur le FluoroDish.
- L' utilisation d' un stéréomicroscope, orienter l'œil avec l'élève sur la lamelle de l'FluoroDish de sorte que le fond de l'œil avec le nerf optique est visible (figure 1D).
- Avec une paire de ciseaux McPherson-Vannas retirer le nerf optique, la coupe près de l'arrière de l'œil. En outre, retirer le tissu conjonctif doublure à l'extérieur de l'œil.
- Tenir l'œil entre son nez et le côté temporel avec une paire de # 5 forceps tout en faisant une incision à la tige optique en perçant avec une lame de ciseaux à travers la lame criblée et coupe le long des deux nasales et sur les côtés temporels de l'œil (voir la figure 1E , li segmenténe).
- L'utilisation de deux paires de pinces # 5, l'une pour tenir la face dorsale de la rétine et l'autre paire pour séparer la ventrale de la rétine dorsale, tirer le tissu.
NOTE: Il est conseillé d'orienter la rétine dorsale de telle sorte que la lentille et la couche de cellules ganglionnaires font face à la lamelle couvre-objet alors que la sclérotique est orientée vers le haut. - Retirer la sclérotique de la rétine dorsale avec une paire de pinces # 5, tout en maintenant la lentille qui est relié à la rétine avec une deuxième paire de pinces n ° 5 (figure 1 H, I).
- Pour retirer la lentille, utiliser des ciseaux McPherson-Vannas et coupé derrière la lentille sans endommager la rétine (figure 1I, J). Parfois, la lentille se sépare à l'étape 4.7. Dans ce cas, retirez la sclérotique soigneusement avec une pince en tenant la rétine à une arête de coupe avec une deuxième paire de # 5 forceps.
- Retirez le vitré tout en retirant la lentille sans endommager la rétine. Aplatir la rétine avec la couche de cellules ganglionnaires face à la lamelledu FluoroDish (figure 1 L, M).
- Entourez la rétine avec 10 pi de 1% à bas point de fusion d'agarose et laisser l'agarose solidifier.
- Watch que l'agarose liquide ne lève pas la rétine que même une légère élévation pourrait affecter la capacité de se concentrer profondément dans le tissu. Si levage est observée, utiliser une pipette pour enlever agarose. Laissez ensemble d'agarose résiduel avant d'essayer d'ajouter plus.
- Répétez l'étape 4.12 à plusieurs reprises avant d'ajouter 1% à bas point de fusion d'agarose pour couvrir la totalité du FluoroDish. Une fois que l'agarose est solidifié, ajouter 1,5 ml du milieu de culture.
- Maintenir la culture d'expiant rétinienne dans un environnement de CO 2 / air 5% fixé à 32 ° C pendant environ 12 h pour permettre la rétine de récupérer du stress encouru par la procédure d'isolement. Réglez la température à 32 ° C pour maintenir rétines à la même température que le poisson zèbre lumière traité (voir l'étape 2.3).
5. multiphotonique Microscopie
tableau des matériaux), une longue distance objective d'immersion dans l'eau 40X Apo (NA 1,15), un scanner galvanométrique et une chambre d'environnement qui contient un insert de 35 mm pour quatre boîtes de Petri. Les images ont été acquises avec un détecteur non-descanned (R-NDD).
- Avant l'imagerie, équilibrer la chambre environnementale pour obtenir une atmosphère de CO2 à 5% / air. Assurez-vous que des boîtes de Pétri vides sont insérés dans le support pour éviter les fuites de gaz dans la chambre.
- Allumez le système de microscopie.
- Une fois que la chambre de l'environnement est équilibrée, ajouter du liquide d'indice de réfraction sur la longue distance immersion dans l'eau objectif 40X Apo (NA 1,15).
NOTE: Le liquide d'indice de réfraction ayant des propriétés optiques similaires à l'eau est utilisée pour éviter l'évaporation de l'eau lors de l'imagerie à long terme. - Lieu grippeorodishes avec explants rétiniens dans la chambre. Utilisation de la lumière de fond clair, placez l'échantillon dans le chemin de la lumière et amener la région médiane de la rétine dorsale dans le plan de mise au point.
- Utilisez GFP épifluorescence la lumière de se concentrer sur la GFAP: NGFP -positifs Müller glie noyaux (figure 2A, C).
NOTE: Si explants ne sont pas montés à plat ou d' agarose accumulée sous l'expiant, il sera difficile de se concentrer sur la GFAP: NGFP noyaux -positif ou ils fluorescence faiblement.- Vérifiez si le déplacement vers une autre région dans le même explant rétinienne permettra de surmonter le problème de focalisation. Sinon passer à un explant rétinienne différent.
- Dans le logiciel d'acquisition d'images, ouvrez le 'A1 MP GUI », le« TiPad », le« A1 Compact GUI »et les« acquisition »ND fenêtres. Pour l'imagerie multiphotonique, assurez-vous que l'option 'IR NDD' est choisi dans le «A1 Compact GUI».
- Dans le 'settinchamp g ', sélectionnez IR-DM pour le 1 er miroir dichroïque et choisissez le filtre passe-bande 525/50 pour acquérir la fluorescence de la GFP.
- Allumez le laser IR dans la fenêtre intitulée «A1MP GUI». Il faudra quelques minutes pour que le laser soit prête. Réglez la longueur d'onde de 910 nm pour exciter la fluorescence de la GFP et aligner le laser en cliquant sur le bouton 'alignement automatique »dans la fenêtre' A1 MP GUI.
- Assurez-vous que salle et d'équipement lumières sont éteintes ou recouvertes avant d'ouvrir l'obturateur dans le «A1 MP GUI" pour éviter la surexposition du tube photomultiplicateur. Pour réduire les niveaux de bruit, loger le microscope dans un environnement sombre.
- Acquérir des images d'un champ de vision de 300 x 300 pixels, à un zoom de deux, et un temps pixel d'habitation de 4,8 ms / pixel. Environ mis en place la puissance du laser en changeant la «zone d'acquisition» dans le «A1MP GUI» et le gain dans la fenêtre 'A1 Compact GUI ».
- Configuration de la z-stack
- Focus sur la couche de cellules ganglionnaires pour définir le plan focal haut de la z-pile dans le '-subwindow Z'dans la «fenêtre d'acquisition ND. Une partie GFAP: Des cellules -positif NGFP sont généralement situées dans la couche de cellules ganglionnaires, ce qui permet d'identifier la limite de base de la rétine (figure 2A, D).
- Déplacer le plan focal par le niveau de l'ONL (figure 2A, B), qui est caractérisé par la présence de GFAP faiblement marquée: des cellules -positif NGFP qui sont ronds et agrandie par rapport à leurs homologues dans le INL (figure 2A, C) , .
- Définir ce plan que le fond de la pile z. Assurez -vous que l'ensemble ONL sera imagée (figure 2A, B).
- Lorsque vous rencontrez des changements de plan focal qui nécessitent ré-ajustement pendant la période d'imagerie, double-cliquez sur la position centrale dans le subwindow 'z' pour l'assigner comme position «domestique». Changement de «mode symétrique défini 'et cliquez sur «relative».
- Définissez la taille z-étape entre 0,7 à 1 pm.
- correction Z intensité:
- Appliquer des corrections z intensité pour compenser la perte d'intensité de pixel en raison de la diffusion de lumière lorsque l'imagerie dans les couches profondes du tissu.
- Pour configurer la correction, ouvrez la fenêtre 'de correction z-intensité ». Pour définir la «gamme z-stack ', choisissez' De ND.
- Cliquez sur le plan focal en bas dans la fenêtre «correction z-intensité» (dans ce cas, correspond à la couche de cellules ganglionnaires) et régler l'intensité du laser ( «zone d'acquisition» dans le «A1MP GUI») et le gain (A1 GUI Compact ).
- Cliquez sur la flèche à côté des «valeurs z» dans la fenêtre 'de correction z-intensité »pour confirmer les paramètres qui sont ensuite présentées sous la rubrique« paramètres de l'appareil »dans la fenêtre' de correction z-intensité» pour le plan focal choisi.
- Répétez le processus pour l'un milieuplans supérieurs nd, augmentant la puissance du laser et le gain. plans focaux supplémentaires peuvent être ajoutés si nécessaire. Voir le tableau 1 pour laser et de gain des paramètres spécifiques pour les expériences sur les figures 2 - 4.
- Définir la «zone d'acquisition» dans la fenêtre 'A1 MP GUI. Évitez de choisir une zone d'acquisition supérieur à 15 et un gain supérieur à 126 au début de l'imagerie pour contourner photoblanchiment et l'augmentation des niveaux de bruit.
NOTE: Comme les lasers et les tubes photomultiplicateurs diffèrent entre les systèmes de microscopie, laser de test et les réglages de gain pour obtenir des conditions d'imagerie optimales pour le microscope mis en place tout en évitant photoblanchiment. - Choisissez «correction d'intensité relative» dans la fenêtre 'de correction z-intensité ».
- Dans la sous-fenêtre «timeseries» dans la fenêtre «ND acquisition», réglez la durée à 8 h et l'intervalle de «sans délai». Ensuite, assurez-vous de cliquer sur le "z-correction Exécuter 'dans til 'z-stack' fenêtre secondaire dans le bouton «ND acquisition» de la fenêtre pour acquérir les timeseries 3-D.
- Maintenir explants de rétine à une température de 27-29 ° C pendant toute la durée d'acquisition des images.
- Tout au long de la période d'acquisition d'image, si nécessaire, réajuster le niveau de puissance et de gain afin de maintenir une qualité d'image pour l'analyse post-imagerie. Pour effectuer les étapes ajustements 5.11.2 - 5.11.4.
- Si les changements de plan focal pause ou arrêter la course et effectuer l'étape 5.11 à nouveau.
NOTE: Si «z-correction relative 'a été choisi à l'étape 5.12.7 et 5.11.4 étape a été réalisée, il ne doit pas être nécessaire de réajuster les niveaux de puissance et de gain, à moins vaste photoblanchiment a eu lieu.
6. Analyse de la vitesse
- Extraire le temps, la fixation d'un «région d'intérêt» sur l'image. Utilisez la «mesure du temps 'outil et exporter les valeurs de temps à une feuille de calcul.
- Tronquer une région qui contient un groupe diViding GFAP: NGFP noyau -positif.
- Choisissez la région recadrée afin qu'il contient au moins un noyau qui ne subit pas INM afin de définir un point de référence pour mesurer ensuite les distances que le noyau de séparation migré par rapport à l'INL basale. NOTE: Pour choisir un noyau qui reste dans l'INL basale, il aide à préparer une reconstruction 3-D des timeseries.
- Alternativement, si un GFAP: NGFP cellule -positif est observée dans l'ONL pendant toute la période d'acquisition, utilisez une ligne verticale de longueur fixe couvrant du noyau ONL à l'INL basale afin d'identifier un point de référence.
- Utilisation de la fonction «show tranches de vue ', générer des projections orthogonales. Par la suite, changer le mode de «tranche» à «projection d'intensité maximale.
- Eteignez le 'xy' vue de la projection orthogonale maximale. Selon l'orientation à laquelle le migrant / noyau divisant est mieux visible, unLSO éteindre soit le «xz'- ou la« vue yz'.
- Cliquez sur l'image restante avec le bouton droit de la souris et extraire le «xz» ou «série yz'-image avec la fonction 'Créer un nouveau document à partir de ce point de vue». Si nécessaire, faire pivoter l'image.
- En utilisant la fonction "mesure manuelle ', tracer une ligne horizontale à travers l'image au niveau inférieur du noyau qui reste dans le INL basale et ne subit pas de l' INM (= point de référence; Figure 4A - E, ligne horizontale rouge).
- Mesurer la distance entre la ligne de référence et le point du noyau de migration pour les timeseries en utilisant l'outil "de mesure de la ligne» dans le logiciel d'analyse (voir Figure 4A - E) basale.
- Une fois l'enveloppe nucléaire se décompose, mesurer la position basale du soma si elle est identifiable après la diffusion de la GFP dans la cellule entière.
- L'utilisation d'un logiciel de tableur, tracer la distance d'un nucleus migré contre le temps écoulé (figure 4F).
- Pour déterminer la vitesse de migration apicale (v a), graphique les distances parcourues pour la période avant répartition de l' enveloppe nucléaire se produit (figure 4G).
- Sélectionnez la série de données dans le graphique, cliquez-droit sur la souris et insérez une courbe de régression linéaire y compris la fonction correspondante 'y = mx + c'. La pente «m» dans la fonction représente la vitesse, v un (Figure 4G).
- Répétez les étapes 6.11.1 et 6.11.2 pour la première phase de migration de base rapide pour déterminer la vitesse de migration de base, v b (Figure 4H).
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Representative Results
L'isolement de la rétine selon la procédure décrite dans le schéma de la figure 1 permet la mise en culture d'une rétine dorsale aplatie d'adulte lumière endommagée Tg [GFAP: NGFP] mi2004 zebrafish sur une période d'au moins 24 h dans un 5% de CO 2 / environnement d'air. Ces explants rétiniens montés à plat peuvent être utilisés pour l'image des plans focaux au niveau des tissus profonds. Un exemple est Müller glie / noyaux neuronaux de cellules progénitrices marquées à la GFP du particulier-glie promoteur GFAP (protéine acide fibrillaire gliale) Müller qui sont situés dans l'ONL lors de la mitose dans la rétine à la lumière endommagé (Figures 2A - D, 3). Pour confirmer en outre que cette approche est applicable à l' image des différentes couches de cellules rétiniennes, explants rétiniens aiguë isolées ont été préparées à partir de Tg en bon état [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 Les yeux de poisson zèbre qui expriment EGFP dans les photorécepteurs de tige sousle promoteur de la rhodopsine. La figure 2E - H montre qu'il est possible d'acquérir des images de photorécepteur de tige GFP-positives et leurs segments intérieurs. En tant que tige segments intérieurs étendent entre les photorécepteurs de cône vers l'épithélium pigmentaire rétinien, ces données semble impliquer qu'il est également possible de l'image photorécepteurs de cône. Ce fut cependant pas étudiée plus.
Avoir Müller glie / neuronales des noyaux de cellules progénitrices observées dans l'ONL dans la rétine la lumière endommagé, nous avons caractérisé leur comportement migratoire en détail (Figure 3 et film 1). Müller glie / neurones des noyaux de cellules souches marquées par GFP migrent de façon bidirectionnelle entre la position de base de l'INL où ils résident normalement et l'ONL, le site de la perte de photorécepteurs. Typiquement, GFAP: NGFP noyaux -positifs migré à une courte distance dans la INL (figure 3A - C) avant qu'ils ont subirupture de l' enveloppe nucléaire, tout en restant positionné dans l'INL, sur la base de la redistribution de la GFP dans le cytoplasme de l'ensemble de la glie Müller / neuronale cellules souches (figure 3D). Après la division cellulaire dans l'ONL, deux GFAP: NGFP noyaux -positif est devenu visible dans l'ONL (Figure 3F, G) qui est retourné à l'INL basale (Figure 3H - J). Lors de la division cellulaire, les noyaux nouvellement résultant ont d' abord été très faible et donc difficiles à identifier (figure 3G). Cependant, dans un à deux échelles de temps après la mitose, la fluorescence de la GFP nucléaire est devenu clair, ce qui a permis la visualisation de la migration nucléaire (Figure 3H - J). Imagerie des cellules vivantes a également permis la visualisation du plan de séparation (figure 3F, G), qui est produite à l' horizontale à la surface apicale de la rétine , pour la cellule représentée sur la figure 3. Il est également possible d'utiliser d'autres lignes de poisson zèbre transgéniques tellescomme la Tg [GFAP: EGFP] poisson zèbre NT11 qui expriment la GFP dans le cytoplasme (données non présentées). Bien qu'il soit possible de déterminer de manière fiable le mouvement apical et divisions cellulaires horizontales, il est souvent difficile d'identifier exactement la position des noyaux filles migrent basally et divisions cellulaires verticales dans la Tg [GFAP: EGFP] NT11 zebrafish rétine (données non présentées).
Pour déterminer la vitesse, un GFAP: NGFP noyau -positifs qui n'a pas migré pendant toute la période d'enregistrement a été choisi comme point de référence (étoile, figure 4A - E). La distance du noyau de migration (ligne rouge verticale, la figure 4A - E) a été déterminée par rapport à la GFAP de référence: NGFP noyau -positif (ligne rouge horizontale, figure 4A - E) à chaque heure de la série d'image sur xz maximum ou yz-projections (selon un angle dont les noyaux peuvent être visualized le plus efficacement). La distance que le noyau migré a été tracée en fonction du temps dans une feuille de calcul (Figure 4F - H). dégradation de la membrane nucléaire a été souvent observé dans le graphique en tant que mouvement de basalward initiale en raison de la redistribution de la GFP à l'intérieur de la cellule entière (base plus grande partie du corps de la cellule en l'occurrence). La vitesse apical a été déterminée avant répartition de l' enveloppe nucléaire, ajustement d' une courbe de régression linéaire (ligne en pointillés gris, figure 4G) à la distance tracée par rapport à la durée de la période précédant la répartition de l' enveloppe nucléaire (losange rouge, la figure 4G). La pente "m" de la courbe de régression linéaire (y = mx + c) représente la vitesse dx / dt. La vitesse apicale de la cellule présentée à la figure 4 était 10,89 um / h. La même approche a été appliquée pour calculer la vitesse du mouvement de base initiale rapide (v b) des noyaux fille nouvellement formé (Figure 4F, H). La base des vitesses de migration v b de -67,71 et 33,51 um / h de cellules filles D1 et D2, respectivement, ont été comparablement plus rapide que la vitesse apicale. Malheureusement, il n'a pas été possible de déterminer la vitesse apical après la rupture de l'enveloppe nucléaire que la GFP diffuse dans la cellule entière. Au lieu de cela, la vitesse instantanée a été calculée sur la base du calendrier et la position du noyau avant répartition de l'enveloppe nucléaire et la première visualisation des noyaux filles nouvellement formés. La vitesse instantanée de 7,9 pm / h pour la cellule représentée sur la figure 4 est probablement sous - estimé que la chromatine atteint l'ONL avant la telophase de la mitose, lorsque les noyaux filles deviennent visibles.
Pour résumer, la culture des explants rétiniens permet l'imagerie des cellules vivantes d'INM chez l'adulte régénérant rétine zebrafish et la détermination de la migration et la division cellulaire paramètres de noyaux individuels.
Figure 1: Retinal Procédure d'isolement. A) Schéma illustrant une tête de poisson zèbre avec son oeil. B) L'oeil est retiré du poisson zèbre et orientée pour montrer l'avant de l'oeil avec la pupille. C) Tourner l'oeil 180 ° de sorte que le fond de l'œil avec la tige optique (cercle noir rempli) devient visible dans (D) et l'élève fait face vers le bas. La couleur grise indique la présence de la sclérotique de l'œil. E) Une lame d'une paire de ciseaux McPherson-Vannas est inséré dans la tige optique de l'œil (cercle noir rempli) pour le couper dans son dos et les côtés ventrales qui est indiqué par la ligne segmentée blanc. F) la moitié Dorsale de l'œil après la moitié ventrale a été retiré. Le demi-cercle noir indique til part résiduelle de la tige optique. G) Tournez l'oeil 90 ° vers l' arrière pour révéler (H) à l'intérieur de l'oeil avec la rétine (brun), vitreux (non représenté) et la lentille (L, cercle gris clair) qui est encore enveloppée par la sclérotique (ligne grise ). I) La sclérotique a été détaché (note, ligne grise est manquante) et J) et la lentille vitreuse retirée donnant lieu à seulement la rétine (brun). K) Retina tourné de 90 ° vers l' avant donnant lieu à une vue à plat-monter de la rétine dorsale (L). M) Dorsale explant rétine plat monté sur un FluoroDish à fond de verre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: 3-D Reconstruction deRetinal multiphotonique Z-Stacks. A) la reconstruction 3-D d'un z-stack série d' images multiphotonique de GFAP: nGFP- cellules positives dans la rétine des cultures toute monture de poisson zèbre après 48 h de lumière-dommages. B - D) à l' unité multiphotonique xy images de GFAP: les cellules -positif NGFP affichées dans la reconstruction en 3D (A) au niveau de l'ONL (B), l'INL (C), qui correspond à la couche qui contient Müller glie soma et la GCL (D). Flèche (B) indique une ronde glie élargie Müller dans la ONL après la rupture de l' enveloppe nucléaire. E) la reconstruction en 3D d'une pile z série d' images multiphotonique d'un expiant de rétine d'un bon état de Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 de poisson - zèbre. F - H) multiphotonique Simple xy-images au niveau des segments de tige intérieure (RIS, F), tige couche nucléaire (G) Et au niveau de la rétine interne (H). GCL, Ganglion cellulaire couche; INL, couche nucléaire interne; ONL, couche externe nucléaire; RIS, Segment Rod intérieur. La barre d'échelle en A, D, E et H, 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Timelapse image Série de l' INM. A - J) Série Image de reconstruction 3D de z-stack série timelapse affichage Tg [GFAP: NGFP] mi2004 noyaux -positifs qui subissent INM à diviser dans la ONL en explants rétiniens (rangée du haut). La position de la migration apicale d'un noyau et de sa fille migrer vers la base des noyaux est indiquée par des flèches rouges. Etoile rouge indique répartition de l'enveloppe nucléaire lors de la mitose. A - J, rangée du bas) LeMême série d'image dans la rangée supérieure était sursaturé et recadrée de se concentrer sur les cellules en division dans l'ONL. INL, couche nucléaire interne; IPL, Inner Plexiform couche; ONL, couche externe nucléaire. La barre d'échelle en A, 10 pm et est la même pour B - J. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Analyse des apicales et basales Velocities migration. A - E) yz de projection maximale d'une image série z-stack de Tg [GFAP: NGFP] mi2004 explants rétiniens à différents timepoints de l'enregistrement timelapse acquise par microscopie multi-photon. Utilisation de l'outil de ligne sous la fonction "mesure manuelle", une ligne horizontale a été placée au niveau de la cellule de référence, indiqué par une étoile. A moi verticaleligne asurement a été positionné à partir de la ligne horizontale et se prolongeant jusqu'à la position de base de la GFAP migrante: NGFP noyau -positif. La longueur de la ligne de mesure est donnée dans les cases blanches sur les images et pour la lisibilité sous les images. L1 = longueur cellule fille 1 migré; L2 = longueur fille cellule 2 migré. F) Distance que la cellule (F0) mesurée en (A - E) ont migré en direction apicale et que les cellules filles résultant D1 et D2 ont migré vers la base lors de l'enregistrement multiphotonique timelapse. La ligne rouge indique les mesures pour lesquelles la vitesse de migration apicale (v a) a été calculé tandis que les lignes noires et grises indiquent les mesures utilisées pour calculer les vitesses de migration de base (v b) pour D1 et D2, respectivement. G, H) La distance a été tracée en fonction du temps dans Excel pour la migration apicale avant répartition de l' enveloppe nucléaire (G) et la phase de base rapidemigration pour cellule fille D1 (H). Les courbes de régression linéaire ont été montés et les fonctions sont indiquées ci-dessous les graphes de la pente représentant la vitesse. INL, couche nucléaire interne; IPL, Couche intérieure Plexiform; ONL, couche externe nucléaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Tg [GFAP: EGFP] NT11 | Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 | ||||||||
| la puissance du laser | Gain | la puissance du laser | Gain | ||||||
| Top (tige photorécepteur) | 13 | 126 | 3.5 | 118 | Moyen (Müller glie) | dix | 126 | 2.8 | 118 |
| Bottom (GCL) | 8 | 126 | 2.1 | 118 | |||||
Tableau 1: Laser et Gain niveaux utilisés pour les services correctionnels Z-intensité à différents plans pour les expériences affichées dans les figures 2 - 4.
Film 1: imagerie des cellules vivantes de rétiniennes explants par multiphotonique Microscopy. (Clic pour télécharger).
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Discussion
Les études portant sur les mécanismes régissant la régénération de l'adulte endommagée de la rétine zebrafish méthodes principalement utilisées immunocytochimiques 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Mise en place des conditions de culture des explants rétiniens et d'effectuer l'imagerie des cellules vivantes sur des phénomènes tels que l'INM, nous fournir une technique pour obtenir la profondeur spatiale et des informations temporelles. Cette technique permet de déterminer les vitesses de migration, la synchronisation et la position de la rupture de l'enveloppe nucléaire lors de la prophase de la mitose et la longueur et la position de la division cellulaire. Par ailleurs, il est possible d'établir le plan de division et le sort des cellules filles résultant en ce qui concerne leur emplacement ultérieur. En fin de compte, cette approche puissante permettra de déterminer si M2; ller glie et les cellules progénitrices neuronales se comportent différemment en ce qui concerne l'INM lors de la régénération rétinienne. L'utilisation de lignées transgéniques de poisson - zèbre qui permettent d' identifier les cellules qui prolifèrent dans la rétine de régénération à des étapes distinctes de la réaction de régénération aide déchiffrant le comportement différentiel 6. Dans le cas du microscope multiphotonique utilisé ici, GFP lignes journaliste zebrafish sont préférés comme excitation de Red Fluorescent Protein (DP) est pas très efficace; cependant, d'autres systèmes multiphotonique peuvent permettre une excitation efficace de DP ou fluorophores équivalentes.
L'une des étapes les plus critiques dans la procédure d'isolement de la rétine est le montage de la rétine. Rétines doivent être montés aussi plat que possible pour la lumière multiphotonique pour être en mesure de passer aux z niveaux plus profonds de l'ONL. Incurvation de la rétine, en particulier dans la zone marginale vitreuse résiduelle et / ou l'accumulation d'agarose sous la culture de la rétine, qui est utilisé pour immobiliser lale tissu, le plus souvent d'introduire un espace supplémentaire entre la lamelle et la culture de la rétine. En outre, l'augmentation de la puissance laser et le gain doivent être utilisés pour l'acquisition d'images si la rétine est non plane et par conséquent, cela entraînera une augmentation photoblanchiment et réduit la viabilité de la culture de la rétine. Mauvaise montage souvent entraîne également une moins bonne qualité d'image due à la pénétration de la lumière réduite et aura une incidence sur la capacité de mesurer les distances que les noyaux avaient migré et donc le calcul des vitesses de migration.
Les vitesses de migration apicale avant répartition de l' enveloppe nucléaire et de la migration de base peuvent être déterminées de façon fiable dans une série d'images de Tg [GFAP: NGFP] mi2004 explants rétiniens poisson zèbre. Cependant, il est actuellement impossible de déterminer la vitesse de migration apicale de la chromatine après la rupture de l'enveloppe nucléaire dans cette lignée transgénique zebrafish que les GFP re-distribue à travers tout le cytoplasme. Labeling d'explants rétiniens avec le colorant nucléaire Hoechst a entraîné l'absorption faible dans Müller noyaux gliales qui ont nécessité le changement de longueur d'onde à 830 nm (Lahne & Hyde, données non publiées), qui a affecté la viabilité du tissu et causé blocage du cycle cellulaire ( Lahne & Hyde, données non publiées). Au cours du développement de la rétine, Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 zebrafish qui expriment la GFP fusionnée à histone 2 ont été utilisés avec succès pour contrôler l' INM et de déterminer les vitesses de migration dans les différentes étapes du cycle de la cellule 12, 31. Dans l'avenir, les explants rétiniens de Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 zebrafish permettront également la visualisation de la chromatine tout au long du cycle cellulaire et permettront à l'analyse de la vitesse de migration apicale après la rupture de la membrane nucléaire chez l'adulte régénérant rétine zebrafish.
Après avoir établi les conditions de suivi par l'INMimagerie des cellules vivantes dans des explants rétiniens de poisson zèbre adulte lumière endommagé et l'analyse correspondante des vitesses formera la base pour étudier les mécanismes régissant l'INM. Certaines études ont commencé à étudier les mécanismes de l' INM chez l'adulte , la régénération de la rétine en utilisant une immunocytochimie pour déterminer la position de la mitose phospho-histone 3 noyaux positifs 6, 7. Cependant, interférant avec les voies de signalisation ne peut rendre la position de la mitose, mais pourrait affecter d'autres paramètres tels que la vitesse, le timing de la mitose et la division qui ne serait pas possible / très difficile à discerner par immunocytochimie. Auparavant, il a été montré que les noyaux mitotiques phospho-histone 3-positives mislocalized à des postes de base dans la rétine en développement chez les mutants et Dynactin morphants 11. Cependant, l'imagerie des cellules vivantes subséquente a révélé que la migration nucléaire avant la division cellulaire a été retardée dans la cellule dynactine-compromiss, alors qu'une vitesse de migration apicale accrue a permis d'atteindre des noyaux et de subir une division cellulaire à la surface apicale 11, 12. Cet exemple illustre la puissance de l'imagerie des cellules vivantes. De même, lorsque démêler les mécanismes qui facilitent l'INM chez l'adulte régénérant rétine zebrafish, des études d'imagerie cellules vivantes se complètent, et dans divers cas seront avantageux par rapport à des approches immunocytochimiques.
Comme indiqué plus haut, l'imagerie des cellules vivantes offre de nombreux avantages par rapport immunohistochimie / méthodes statiques; Cependant, il faut garder à l' esprit que explants rétiniens sont un modèle ex vivo. En tant que tel, les dommages encourus au cours de la procédure d'isolement et / ou de conditions de culture peuvent influer sur les processus cellulaires. En outre, la procédure d'imagerie lui - même peut avoir des effets toxiques qui pourraient influer sur le comportement cellulaire 23, 32. Bien qu'il existe disadvantages à vivre cellules imagerie des cultures rétiniennes, il est actuellement notre meilleure méthode pour obtenir de l'information dynamique de l'INM. Fait important, la procédure d'imagerie des cellules vivantes des explants rétiniens sera applicable à d'autres questions biologiques pendant la régénération rétinienne. D' après les données immunocytochimiques, il a déjà été suggéré que la glie Müller phagocytent mourir photorécepteurs / débris après une lésion de photorécepteur induite par la lumière 33. Réglage des paramètres à l'image de ce processus en direct permettra de vérifier si la phagocytose des photorécepteurs meurent se produit dans la rétine de poisson zèbre régénération et peut être utilisé pour étudier les mécanismes sous-jacents. Après avoir montré que les images peuvent être acquises au niveau des noyaux de tige et tige segments internes dans Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] zebrafish nt19, il devrait être possible d'ajuster les conditions à l' image photorécepteur phagocytose. De même, la connaissance est limitée en ce qui concerne le comportement dynamique de la microglie et les mécanismes régissant leurfonction dans la dégénérescence et de la rétine de régénération 34, 35. L' exploitation spécifique à la microglie zebrafish transgénique en conjonction avec l' imagerie des cellules vivantes permettra également d' augmenter notre compréhension de la fonction de la microglie chez l'adulte régénérantes rétine zebrafish 36, 37. Pour résumer, l'imagerie des cellules vivantes des explants rétiniens est un outil puissant pour obtenir de l'information dynamique des processus cellulaires et pour déterminer le comportement et la fonction des différents types de cellules dans la rétine de régénération.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous apprécions le soutien fourni par William Archer et le Fonds Notre Dame imagerie intégrée. Des remerciements spéciaux sont dirigés vers les techniciens Freimann sciences de la vie pour leur aide continue et leur prise en charge et de l'élevage du poisson zèbre. Cette étude a été soutenue par des subventions du National Eye Institute des NIH pour DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) et le Centre de recherche Zebrafish, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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