Summary
la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.
Abstract
Un programma di rigenerazione endogena è avviata da Müller glia nel zebrafish adulti (Danio rerio) retina seguente danno neuronale e la morte. Le Müller glia ri-entrare nel ciclo cellulare e producono cellule progenitrici neuronali che sono oggetto di ulteriori cicli di divisioni cellulari e differenziarsi in tipi di cellule neuronali persi. Sia Müller glia e cellule progenitrici neuronali nuclei replicano il loro DNA e sottoposti mitosi in posizioni distinte della retina, cioè migrano tra il basale strato interno nucleare (INL) e lo strato esterno nucleare (ONL) rispettivamente, in un processo descritto come Interkinetic La migrazione nucleare (INM). INM è stata studiata principalmente nella retina sviluppo. Per esaminare le dinamiche di INM nell'adulto rigenerante retina zebrafish in dettaglio, è necessario live-cell imaging di / cellule progenitrici neuronali fluorescenza marcata Müller glia. Qui, forniamo le condizioni per isolare e retine cultura dorsalida Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish che sono stati esposti ad una costante luce intensa per 35 ore. Mostriamo anche che queste culture della retina sono vitali per eseguire esperimenti di imaging live-cell, acquisendo continuamente immagini z-stack per tutto lo spessore della espianto della retina per un massimo di 8 ore usando la microscopia multiphoton per monitorare il comportamento migratorio di GFAP: cellule -positive nGFP . Inoltre, si descrivono i dettagli per effettuare analisi post-imaging per determinare la velocità di INM apicale e basale. Per riassumere, abbiamo stabilito le condizioni per studiare le dinamiche di INM in un modello adulto di rigenerazione neuronale. Questo farà progredire la nostra comprensione di questo processo cellulare cruciale e ci permettono di determinare i meccanismi che controllano INM.
Introduction
A differenza di esseri umani, pesce zebra (Danio rerio) mostrano una robusta risposta la rigenerazione delle cellule alla morte dei neuroni della retina 1, 2, 3, 4. Fattore di necrosi tumorale α, una molecola di segnalazione che viene rilasciato dalla morte dei neuroni della retina induce Müller glia residente nel basale strato interno nucleare (INL) della retina, a proliferare 5 e produrre cellule progenitrici neuronali che continuano a proliferare prima differenziazione in cellule neuronali tipi morti 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa della risposta rigenerazione, i nuclei di Müller glia e le loro cellule progenitrici neuronali derivate subiscono un modello migratorio ripetitivo in fase con il ciclo cellulare (Interkinetic migrazione nucleare, INM) 6 >, 7. Nuclei posizionato nel basale INL replicare il loro DNA prima di migrare verso lo strato esterno nucleare (ONL) in cui si dividono prima i nuclei derivanti tornano basale alla INL. Questo processo è stato descritto durante lo sviluppo neuroepiteliale utilizzando metodi istologici, mentre approcci di imaging live-cell successivamente confermato l'interpretazione da Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Entrambi gli approcci di imaging istochimiche e live-cellulari sono stati utilizzati per determinare i meccanismi sottostanti INM e la sua funzione nello sviluppo neuroepiteli compreso retina 9, 11, 12, 13. Tuttavia, i meccanismi che regolano INM nell'adulto rigenerazione della retina non sono stati studiati in molti dettaglixref "> 6, 7. live-cell imaging sarà un approccio preziosa per far progredire la nostra conoscenza delle vie di segnalazione che controllano INM nella rigenerazione della retina adulta.
Fino a poco tempo, live-cell imaging del INM nella retina era limitato a uno zebrafish embrioni vivi o pulcino embrionale o topo postnatale espianti retinici 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mentre espianti di retina da animali adulti di una varietà di specie, tra cui topo, ratto e zebrafish sono stati utilizzati per la cella diversa approcci biologici 17, 18, 19, 20, esperimenti di imaging dal vivo di cellule utilizzando espianti di retina have stato limitato a brevi periodi di tempo e non sono stati eseguiti in modo continuativo per diverse ore 21, 22. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato alla cultura per adulti retine zebrafish luce danneggiato per eseguire esperimenti di imaging dal vivo di cellule monitoraggio INM utilizzando multi-fotone microscopia a 6. Approcci live-cell imaging sono vantaggiosi rispetto ai metodi di immunoistochimica nell'ambito delle indagini i meccanismi che controllano INM, come le dinamiche di INM, ad esempio, le velocità potrebbero essere interessati, piuttosto che la posizione della mitosi, che non è potenzialmente essere rilevato tramite immunocitochimica.
In futuro, questo metodo ha anche il potenziale di essere modificati per studiare altri processi dinamici durante la rigenerazione della retina, come la fagocitosi di morire fotorecettori da Müller glia o il comportamento della microglia.
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Protocol
Nota: Zebrafish sono state sollevate e mantenuto nella struttura Notre Dame Zebrafish nel Freimann Life Sciences Center. I metodi descritti in questo manoscritto sono approvati dalla University of Notre Dame cura degli animali e del Comitato uso e sono in conformità con la dichiarazione per l'utilizzo degli animali nella ricerca visione dall'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia.
1. Soluzioni
- Preparare 70% di etanolo per sterilizzare il cofano coltura di tessuti e qualsiasi apparecchiatura / reagenti che vengono trasferiti nella cappa coltura tissutale.
- Aggiungere 2 ml di 2-fenossietanolo a 1 L di acqua del sistema (1: 500 2-fenossietanolo).
- Preparare 0.1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro dimensione dei pori 0,2 micron siringa per sterilizzare la soluzione in una cappa coltura tissutale sterilizzato.
NOTA: NaHCO 3 viene utilizzato per diffondere efficacemente l'adesivo cellula e tessuto sulla superficie coprioggetto di fluorodishes (vedistep 3.2). - Preparare 1,0 M CaCl 2 e 1.0 M MgCl 2. Sterilizzazione con una siringa da 10 ml e 0,2 micron dimensione dei pori del filtro siringa in una cappa coltura tissutale sterilizzato.
- Per preparare Hank's-soluzione salina bilanciata (HBSS), aggiungere sterili CaCl 2 e sterile MgCl 2 a 1x HBSS senza Ca 2+ / Mg 2+, senza rosso fenolo ad una concentrazione finale di 1 mm ciascuno. Lavorare in un ambiente sterile.
- Per preparare un terreno di coltura, mescolare il 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) senza rosso fenolo, il 25% HBSS contenente CaCl 2 e MgCl 2 (vedi sezione 1.4), il 25% siero di cavallo (HS), 10 unità / ml di penicillina, e 10 mg / mL di streptomicina. Lavorare in un ambiente sterile.
NOTA: Evitare di terreno contenente rosso fenolo come autofluoresces, che ciò pregiudichi rapporto segnale rumore. 23 - Preparare 10 ml di 1% a basso punto di fusione agarosio in 1x MEM senza rosso fenolo. Melt agarosio / 1x MEM utilizzando un microWAve. Preparare piccoli volumi di agarosio (ad esempio, 10 mL) come riscaldo ripetitiva cambierà concentrazioni di ioni a causa dell'evaporazione del fluido.
- Prima di coltura, sterilizzare provette da 1,5 ml microcentrifuga in autoclave.
2. Light-danni paradigma
- Dark-adattamento
- Mettere 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish (o altro zebrafish transgenico di interesse) a 6 - 14 mesi di età in un ambiente privo di luce per 14 d. Per ulteriori dettagli vedi riferimento 2, 6, 24, 25.
- Posizionare il serbatoio contenente 2 - 3 adattata al buio zebrafish transgenico in acqua del sistema tra due lampade fluorescenti che emettono luce di 2,800 lux 2, 6, 24, 25. Esporre zebrafish al costante luce intensa per 35 ore. Durante l'esposizione alla luce, assicura che la temperatura dell'acqua è mantenuta tra 31 - 33 ° C.
3. Preparazione per la coltura (nel giorno di isolamento della retina)
- Utilizzando il 70% di etanolo, sterilizzare il cofano coltura di tessuti e componenti / strumenti che vengono trasferiti nella cappa coltura tissutale (ad esempio, flaconi contenenti MEM e HBSS, pipette, puntali sterili, ecc.).
- Preparazione di fluorodishes
- Coat uno fluorodish per ogni retina con cellulare e tessuto adesivo (vedi tabella dei materiali).
- Diluire l'adesivo cellula e tessuto 0.1 mM NaHCO 3 a una concentrazione finale di 70 mg / ml, aggiungere 50 microlitri di ciascun fluorodish e diffondere la soluzione attraverso il centro del fluorodish con una punta di pipetta 200 microlitri (circa 1 - diametro 1,2 centimetri ).
- Incubare le fluorodishes rivestite per 1 - 3 h a temperatura ambiente, (In alternativa, incubare O / N a 4 ° C).
- Rimuovere la soluzione e risciacquare 3x con 500 ml di 1x MEM per ogni lavaggio. Per evitare i fluorodishes rivestite da secchi, li mantenere in MEM fino espianti di retina sono montati.
- Preparare terreno di coltura come descritto al punto 1.6. Il terreno di coltura può essere conservato per un massimo di 1 settimana a 4 ° C.
4. L'isolamento e la coltura di espianti retina
NOTA: Il protocollo descritto sotto è per l'isolamento della retina dorsale, che è la regione retinica che è prevalentemente lesionato dal paradigma luce danno descritto. Pertanto, la proliferazione danni indotti e l'evento associato della migrazione nucleare interkinetic si verificano nella retina dorsale. Tuttavia, la procedura di isolamento può essere regolata per produrre regioni retina secondo le esigenze specifiche della domanda ricercatore / ricerca.
- Euthanize una luce-danneggiato transgenico zebrafish untempo ta in 1: 500 2-fenossietanolo.
- Rimuovere MEM da un fluorodish con una pipetta 1000 microlitri modo che solo una sottile pellicola di fluido resti.
- Trasferire il pesce zebra su un tovagliolo di carta asciutto, rimuovere l'occhio con un paio di pinze curva Dumont (pinze # 5, 45 ° angolo) e trasferirlo sul fluorodish.
- Utilizzando uno stereomicroscopio, orientare l'occhio con la pupilla sul coperchio slittamento della fluorodish in modo che la parte posteriore dell'occhio con il nervo ottico è visibile (Figura 1D).
- Con un paio di forbici McPherson-Vännäs rimuovere il nervo ottico, taglio vicino alla parte posteriore dell'occhio. Inoltre, rimuovere il tessuto connettivo, allineando la parte esterna dell'occhio.
- Tenere l'occhio tra il suo nasale e lato temporale con un paio di # 5 pinze mentre facendo un'incisione gambo ottica perforando con una lama forbice attraverso la lamina cribrosa e tagliando lungo gli nasale e lati temporale dell'occhio (vedere Figura 1E , li segmentatoNE).
- Utilizzando due coppie di pinze # 5, uno per tenere il lato dorsale della retina e l'altra coppia di separare ventrale dalla retina dorsale, tirare il tessuto.
NOTA: Si consiglia di orientare la retina dorsale in modo che la lente e lo strato di cellule gangliari affacciano sul vetrino mentre la sclera è rivolta verso l'alto. - Rimuovere la sclera dalla retina dorsale una coppia di pinze # 5, mentre si tiene la lente che è collegato alla retina con una seconda coppia di pinze # 5 (Figura 1H, I).
- Per rimuovere l'obiettivo, usare le forbici McPherson-Vännäs e tagliare dietro l'obiettivo senza danneggiare la retina (Figura 1I, J). Talvolta, la lente separa nel passaggio 4.7. In questo caso, rimuovere la sclera accuratamente con una pinza tenendo la retina un bordo tagliato con una seconda coppia di pinze # 5.
- Rimuovere il vitreo durante la rimozione della lente senza danneggiare la retina. Appiattire la retina con lo strato di cellule gangliari di fronte al vetrinodel fluorodish (Figura 1L, M).
- Circondano la retina con 10 ml di 1% agarosio punto basso punto di fusione e lasciare che il agarosio solidificare.
- Guarda che l'agarosio liquido non sollevare la retina come anche una lieve elevazione potrebbe influenzare la capacità di mettere a fuoco in profondità nel tessuto. Se si osserva il sollevamento, utilizzare una pipetta per rimuovere agarosio. Lasciate set agarosio residua prima di tentare di aggiungere più.
- Ripetere il passaggio 4.12 parecchie volte prima di aggiungere 1% agarosio punto basso punto di fusione per coprire l'intera fluorodish. Una volta che l'agarosio si è solidificato, aggiungere 1,5 mL terreno di coltura.
- Mantenere l'espianto della retina in un ambiente / aria 5% di CO 2 fissata a 32 ° C per circa 12 ore per consentire la retina di recuperare dallo stress sostenute dalla procedura di isolamento. Impostare la temperatura a 32 ° C per mantenere retine alla stessa temperatura come zebrafish luce-trattati (vedi punto 2.3).
5. Multiphoton Microscopia
Tabella dei Materiali), una lunga distanza obiettivo immersione in acqua 40X Apo (NA 1.15), uno scanner galvanometro e un camera ambientale che contiene un inserto per quattro 35 millimetri Petri. Le immagini sono state acquisite con un rivelatore non descanned (R-NDD).
- Prima di imaging, equilibrare la camera ambientale per ottenere un ambiente / aria 5% di CO 2. Assicurarsi che i piatti vuoti Petri sono inseriti nel supporto per evitare perdite di gas nella camera.
- Accendere il sistema di microscopia.
- Una volta che la camera ambientale è equilibrato, aggiungere rifrazione liquido indice sulla lunga distanza obiettivo immersione in acqua 40X Apo (NA 1.15).
NOTA: Il liquido indice di rifrazione con proprietà ottiche simili all'acqua viene utilizzato per evitare l'evaporazione dell'acqua durante l'imaging a lungo termine. - luogo influenzaorodishes con espianti di retina nella camera. Usando la luce chiaro, posizionare il campione nel percorso ottico e portare la regione centrale della retina dorsale nel piano di messa a fuoco.
- Utilizzare GFP luce epifluorescente di concentrarsi su GFAP: nGFP -positivo Müller glia nuclei (Figura 2A, C).
NOTA: Se espianti non sono montati piatto o agarosio accumulato sotto l'espianto, sarà difficile mettere a fuoco sul GFAP: nGFP nuclei -positive o saranno fluorescenza debolmente.- Controllare se trasferirsi in una regione diversa all'interno dello stesso espianto della retina sarà superare il problema di messa a fuoco. In caso contrario, passare a un diverso espianto della retina.
- Nel software di acquisizione delle immagini, aprire la 'A1 MP GUI', il 'TiPad', la 'A1 Compact GUI' e le finestre 'ND acquisizione. Per l'imaging multiphoton, assicurarsi che l'opzione 'IR NDD' viene scelto nel 'A1 Compact GUI'.
- Nel 'setting 'campo, selezionare IR-DM per la st 1 specchio dicroico e scegliere il filtro passa banda 525/50 per acquisire GFP fluorescenza.
- Accendere il laser a infrarossi nella finestra denominata 'A1MP GUI'. Ci vorrà qualche minuto per il laser per essere pronti. Impostare la lunghezza d'onda di 910 nm per eccitare la fluorescenza GFP e allineare il laser facendo clic sul pulsante 'allineamento automatico' nella finestra 'A1 MP GUI'.
- Assicurarsi che in camera e attrezzature luci sono spente o coperte prima di aprire l'otturatore nel 'A1 MP GUI' per evitare la sovraesposizione del tubo fotomoltiplicatore. Per ridurre i livelli di rumore, ospitare il microscopio in un ambiente buio.
- Acquisire immagini di un campo visivo di 300 x 300 pixel, ad un ingrandimento di due, e un tempo di pixel dimora di 4,8 ms / pixel. Circa impostare la potenza del laser cambiando la 'area di acquisizione' nel 'A1MP GUI' e il guadagno nella finestra 'A1 Compact GUI'.
- Impostazione del z-stack
- Focus sul strato di cellule gangliari per impostare il piano focale superiore dello z-stack nel '-sottofinestra z'all'interno della' finestra di acquisizione ND '. Alcuni GFAP: cellule -positive nGFP in genere si trovano nello strato di cellule gangliari, che aiuta a identificare il limite basale della retina (Figura 2A, D).
- Spostare il piano focale attraverso il livello del ONL (Figura 2A, B), che è caratterizzato dalla presenza di GFAP debolmente marcato: cellule -positive nGFP che sono rotondi e ingrandita rispetto alle loro controparti nel INL (Figura 2A, C) .
- Impostare questo piano del fondo del z-stack. Assicurarsi che l'intero ONL verrà ripreso (Figura 2A, B).
- Quando si verifica focali spostamenti aerei che richiedono una ri-regolazione durante il periodo di imaging, fare doppio clic sulla posizione centrale nella sottofinestra 'z' per assegnarlo come la posizione di 'casa'. Passare alla 'modalità simmetrica definito'e fare clic su 'relativo'.
- Impostare la dimensione z-passo tra 0,7-1 micron.
- Correzione Z intensità:
- Applicare correzioni z intensità per compensare la perdita di intensità dei pixel a causa di dispersione della luce quando l'imaging in strati profondi del tessuto.
- Per impostare la correzione, aprire la finestra 'correzione di z-intensita'. Per impostare la 'gamma z-stack', scegliere 'Da ND'.
- Istruzioni sul piano focale inferiore nella finestra 'z intensità di correzione' (in questo caso, corrisponde allo strato di cellule gangliari) e impostare l'intensità del laser ( 'area di acquisizione' nella 'A1MP GUI') e il guadagno (GUI Compact A1 ).
- Fare clic sulla freccia accanto ai "valori z 'nella finestra' correzione di z-intensita 'per confermare le impostazioni che vengono successivamente indicati alla voce« impostazioni del dispositivo' nella finestra 'correzione di z-intensita' per il piano focale prescelto.
- Ripetere il processo per l'una via di mezzomigliori piani di ND, aumentando la potenza del laser e guadagno. Ulteriori piani focali possono essere aggiunti, se necessario. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni laser e guadagno specifiche per esperimenti in Figure 2 - 4.
- Impostare l' 'area di acquisizione' nella finestra 'A1 MP GUI'. Evitare di selezionare un'area acquisizione maggiore di 15 e un guadagno superiore 126 all'inizio di imaging per aggirare photobleaching e maggiore rumorosità.
NOTA: i laser e tubi fotomoltiplicatori differiscono tra i sistemi di microscopia laser, prova e impostazioni di guadagno per ottenere condizioni di imaging ottimali per il microscopio istituito evitando photobleaching. - Scegliere 'correzione di intensità relativa' nella finestra 'correzione di z-intensita'.
- Nella sottofinestra 'timeseries' nella finestra 'ND acquisizione', impostare la durata di 8 ore e l'intervallo per 'alcun ritardo'. Quindi, assicurarsi di fare clic su 'Esegui z-correzione' in tegli finestra secondaria 'z-stack' nel pulsante finestra 'ND acquisizione' per acquisire le timeseries 3-D.
- Mantenere espianti retinici ad una temperatura di 27 - 29 ° C per tutta la durata di acquisizione dell'immagine.
- Per tutto il periodo di acquisizione dell'immagine, se necessario, regolare il livello di potenza e di guadagno per mantenere la qualità dell'immagine per analisi post-imaging. Per le regolazioni eseguire i passaggi 5.11.2 - 5.11.4.
- Se i cambiamenti sul piano focale, mettere in pausa o fermare la corsa ed eseguire passo 5.11 di nuovo.
NOTA: Se 'relativa z-correzione' è stato scelto al passo 5.12.7 e 5.11.4 è stata eseguita passo non dovrebbe essere necessario regolare nuovamente livelli di potenza e di guadagno, a meno che non si è verificato vasta photobleaching.
6. Analisi Velocity
- Estrarre il tempo, impostando una 'regione di interesse' sull'immagine. Utilizzare lo strumento 'tempo di misura' ed esportare i valori di tempo di un foglio di calcolo.
- Ritagliare una regione che contiene uno dividing GFAP: nGFP nucleo -positivo.
- Scegliere la regione ritagliata in modo che contenga almeno un nucleo che non subiscono INM per impostare un punto di riferimento per misurare le distanze successivamente che il nucleo di demarcazione migrato rispetto al basale INL. NOTA: Per scegliere un nucleo che rimane nel basale INL, aiuta a preparare una ricostruzione 3-D dei timeseries.
- In alternativa, se un GFAP: si osserva nGFP cellule -positivo nel ONL tutto il periodo di acquisizione, utilizzare una linea verticale di lunghezza fissa che va dal nucleo ONL al basale INL per identificare un punto di riferimento.
- Utilizzando la funzione 'Mostra fette vista', generare proiezioni ortogonali. Successivamente, cambiare la modalità da 'fetta' di 'proiezione massima intensita'.
- Spegnere la vista 'xy' della proiezione massima ortogonale. A seconda dell'orientamento in cui la migrazione / nucleo dividendo è meglio visibile, unaLSO spegnere sia il 'xz'- o la' vista yz'.
- Clicca sull'immagine rimanente con il tasto destro del mouse ed estrarre la 'serie yz'-immagine con la' 'XZ' o la funzione Crea nuovo documento da questo punto di vista '. Se necessario, ruotare l'immagine.
- Utilizzando la funzione di 'misurazione manuale', tracciare una linea orizzontale attraverso l'immagine al livello inferiore del nucleo che rimane nel INL basale e non subisce INM (= punto di riferimento, la figura 4A - E, linea orizzontale rossa).
- Misurare la distanza tra la linea di riferimento e il punto basale del nucleo migrazione dei timeseries con lo strumento 'misura linea' nel software di analisi (vedi Figura 4A - E).
- Una volta che l'involucro nucleare si rompe, misurare la posizione basale del soma se è identificabile seguito della diffusione della GFP nella intera cella.
- Utilizzando un software di foglio di calcolo, tracciare la distanza di un nuCleus migrato contro il tempo trascorso (Figura 4F).
- Per determinare la velocità di migrazione apicale (v a), grafico le distanze percorse per il periodo precedente ripartizione involucro nucleare si verifica (Figura 4G).
- Selezionare la serie di dati all'interno del grafico, fare clic con il mouse e inserire una curva di regressione lineare tra cui 'y = mx + c' la funzione corrispondente. La pendenza 'm' nella funzione rappresenta la velocità, v a (Figura 4G).
- Ripetere i punti 6.11.1 e 6.11.2 per la prima fase della migrazione basale rapida per determinare la velocità di migrazione basale, v b (Figura 4H).
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Representative Results
L'isolamento della retina secondo la procedura descritta nello schema di figura 1 consente coltura di una retina dorsale appiattito da adulti light-danneggiato Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish per un periodo di almeno 24 h in un CO 5% 2 / ambiente di aria. Questi espianti di retina piatto montate possono essere utilizzate per immagini piani focali a livello dei tessuti profondi. Un esempio è Müller glia / nuclei neuronali di cellule progenitrici etichettati con GFP dal promotore GFAP (proteina acida gliale fibrillare) specifici per glia Müller che si trovano nella ONL durante la mitosi nella retina luce-danneggiato (figure 2A - D, 3). Ad ulteriore conferma che questo approccio è applicabile a immagine i vari strati di cellule della retina, acutamente isolate espianti di retina sono stati preparati da integro Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 occhi zebrafish che esprimono EGFP in bastoncelli sottoil promotore rodopsina. Figura 2E - H dimostra che è possibile acquisire immagini di fotorecettori rod GFP-positive e loro segmenti interni. Come segmenti interni dell'asta estendono fra fotorecettori cono verso dell'epitelio pigmentato retinico, questi dati sarebbero implicano che è anche possibile fotorecettori immagine cono. Ciò non è stato ulteriormente indagato.
Avendo osservato Müller glia / neuroni nuclei di cellule progenitrici del ONL nella retina luce-danneggiati, abbiamo caratterizzato il loro comportamento migratorio in dettaglio (figura 3 e Movie 1). Müller / neuronali nuclei delle cellule progenitrici gliali etichettati da GFP migrano bidirezionale tra la posizione basale della INL, dove di solito risiedono e la ONL, il sito di perdita dei fotorecettori. In genere, GFAP: nGFP nuclei -positive migrato a breve distanza nel INL (Figura 3A - C) prima di essere sottoposti aripartizione membrana nucleare, mentre ancora posizionato nel INL, basato sulla ridistribuzione della GFP nel citoplasma dell'intero glia Müller / neuronale cellule progenitrici (Figura 3D). Dopo la divisione cellulare nel ONL, due GFAP: nGFP nuclei -positive divenne visibile nella ONL (Figura 3F, G) che ha restituito al basale INL (Figura 3H - J). Dopo la divisione cellulare, i nuclei di recente derivanti erano inizialmente molto debole e quindi difficili da identificare (figura 3G). Tuttavia, entro uno o due intervalli di tempo dopo la mitosi, la fluorescenza GFP nucleare divenne luminoso, che ha permesso la visualizzazione della migrazione nucleare (Figura 3H - J). Live-cell imaging consentito anche la visualizzazione del piano divisione (Figura 3F, G), avvenuta orizzontalmente alla superficie apicale della retina per la cella di figura 3. È anche possibile utilizzare altre linee transgeniche zebrafish talila Tg [GFAP: EGFP] zebrafish NT11 che esprimono GFP nel citoplasma (dati non mostrati). Anche se è possibile determinare in modo affidabile il movimento apicale e divisioni cellulari orizzontali, è spesso difficile identificare esattamente la posizione dei basally migrazione nuclei figli e divisioni cellulari verticali nella Tg [GFAP: EGFP] NT11 zebrafish retina (dati non mostrati).
Per determinare la velocità, un GFAP: nGFP nucleo -positivo che non migrano durante il periodo di registrazione è stata scelta come punto di riferimento (stella, Figura 4A - E). La distanza del nucleo migrazione (linea rossa verticale, Figura 4A - E) è stata determinata in relazione al GFAP di riferimento: nGFP nucleo -positivo (linea rossa orizzontale, Figura 4A - E) ad ogni timepoint della serie di immagini alla massima XZ o YZ-proiezioni (in base al quale i nuclei angolo potrebbero essere visualized modo più efficiente). La distanza che il nucleo migrato è stata tracciata contro il tempo in un foglio di calcolo (Figura 4F - H). ripartizione membrana nucleare è stata spesso osservato nel grafico come movimento basalward iniziale a causa della ridistribuzione della GFP all'interno dell'intera cella (basali maggior parte del corpo cellulare in questo esempio). La velocità apicale è stato determinato prima della rottura membrana nucleare, il montaggio di una curva lineare di regressione (linea tratteggiata grigia, figura 4G) alla distanza complottato contro il tempo per il periodo prima della ripartizione involucro nucleare (rosso diamante, figura 4G). La pendenza 'm' della curva di regressione lineare (y = mx + c) rappresenta la velocità 'dx / dt'. La velocità apicale per la cella illustrato nella figura 4 era 10,89 micron / h. Lo stesso approccio è stato applicato per calcolare la velocità del movimento basale iniziale rapida (v b) della figlia nuclei neoformato (Figura 4F, H). Il basale migrazione velocità V B di -67,71 e 33,51 micron / h di cellule figlie D1 e D2, rispettivamente, sono stati relativamente più veloce rispetto alla velocità apicale. Purtroppo, non è stato possibile determinare la velocità apicale dopo solubilizzazione membrana nucleare come GFP diffusa in tutta l'intera cella. Invece, la velocità istantanea è stata calcolata sulla base della temporizzazione e della posizione del nucleo prima ripartizione membrana nucleare e la prima visualizzazione dei nuclei figli neoformati. La velocità istantanea di 7,9 micron / h per la cella di figura 4 è probabile una sottostima la cromatina raggiunge la ONL prima telofase della mitosi, quando i nuclei figli diventano visibili.
Per riassumere, la cultura di espianti di retina permette live-cell imaging di INM nell'adulto rigenerazione della retina zebrafish e la determinazione della migrazione e la divisione cellulare parametri dei singoli nuclei.
Figura 1: retina procedura di isolamento. A) Schema che illustra una testa zebrafish con il suo occhio. B) L'occhio viene rimosso dal zebrafish e orientato per mostrare la parte anteriore dell'occhio con la pupilla. C) Ruotare l'occhio di 180 ° in modo che la parte posteriore dell'occhio con il gambo ottica (riempito cerchio nero) diventa visibile in (D) e la pupilla rivolto verso il basso. Il colore grigio indica la presenza della sclera dell'occhio. E) Una lama di un paio di forbici McPherson-Vännäs viene inserito nel fusto ottico dell'occhio (riempito cerchio nero) per tagliare in sua dorsale e ventrale lati che è indicato dalla linea segmentata bianco. F) la metà dorsale dell'occhio dopo la metà ventrale è stato rimosso. Il mezzo cerchio nero indica tsi parte residua del gambo ottica. G) Ruotare l'occhio all'indietro per rivelare 90 ° (H) all'interno dell'occhio con la retina (marrone), vetrosa (non mostrato) e la lente (L, luce cerchio grigio) che è ancora racchiuso dalla sclera (linea grigia ). I) La sclera è stato staccato (nota, linea grigia è mancante) e J), l'obiettivo e vitreo rimossi dando luogo a solo la retina (marrone). K) Retina ruotata di 90 ° in avanti dando vita ad una vista piatta montaggio della retina dorsale (L). M) dorsale espianto della retina piatto montato su un fluorodish fondo di vetro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: 3-D RicostruzioneRetinal Multiphoton Z-Stack. A) ricostruzione 3-D di un z-stack serie di immagini multifotonica di GFAP: nGFP- cellule positive in retina culture tutto il montaggio di zebrafish, dopo 48 ore di luce-danni. B - D) multiphoton singolo xy immagini di GFAP: nGFP cellule -positive visualizzati in 3D-ricostruzione in (A) al livello del ONL (B), l'INL (C), che corrisponde al livello che contiene Müller glia soma e la GCL (D). Freccia a (B) indica un allargata rotonda glia Müller nel ONL dopo rottura membrana nucleare. E) la ricostruzione 3-D di un z-stack serie di immagini multifotonica di un espianto della retina da un integro Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] zebrafish nt19. F - H) multiphoton singolo xy-immagine con un livello dei segmenti asta interna (RIS, F), asta di strato nucleare (G) Ea livello della retina interna (H). GCL, Ganglio cellulare strato; INL, strato interno nucleare; ONL, Strato esterno nucleare; RIS, asta interna segmento. bar Scale in A, D, E ed H, 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Timelapse Immagine serie di INM. A - J) Serie di immagini di 3D-ricostruzione delle serie timelapse z-stack visualizzazione Tg [GFAP: nGFP] mi2004 nuclei -positive che subiscono INM di dividere in ONL in espianti di retina (riga superiore). La posizione di uno apicalmente migrazione nucleo e la sua figlia basale migrazione nuclei è indicato da frecce rosse. Stella rossa indica ripartizione membrana nucleare durante la mitosi. A - J, riga in basso) Ilstessa serie di immagini come nella riga superiore era troppo saturi e ritagliata di concentrarsi sulle cellule in divisione del ONL. INL, strato interno nucleare; IPL, Inner Plexiform strato; ONL, Strato esterno nucleare. Barra della scala in A, 10 micron ed è lo stesso per la B - J. prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi delle velocità di migrazione apicali e basali. A - E) Massima YZ-proiezione di una serie di immagini z-pila di Tg [GFAP: nGFP] mi2004 espianti di retina in diversi punti temporali della registrazione timelapse acquisita tramite microscopia multi-fotone. Utilizzando lo strumento linea sotto la funzione 'misura manuale', una linea orizzontale è stato posto a livello della cella di riferimento, indicato da una stella. A me verticalelinea asurement è stato posizionato a partire dalla linea orizzontale e si estende fino alla posizione basale del GFAP migrazione: nGFP nucleo -positivo. La lunghezza della linea di misura è data nelle caselle bianche sulle immagini e per leggibilità sotto le immagini. L1 = lunghezza che cellula figlia 1 migrato; L2 = lunghezza che cellula figlia 2 migrato. F) Distanza che la cella (F0) misurata in (A - E) migrato in direzione apicale e che le risultanti cellule figlie D1 e D2 migrati basale nella registrazione multiphoton timelapse. La linea rossa indica le misure per cui la velocità di migrazione apicale (v a) è stato calcolato mentre le linee nere e grigie indicano le misurazioni utilizzate per calcolare la velocità di migrazione basali (v b) per D1 e D2, rispettivamente. G, H) La distanza è stato tracciato contro il tempo in Excel per la migrazione apicale prima ripartizione involucro nucleare (G) e la fase di rapida basaledi migrazione per cellula figlia D1 (H). curve di regressione lineare sono stati montati e le funzioni sono riportati qui di seguito i grafici con la pendenza che rappresenta la velocità. INL, strato interno nucleare; IPL, Inner strato Plexiform; ONL, Strato esterno nucleare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Tg [GFAP: EGFP] NT11 | Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 | ||||||||
| potenza del laser | guadagno | potenza del laser | guadagno | ||||||
| Top (fotorecettore asta) | 13 | 126 | 3.5 | 118 | Medio (Müller glia) | 10 | 126 | 2.8 | 118 |
| Bottom (GCL) | 8 | 126 | 2.1 | 118 | |||||
Tabella 1: Laser e Gain livelli utilizzati per Z-intensità correzioni ai piani differenti per gli esperimenti visualizzati nelle figure 2 - 4.
Film 1: Imaging Live-cellula della retina espianti da Multiphoton Microscopia. (Tasto destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Gli studi che indagano i meccanismi che regolano la rigenerazione dell'adulto danneggiato retina zebrafish metodi utilizzati prevalentemente immunocitochimiche 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Stabilire condizioni alla cultura espianti di retina e per eseguire live-cell imaging su fenomeni, come INM, noi fornire una tecnica per ottenere in profondità spaziale e informazioni temporali. Questa tecnica permette di stabilire le velocità di migrazione, i tempi e la posizione di guasto membrana nucleare durante profase della mitosi e la lunghezza e la posizione della divisione cellulare. Inoltre, è possibile stabilire il piano di divisione e il destino delle cellule figlie derivanti in relazione alla loro successiva posizione. In definitiva, questo approccio potente determinerà se M2; ller glia e cellule progenitrici neuronali si comportano in modo diverso in materia di INM durante la rigenerazione della retina. L'uso di linee zebrafish transgenici che identificano cellule proliferanti nella retina rigenerante in fasi distinte della risposta rigenerazione aiuterà decifrare comportamento differenziale 6. Nel caso del microscopio multifotone usato qui, GFP linee giornalista zebrafish sono preferiti come eccitazione della proteina fluorescente rossa (RFP) non è molto efficiente; Tuttavia, altri sistemi multiphoton possono permettere efficiente eccitazione di RFP o fluorofori equivalenti.
Una delle fasi più critiche della procedura di isolamento della retina è di montaggio della retina. Retine devono essere montati più piatta possibile per la luce multiphoton poter passare i z livelli più profondi della ONL. Curvatura della retina in particolare nella regione marginale, vetrosa residua, e / o l'accumulo di agarosio sotto la coltura della retina, che viene usato per immobilizzare iltessuti, più comunemente introdurre spazio extra tra il vetrino e la cultura della retina. Inoltre, maggiore potenza laser e guadagno devono essere utilizzati per acquisire immagini con la retina non è piatta e ciò conseguentemente causare aumento photobleaching e ridotta vitalità della cultura retinica. montaggio errato spesso comporta anche la qualità delle immagini più poveri a causa della penetrazione della luce ridotta e interesserà la capacità di misurare le distanze che i nuclei erano migrati, e quindi il calcolo della velocità di migrazione.
Le velocità di migrazione apicale prima ripartizione membrana nucleare e della migrazione basale può essere determinato in modo affidabile in una serie di immagini da Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish espianti di retina. Tuttavia, attualmente non è possibile determinare la velocità di migrazione apicale della cromatina dopo solubilizzazione involucro nucleare in questa linea zebrafish transgenici come i GFP ridistribuisce durante tutto il citoplasma. Labeling di espianti di retina con il colorante nucleare Hoechst ha provocato l'assorbimento fioca in Müller nuclei glia che hanno richiesto la variazione di lunghezza d'onda di 830 nm (Lahne & Hyde, dati non pubblicati), che ha interessato la vitalità del tessuto e ha causato lo stallo del ciclo cellulare ( Lahne & Hyde, dati non pubblicati). Durante lo sviluppo della retina, Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 zebrafish che esprimono GFP fusa al istone 2 sono stati utilizzati con successo per il monitoraggio INM e determinare le velocità di migrazione nelle diverse fasi del ciclo cellulare 12, 31. In futuro, espianti di retina da Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 zebrafish sarà anche consentire la visualizzazione della cromatina durante tutto il ciclo cellulare e permetteranno l'analisi della velocità di migrazione apicale dopo rottura membrana nucleare nell'adulto rigenerazione della retina zebrafish.
Dopo aver stabilito le condizioni per monitorare INM dalive-cell imaging in espianti di retina da zebrafish adulto luce-danneggiati e la corrispondente analisi delle velocità costituirà la base per investigare i meccanismi che regolano INM. Alcuni studi hanno cominciato esaminando i meccanismi di INM nell'adulto rigenerante retina mediante immunocitochimica per determinare la posizione di mitotico fosfo-istone nuclei 3-positivi 6, 7. Tuttavia, interferendo con vie di segnalazione non può rendere la posizione della mitosi, ma potrebbe influenzare altri parametri, come la velocità, i tempi della mitosi e divisione che non sarebbe possibile / molto difficile discernere mediante immunocitochimica. In precedenza, è stato dimostrato che i nuclei mitotiche fosfo-istone 3-positivi mislocalized a posizioni più basali nella retina in mutanti dinactina e morphants 11 in via di sviluppo. Tuttavia, il successivo live-cell imaging ha rivelato che la migrazione nucleare prima della divisione cellulare è stato ritardato nella cella dinactina-compromessis, mentre un aumento della velocità di migrazione apicale abilitato nuclei raggiungere e la divisione cellulare sulla superficie apicale 11, 12. Questo esempio esemplifica il potere di live-cell imaging. Allo stesso modo, quando svelare i meccanismi che facilitano INM nell'adulto rigenerazione della retina zebrafish, studi di imaging dal vivo di cellule si completano, e in vari casi sarà vantaggioso sopra, approcci immunocitochimiche.
Come discusso sopra, live-cell imaging offre molti vantaggi rispetto ai metodi di immunoistochimica / statici; tuttavia, deve essere tenuto presente che espianti retinici sono un modello ex vivo. Come tale, i danni subiti durante la procedura di isolamento e / o cultura condizioni potrebbero influenzare processi cellulari. Inoltre, la procedura di imaging stesso può esercitare effetti tossici che possono influenzare il comportamento cellulare 23, 32. Mentre ci sono disadvantages a Live-cell imaging culture della retina, è attualmente il nostro metodo migliore per ottenere informazioni dinamiche di INM. È importante sottolineare che la procedura di imaging live-cell di espianti di retina sarà applicabile ad altre questioni biologiche durante la rigenerazione della retina. Sulla base dei dati immunocitochimiche, è stato in precedenza suggerito che glia Müller fagocitano morire fotorecettori / detriti a seguito dei danni fotorecettore indotto dalla luce 33. Regolazione dei parametri di immagine questo processo vivo verificherà se la fagocitosi dei fotorecettori che muoiono si verifica nella rigenerazione della retina zebrafish e può essere utilizzato per studiare i meccanismi alla base. Dopo aver dimostrato che le immagini possono essere acquisite a livello di nuclei asta e segmenti interni asta in Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] zebrafish nt19, dovrebbe essere possibile regolare le condizioni di immagine dei fotorecettori fagocitosi. Allo stesso modo, la conoscenza è limitata per quanto riguarda il comportamento dinamico della microglia e dei meccanismi che regolano la lorofunzione nella degenerazione della retina e rigenerazione 34, 35. Sfruttando specifici microglia zebrafish transgenico in collaborazione con live-cell imaging aumenterà anche la nostra comprensione della funzione della microglia dell'adulto rigeneranti retina zebrafish 36, 37. Per riassumere, live-cell imaging di espianti retinici è un potente strumento per ottenere informazioni dinamiche dei processi cellulari e per determinare il comportamento e la funzione dei diversi tipi di cellule nella retina rigenerante.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Apprezziamo il sostegno fornito da William Archer e il meccanismo di Notre Dame Integrated Imaging. Un ringraziamento particolare sono dirette ai tecnici Freimann Life Sciences per il loro aiuto continuo e la loro cura e l'allevamento del pesce zebra. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Eye Institute di NIH per DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) e il Centro per la ricerca Zebrafish, Università di Notre Dame, Notre Dame, IN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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