Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Culture of Adult Transgene Sebrafisk Netthinne explants for Live-celle Imaging av multiphoton Mikros

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Summary

Sebrafisk retinal regenerasjon har for det meste blitt undersøkt ved hjelp av faste netthinner. Men dynamiske prosesser som interkinetic atom migrasjon oppstår under regenerativ respons og krever levende celle bildebehandling for å undersøke de underliggende mekanismene. Her beskriver vi kultur og bilde forhold til å overvåke Interkinetic Nuclear Migration (INM) i sanntid ved hjelp multiphoton mikroskopi.

Abstract

En endogen regenerering Programmet er initiert av Müller gliaceller i den voksne sebrafisk (Danio rerio) hinnen etter neuronal skade og død. De Müller gliaceller re-gå inn i cellesyklus og produsere nevrale stamceller som gjennomgår påfølgende runder av celledelinger og differensiere inn de tapte nevronale celletyper. Både Müller gliaceller og nevronale stamfar cellekjerner kopiere deres DNA og gjennomgå mitose i forskjellige steder i netthinnen, dvs. de vandrer mellom basal Indre Nuclear Layer (INL) og Ytre Nuclear Layer (onl), henholdsvis i en prosess beskrevet som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM har hovedsakelig blitt studert i utviklingshinnen. For å undersøke dynamikken i INM i den voksne regenererende sebrafisk netthinnen i detalj, er levende celle avbildning av fluoresceinmerkede Müller gliaceller / nevrale stamceller nødvendig. Her gir vi betingelsene for å isolere og kultur rygg netthinnefra Tg [GFAP: nGFP] mi2004 sebrafisk som ble utsatt for konstant intens lys for 35 timer. Vi viser også at disse retina kulturer er levedyktig for å utføre levende celle bildebehandling eksperimenter, kontinuerlig å anskaffe z-stack-bilder i hele tykkelsen av retinal eksplantat i opptil 8 timer under anvendelse av multiphoton mikroskopi for å overvåke vandringsadferd av GFAP: nGFP-positive celler . I tillegg beskriver vi detaljene til å utføre post-bildeanalyse for å bestemme hastigheten av apikale og basal INM. For å oppsummere, etablerte vi forutsetninger for å studere dynamikken i INM i en voksen modell av neuronal regenerering. Dette vil fremme vår forståelse av denne viktige cellulære prosessen og tillate oss å bestemme hvilke mekanismer som styrer INM.

Introduction

I motsetning til mennesker, sebrafisk (Danio rerio) viser en robust regenerering svar på celledød av netthinnens nerveceller 1, 2, 3, 4. Tumornekrosefaktor α, et signalmolekyl som frigjøres fra å dø netthinnens nerveceller induserer Müller gliaceller bosatt i basal Indre Nuclear Layer (INL) av netthinnen, for å spre fem og produsere nevrale stamceller som fortsetter å spre seg før differensiere inn i nevronale celle typer som døde 2, 3, 4. Under den proliferative fase av regenereringen respons, kjerner av Müller gliaceller og deres avledet neuronal forløperceller gjennomgå et repeterende mønster trekkende i fase med cellesyklusen (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 > 7. Kjerner plassert i basal INL kopiere deres DNA før migrere til ytre Nuclear Layer (onl) hvor de deler før de oppstår atomkjerner tilbake basalt til INL. Denne fremgangsmåten ble først beskrevet under neuroepithelial utvikling ved hjelp av histologiske metoder, mens levende celle bildedannende fremgangsmåter senere bekreftet tolkningen av Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Både histokjemiske og lever-cellebilde tilnærminger er blitt benyttet for å bestemme mekanismene bak INM og dens funksjon i å utvikle neuroepithelia herunder netthinnen 9, 11, 12, 13. Imidlertid har de mekanismene som styrer INM i voksen regenererende hinnen ikke blitt undersøkt i mye detaljxref "> 6, 7. Lev-cell imaging vil være en uvurderlig måte å fremme vår kunnskap om signalveier som styrer INM i voksen regenererende hinnen.

Inntil nylig var levende celle avbildning av INM i netthinnen begrenset til enten levende sebrafisk embryo eller foster dama eller postnatal mus retinal explants 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mens retinal explants fra voksne dyr av ulike arter, inkludert mus, rotte og sebrafisk har blitt utnyttet for annen celle biologiske tilnærminger 17, 18, 19, 20, live-cell imaging eksperimenter med retinal eksplanter hahar vært begrenset til korte perioder av gangen, og har ikke blitt utført kontinuerlig over flere timer 21, 22. Her beskriver vi en detaljert protokoll til kultur lys-skadet voksne sebrafisk netthinner å opptre live-celle bildebehandling eksperimenter overvåking INM ved hjelp av multi-foton mikroskopi 6. Levende celler bilde tilnærminger er fordelaktig i forhold immunhistokjemiske metoder når undersøke hvilke mekanismer som styrer INM, som dynamikken i INM, f.eks hastigheter kan bli påvirket snarere enn plasseringen av mitose, som ville potensielt ikke oppdages ved hjelp immunocytochemistry.

I fremtiden, har denne fremgangsmåte også potensiale til å bli modifisert for å studere andre dynamiske prosesser i løpet av retinal regenerasjon, slik som fagocytose av døende fotoreseptorene hos Müller gliaceller eller oppførselen til mikroglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Sebrafisk ble reist og vedlikeholdes i Notre Dame Sebrafisk-anlegget i Freimann Life Sciences Center. Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet er godkjent av University of Notre Dame Animal Care og bruk Committee og er i samsvar med uttalelsen for bruk av dyr i et syn forskning av Association for Research in Vision og oftalmologi.

1. Solutions

  1. Forbered 70% etanol for å sterilisere vevskultur panseret og noe utstyr / reagenser som overføres inn i vev kultur hette.
  2. Tilsett 2 ml 2-fenoksyetanol til 1 liter system vann (1: 500 2-fenoksyetanol).
  3. Forbered 0,1 mM NaHCO3, pH 8,0. Bruke en 10 ml sprøyte og en 0,2 um porestørrelse sprøytefilter for å sterilisere oppløsningen i en sterilisert vevskultur hette.
    MERK: NaHCO3 benyttes for effektivt å spre celler og vev klebemiddel på tvers av dekkflaten av fluorodishes (setrinn 3.2).
  4. Forbered 1,0 M CaCl 2 og 1,0 M MgCl2. Sterilisere med en 10 ml sprøyte og 0,2 um porestørrelse sprøytefilter i en sterilisert vevskultur hette.
  5. For å fremstille Hank's-balanserte saltløsning (HBSS), tilsett steril CaCl2 og MgCl2 sterilt til 1 x HBSS uten Ca2 + / Mg2 +, uten fenol-rødt ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM hver. Arbeid i et sterilt miljø.
  6. For å fremstille dyrkingsmedium, blander 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM), uten fenol rød, 25% HBSS inneholdende CaCl2 og MgCl2 (se avsnitt 1.4), 25% hesteserum (HS), 10 enheter / ml penicillin og 10 ug / mL streptomycin. Arbeid i et sterilt miljø.
    MERK: Unngå medium som inneholder fenol rødt som det autofluoresces, og dermed påvirke signal til støyforhold. 23
  7. Fremstille 10 ml av 1% lavt smeltepunkt agarose i 1 x MEM uten fenolrødt. Smelt agarose / 1x MEM bruke en mikave. Forbered små volumer av agarose (f.eks 10 ml) som repeterende oppvarming vil endre ion konsentrasjoner på grunn av væske fordampning.
  8. Før dyrking, sterilisere 1,5 ml Mikrosentrifugerør ved autoklave.

2. Lys-skade Paradigm

  1. Dark-tilpasning
    1. Plasser 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 sebrafisk (eller annen transgen sebrafisk av interesse) 6 - 14 måneders alder inn i et miljø blottet for lys for 14 d. For nærmere se referanse 2, 6, 24, 25.
  2. Plasser tank som inneholder 2-3 dark-tilpasset transgen sebrafisk i system vann mellom to lysrør som avgir lys av 2800 lux 2, 6, 24, 25. Expose sebrafisk til konstant intens lys for 35 timer. I løpet av lyseksponering, sikre at vanntemperaturen holdes mellom 31-33 ° C.

3. Forberedelse til dyrking (På dag Retinal Isolation)

  1. Ved hjelp av 70% etanol, sterilisere vevskultur panseret og komponenter / verktøy som overføres inn i vevskultur panseret (for eksempel flasker inneholdende MEM og HBSS, pipetter, sterile pipettespisser, osv.).
  2. Utarbeidelse av fluorodishes
    1. Coat en fluorodish for hver retina med celler og vev lim (se tabell for material).
    2. Fortynn cellen og vevlimet i 0,1 mM NaHCO3 til en sluttkonsentrasjon på 70 ug / ml, tilsett 50 ul til hver fluorodish og spre oppløsningen over midten av den fluorodish med en 200 ul pipette (omtrent 1 til 1,2 cm diameter ).
    3. Inkuber de belagte fluorodishes 1 - 3 timer ved RT, (Alternativt inkuber O / N ved 4 ° C).
    4. Fjern løsningen og skyll 3x med 500 mL av 1x MEM for hver vask. For å unngå de belagte fluorodishes fra å tørke ut, holde dem i MEM til netthinnens explants er montert.
  3. Forbered kulturmedium som beskrevet i trinn 1.6. Kulturmediet kan lagres i opp til en uke ved 4 ° C.

4. Isolering og dyrking av Retinal explants

MERK: Protokollen beskrevet nedenfor er for isolering av dorsal netthinnen, som er den retinal region som er hovedsakelig lesjonerte av den beskrevne lys-skade paradigme. Derfor skade-indusert proliferasjon og den tilhørende tilfelle av interkinetic atom migrasjon forekomme i dorsal hinnen. Imidlertid kan isoleringsprosedyren bli justert for å gi retinal regioner i henhold til de spesifikke krav til forskeren / problemstillingen.

  1. Avlive en lys-skadet transgen sebrafisk enta tid i 1: 500 2-fenoksyetanol.
  2. Fjern MEM fra en fluorodish med en 1000 ul pipette, slik at bare en tynn film av flytende rester.
  3. Overfør sebrafisk på en tørr tørkepapir, fjerne øyet med en buet par Dumont tang (tang # 5, 45 ° vinkel) og overføre den på fluorodish.
  4. Ved hjelp av en stereomikroskop, orientere øyet med eleven på dekkglass av fluorodish slik at baksiden av øyet med den optiske nerven er synlig (figur 1D).
  5. Med et par McPherson-Vännäs saks fjerne den optiske nerven, skjæring nær den bakre del av øyet. I tillegg fjerne bindevevs lining utsiden av øyet.
  6. Hold øye mellom sin nese og tidsmessig side med et par # 5 tang mens du lager et snitt på syns stilken av piercing med en saks blad gjennom lamina cribrosa og klippe langs både nese og tidsmessige sider av øyet (se figur 1E , segmentert line).
  7. Ved hjelp av to par # 5 tang, en for å holde den dorsale side av netthinnen og det annet par for å skille den ventrale fra den dorsale hinnen, trekke vev.
    MERK: Det anbefales å orientere rygghinnen slik at linsen og ganglion celle laget står overfor dekkglass mens sclera vender oppover.
  8. Fjern sklera fra den dorsale hinnen med ett par # 5 tang, samtidig holder den linse som er koblet til netthinnen med et andre par # 5 tang (figur 1 H, I).
  9. Ta av objektivet, bruker McPherson-Vännäs saks og klipp bak linsen uten å skade netthinnen (Figur 1I, J). Noen ganger skiller objektivet i trinn 4.7. I dette tilfellet, fjerner sclera forsiktig med pinsett ved å holde netthinnen på en klippekanten med en andre par # 5 tang.
  10. Fjern glasslegemet mens du fjerner objektivet uten å skade netthinnen. Flat netthinnen med ganglion celle laget vender mot dekselet slipav den fluorodish (figur 1 L, M).
  11. Omgir netthinnen med 10 ul av 1% lavt smeltepunkt agarose og la den stivne agarose.
  12. Se at væsken agarose ikke løfte netthinnen som selv en svak økning kan påvirke evnen til å fokusere dypt inn i vevet. Hvis løfting er observert, bruk en pipette til å fjerne agarose. La oss gjenværende agarose sett før du prøver å legge til flere.
  13. Gjenta trinn 4,12 flere ganger før tilsetning av 1% agarose med lavt smeltepunkt for å dekke hele fluorodish. Når agarose har stivnet, tilsett 1,5 ml kulturmedium.
  14. Opprettholde retinal eksplantering kultur i en 5% CO 2 / luft miljø innstilt på 32 ° C i ca 12 timer å tillate netthinnen til å gjenopprette fra stress påført isoleringsprosedyren. Sett temperaturen på 32 ° C for å opprettholde netthinne ved samme temperatur som lys-behandlede sebrafisk (se trinn 2.3).

5. multiphoton Mikroskopi

tabell of Materials), en 40X Apo lang avstand vann nedsenking objektiv (NA 1,15), en galvano skanner og en miljø kammer som inneholder en innsats for fire 35 mm petriskåler. Bildene ble kjøpt med en ikke-descanned detektor (R-NDD).

  1. Før avbildning, ekvilibrere miljøkammeret for å oppnå en 5% CO2 / luftatmosfære. Sørge for at tomme Petri-skåler settes inn i holderen for å unngå lekkasje av gass inn i rommet.
  2. Slå på mikros system.
  3. Når miljøkammeret er i likevekt, legge brytningsindeks væske på 40X Apo lang avstand vann nedsenking objektiv (NA 1,15).
    MERK: brytningsindeks væske med optiske egenskaper som ligner på vann brukes for å unngå fordamping av vann ved langtids bildebehandling.
  4. Place influensaorodishes med retinal eksplantater inn i kammeret. Ved hjelp av lysfelt lys, plasserer prøven i lysbanen og bringe midregion av rygghinnen inn i flyet av fokus.
  5. Bruk GFP epifluorescent lys til å fokusere på GFAP: nGFP -positive Müller gliaceller kjerner (figur 2A, C).
    MERK: Hvis explants ikke er montert flat eller agarose akkumulert under eksplantering, vil det være vanskelig å fokusere på GFAP: nGFP -positive kjerner eller de vil fluoresce svakt.
    1. Sjekk om å flytte til en annen region i samme retinal eksplantering vil overvinne fokus problemet. Ellers flytte til en annen retinal eksplantering.
  6. I bildet oppkjøpet programvare, åpne 'A1 MP GUI ", den" TiPad ", den" A1 Compact GUI' og 'ND oppkjøps' vinduer. For multiphoton bildebehandling, sørge for at den "IR NDD alternativet er valgt i" A1 Compact GUI '.
  7. I "stilling 'feltet velger IR-DM for en st dichroic speil og velg band pass filter 525/50 å tilegne GFP fluorescens.
  8. Slå på IR laser i vinduet merket "A1MP GUI '. Det vil ta noen minutter for laseren å være klar. Sett bølgelengde til 910 nm å opphisse GFP fluorescens og justere laseren ved å klikke på 'Auto justering "-knappen i" A1 MP GUI-vinduet.
  9. Pass på at rom og utstyr lysene er slått av eller dekket før du åpner lukkeren i "A1 MP GUI" for å unngå overeksponering av fotomultiplikatorrøret. For å redusere støynivået, huse mikroskop i et mørkt miljø.
  10. Hente bilder av et synsfelt på 300 x 300 piksler, på en zoom på to, og en piksel oppholdstid på 4,8 ms / pixel. Grovt sette opp laseren makt ved å endre 'oppkjøp området' i 'A1MP GUI' og gevinsten i "A1 Compact GUI-vinduet.
  11. Sette opp z-stack
    1. Fokus på ganglion celle laget for å sette toppen fokusplanet til z-stack i 'Z'-subwindow innenfor "ND oppkjøpet vinduet. Noen GFAP: nGFP-positive celler er normalt plassert i ganglion celle laget, noe som bidrar til å identifisere den basale grense av netthinnen (figur 2A, D).
    2. Beveg fokalplanet ved nivået for den onl (figur 2A, B), som er karakterisert ved nærvær av svakt merket GFAP: nGFP-positive celler som er rund og forstørret i forhold til deres motparter i den INL (figur 2A, C) .
    3. Setter dette plan som bunnen av de z-stabelen. Sørg for at hele onl skal avbildes (figur 2A, B).
    4. Når det oppstår knutepunkter flyet turnus som krever re-justering under bildebehandling perioden, dobbeltklikker du på den midterste posisjon i "z" subwindow å tildele det som "hjem" posisjon. Bytt til "symmetrisk modus definert 'og klikk "slektning".
    5. Angi størrelsen z-trinn mellom 0,7 til omkring 1 pm.
  12. Z-intensitet korreksjon:
    1. Påfør z intensitet korreksjoner for å kompensere for tap av pikselintensiteten på grunn av lysspredning når avbildning i dype lag av vevet.
    2. Slik setter du opp korreksjon, åpne 'z-intensitet korreksjon vinduet. For å sette 'z-stack range ", velg" Fra ND'.
    3. Klikk på den nederste fokusplanet i "z-intensitet korreksjon" -vinduet (i dette tilfellet tilsvarer ganglion celle laget) og sett laser intensitet ( 'oppkjøp område' i 'A1MP GUI') og gevinst (A1 Compact GUI ).
    4. Klikk på pilen ved siden av "z-verdier" i "korreksjon z-intensitet" vinduet for å bekrefte innstillingene som senere vist under "enhetsinnstillinger" i "z-intensitet korreksjon vinduet for det valgte fokusplan.
    5. Gjenta prosessen for på midten ennd topp fly, øke laser makt og vinning. Andre fokale plan kan legges om nødvendig. Se tabell 1 for spesifikke laser og gain innstillinger for eksperimenter i figur 2 - 4.
    6. Sett 'oppkjøp området "i" A1 MP GUI-vinduet. Unngå å velge en overtakelse område større enn 15 og en gevinst høyere enn 126 ved starten av bilde å omgå fotobleking og økt støynivå.
      MERK: Som lasere og fotomultiplikatorrør skiller mellom mikroskopi systemer, test laser og forsterkning for å oppnå optimale bildeforhold for mikroskopet satt opp samtidig unngå fotobleking.
    7. Velg "relativ intensitet korreksjon 'i' z-intensitet korreksjon vinduet.
  13. I "Tidsserier 'subwindow i' ND oppkjøpet vinduet, angi varigheten til 8 timer og intervallet til" ingen forsinkelse ". Så, sørg for å klikke på "Kjør z-korreksjon" i than z-stack "sub vinduet i 'ND acquisition" vinduet for å erverve 3-D Tidsserier.
  14. Oppretthold retinal eksplantater ved en temperatur på 27-29 ° C under hele bildeopptak.
  15. Gjennom bildet anskaffelsesperioden, hvis det er nødvendig, kan du justere effektnivået og gevinsten for å opprettholde bildekvaliteten for post-bildeanalyse. For justeringer utføre trinnene 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Hvis fokalplanet turnus, pause eller stoppe kjøringen og utfører trinn 5.11 igjen.
    MERK: Hvis "slektning z-korreksjon" ble valgt i trinn 5.12.7 og trinn 5.11.4 ble utført skal det ikke være nødvendig å justere kraft og forsterkningen, med mindre omfattende fotobleking skjedde.

6. Analyse av Velocity

  1. Pakk den tid, sette en region av interesse "på bildet. Bruk "tidsmåling" verktøy og eksportere tidsverdier til et regneark.
  2. Beskjære en region som inneholder en dibringelse GFAP: nGFP -positivt kjernen.
  3. Velg det beskårede området slik at det inneholder minst en kjerne som ikke gjennomgår INM for å sette et referansepunkt for deretter måle avstander som dele kjernen migrert i forhold til basal INL. MERK: For å velge en kjerne som forblir i basal INL, hjelper det å utarbeide en 3-D rekonstruksjon av tidsserie.
  4. Alternativt, hvis en GFAP: nGFP -positivt celle er observert i onl gjennom oppkjøpet perioden, bruk en vertikal linje med fast lengde spenner fra onl kjernen til basal INL for å identifisere et referansepunkt.
  5. Bruke valget 'Vis skiver view "-funksjonen, generere ortogonale projeksjoner. Deretter endre modus fra "slice" til "maksimal intensitet projeksjon '.
  6. Slå av 'xy' syn på den ortogonale maksimal projeksjon. Avhengig av retningen ved hvilken migrerende / delende kjernen er best synlig, enLSO slå av enten 'xz'- eller' yz'-visning.
  7. Klikk på de resterende bildet med høyre museknapp og trekke ut 'xz' eller 'yz'-bildeserie med "Opprett nytt dokument fra denne visningen" -funksjonen. Om nødvendig, rotere bildet.
  8. Bruke 'manuell måling' funksjon, tegne en horisontal linje over bildet på nederste nivå av kjernen som forblir i basal INL og gjennomgår INM (= referansepunkt, figur 4A - E, rød horisontal linje).
  9. Mål avstanden mellom referanselinjen og den basale punktet for det migrerende kjernen for tidsserie ved hjelp av "line-måling" verktøy i analyseprogramvare (se Figur 4A - E).
  10. Når kjerneomslaget brytes ned, måle det basale posisjonen av soma hvis det er identifiserbar som følge av diffusjon av GFP i hele cellen.
  11. Ved hjelp av en regnearkprogram, plotte avstanden et nucleus migrerte mot tiden gikk (figur 4F).
    1. For å bestemme den apikale migreringshastighet (v a), graf avstandene reist i perioden før atom konvolutt sammenbrudd inntreffer (figur 4G).
    2. Velg dataserier i diagrammet, høyreklikker med musen og sette inn en lineær regresjon kurve inkludert tilsvarende funksjon y = mx + c '. Skråningen 'm' i funksjonen representerer hastigheten, v en (figur 4G).
    3. Gjenta trinn 6.11.1 og 6.11.2 for den første fasen av rask basal migrasjon å bestemme basal migrasjon hastighet, v b (Figur 4H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isoleringen av netthinnen i henhold til fremgangsmåten beskrevet i skjematisk på figur 1 tillater dyrkning av en flat rygg retina fra lys-skadet voksen Tg [GFAP: nGFP] mi2004 sebrafisk i løpet av en periode på minst 24 timer i en 5% CO 2 / luft. Disse flat-monterte retinal explants kan brukes til bildefokusplan på dype vev nivåer. Et eksempel er Müller gliaceller / nervestamcellekjerner merkes med GFP fra Müller glia-spesifikke promoter GFAP (glial fibrillært surt protein) som er plassert i den onl i løpet av mitose i lys-skade netthinnen (figurene 2A - D, 3). For ytterligere å bekrefte at denne tilnærmingen er aktuelt å avbilde de forskjellige retinal cellelagene, ble akutt isolerte retinal explants forberedt fra uskadet Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 sebrafisk øyne som uttrykker EGFP i stavfotoreseptorene i henholdden rhodopsin promotor. Figur 2E - H viser at det er mulig å få bilder av GFP-positive stang fotoreseptoren og deres indre segmenter. Som stang indre segmenter strekker seg mellom kjegle fotoreseptorene mot retinalt pigmentepitel ville disse data antyder at det er også mulig å avbilde kjeglefotoreseptorene. Dette var imidlertid ikke videre undersøkt.

Etter å ha observert Müller gliaceller / nevronale stamfar cellekjerner i onl i lys-skadet netthinnen, preget vi deres vandringsmønstrene i detalj (figur 3 og Movie 1). Müller gliaceller / nevrale stamceller cellekjerner merket med GFP migrere begge veier mellom basal posisjonen til INL der de vanligvis bor og onl, stedet for fotoreseptoren tap. Vanligvis GFAP: nGFP -positive kjerner migrert kort avstand i INL (figur 3A - C) før de gjennomgikkatom konvolutt sammenbrudd, samtidig posisjonert i INL, basert på den omfordeling av GFP inn i cytoplasma av hele Müller gliaceller / neuronal stamceller (figur 3D). Etter celledeling i onl, to GFAP: nGFP -positive kjerner ble synlig i onl (figur 3F, G) som returneres til basal INL (Figur 3 H - J). Ved celledeling, som nylig oppstår atomkjerner i utgangspunktet var veldig svak, og derfor vanskelig å identifisere (figur 3G). Men innen ett til to tidsrammer etter mitose, ble atom GFP fluorescens lys, noe som muliggjorde visualisering av atom migrasjon (figur 3 H - J). Levende celler avbildning også tillot visualisering av divisjonen planet (figur 3F, G), som oppstod horisontalt til den apikale overflate av netthinnen for cellen vist i figur 3. Det er også mulig å bruke andre transgene linjer sebrafisk slikesom Tg [GFAP: EGFP] nt11 sebrafisk som uttrykker GFP i cytoplasma (data ikke vist). Selv om det er mulig å sikkert fastslå apikale bevegelse og horisontale celledelinger, er det ofte vanskelig å nøyaktig identifisere posisjonen til basalt trekkende datter kjerner og vertikale celledelinger i Tg [GFAP: EGFP] nt11 sebrafisk netthinnen (data ikke vist).

For å bestemme hastigheten, en GFAP: ble nGFP -positivt kjerne som ikke vandrer gjennom hele registreringsperioden valgt som referansepunkt (stjerne, 4A - E). Avstanden til migrerende kjernen (vertikal rød linje, 4A - E) ble bestemt i forhold til referanse GFAP: nGFP -positivt nucleus (horisontal rød linje, 4A - E) ved hver endepunktet i bildeserien på maks xz eller yz-projeksjoner (avhengig på hvilken vinkel kjernen kan være visualized mest effektivt). Avstanden at kjernen migrerte ble plottet mot tid i et regneark (figur 4F - H). Kjernemembranen sammenbrudd ble ofte observert i diagrammet som en innledende basalward bevegelse på grunn av re-fordeling av GFP i hele cellen (basal meste av cellekroppen i dette eksempel). Den apikale hastighet ble bestemt før atom konvolutt sammenbrudd, passer en lineær regresjon kurven (grå stiplet linje, figur 4G) til avstanden plottet mot tiden for perioden før atom konvolutt sammenbrudd (rød diamant, figur 4G). Skråningen 'M' fra den lineære regresjonskurve (y = mx + c) representerer den hastighet 'dx / dt.' Den apikale hastighet for cellen vist i figur 4 var 10,89 um / h. Den samme metode ble benyttet for å beregne hastigheten av initiell rask bevegelse basal (v b) i den nylig dannede datter kjerner (figur 4F, H). Den basale migrasjon hastigheter v b -67,71 og 33.51 mikrometer / h av dattercellene D1 og D2, henholdsvis, var forholdsvis raskere enn den apikale hastighet. Dessverre var det ikke mulig å bestemme den apikale hastigheten etter atom konvolutt sammenbrudd som GFP diffundert gjennom hele cellen. I stedet ble den øyeblikkelige hastighet beregnes basert på tidspunkt og posisjonen til kjernen før kjerne konvolutt sammenbrudd og den første visualisering av de nylig dannede datter kjerner. Den øyeblikkelige hastighet på 7,9 um / h for cellen vist i figur 4 er sannsynligvis en undervurdering som kromatin når onl før telophase av mitose, når datter kjerner blir synlige.

For å oppsummere, kulturen av netthinnens explants gjør levende celle avbildning av INM i voksen regenererende sebrafisk netthinnen og bestemmelse av migrasjon og celledeling pameterne av individuelle kjerner.

Figur 1
Figur 1: Retinal isoleringsprosedyren. A) Skjematisk illustrerer en sebrafisk hodet med sine øyne. B) Øyet blir fjernet fra sebrafisk og orientert for å vise den foran øyet med eleven. C) Slå øyet 180 ° slik at baksiden av øyet med optisk stilken (fylt svart sirkel) blir synlig i (D) og eleven vender nedover. Den grå fargen indikerer nærværet av senehinnen i øyet. E) ett blad av et par McPherson-Vännäs saks er satt inn i den optiske stilken av øyet (fylte svart sirkel) for å dele den op i sin dorsale og ventrale side som er indikert med hvite segmenterte linjen. F) Dorsal halvdel av øyet etter den ventrale halvdel ble fjernet. Den svarte halvsirkel indikerer than gjenværende del av den optiske stilken. G) Drei øyet 90 ° bakover for å avdekke (H) på innsiden av øyet med retina (brun), glass (ikke vist) og linsen (L, lys grå sirkel) som fremdeles er omsluttet av senehinnen (grå linje ). I) sclera ble løsrevet (merk, mangler grå linje) og J) linsen og glasslegemet fjernet gir opphav til bare netthinnen (brun). K) Retina slått 90 ° fremover gir opphav til en flat-mount visning av rygghinnen (L). M) Dorsal retinal explant flatskjerm-montert på en glassbunn fluorodish. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: 3-D Rekonstruksjon avNetthinne multiphoton Z-stabler. A) 3-D rekonstruksjon av et multiphoton z-stabel bilde serie av GFAP: nGFP- positive celler i retina hel-typen kulturer fra sebrafisk etter 48 timer med lys-skade. B - D) Enkelt multiphoton xy-bilder av GFAP: nGFP-positive celler som vises i 3D-rekonstruksjon i (A) på nivå med den onl (B), INL (C), noe som tilsvarer laget som inneholder Müller gliaceller soma og GCL (D). Pil i (B) viser en forstørret runde Müller gliaceller i onl etter atom konvolutt sammenbrudd. E) 3-D rekonstruksjon av en multiphoton z-stack bildeserie av en retinal eksplantering fra en uskadet Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 sebrafisk. F - H) enkel multiphoton xy-bilder på nivået av stang- indre segmenter (RIS, F), stang kjernelaget (G) Og på nivå med den indre hinnen (H). GCL, ganglion celle laget; INL, Indre Nuclear lag; Onl, Ytre Nuclear lag; RIS, Rod indre segment. Scale bar i A, D, E og H, 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Timelapse Bilde Series of INM. A - J) Bilde serie av 3D-rekonstruksjon av z-stack timelapse-serien viser Tg [GFAP: nGFP] mi2004 -positive kjerner som gjennomgår INM å dele i onl i netthinnens explants (øverste rad). Plasseringen av en apikalt migrere kjernen og dens basalt migrere datter kjerner er angitt med røde piler. Rød stjerne indikerer kjernefysisk konvolutt sammenbrudd under mitose. A - J, nederste rad) Thesamme bilde serie som i den øverste raden var overeksponert og beskåret for å fokusere på de dele celler i onl. INL, Indre Nuclear lag; IPL, Indre Plexiform lag; Onl, Ytre Nuclear Layer. Scale bar i A, 10 mikrometer og er den samme for B - J. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Analyse av apikal og Basal Migrasjon Hastigheter. A - E) Maksimal YZ-projeksjon av en z-stack bildeserie av Tg [GFAP: nGFP] mi2004 retinal explants på ulike tidspunkter av timelapse-opptak kjøpt av multi-foton mikroskopi. Ved hjelp av linjeverktøyet under "manuell måling" funksjon, ble en horisontal linje som er lagt inn ved nivået for referansecellen, angitt med en stjerne. En vertikal megasurement linje ble plassert starter på den horisontale linje og som strekker seg til basal stillingen av migrerende GFAP: nGFP -positivt kjerne. Lengden på målings-linjen er gitt i de hvite boksene på bildene og er leselig under bildene. L1 = lengde som datter celle en migrert; L2 = lengde som datter celle to migrert. F) Avstand at cellen (F0) målt i (A - E) migrerte apikalt og at det oppstår dattercellene D1 og D2 migrerte basalt i multiphoton timelapse opptaket. Den røde linje viser målingene for hvilken den apikale migreringshastighet (v a) ble beregnet mens de sorte og grå linjer indikerer målingene brukes for å beregne den basale migreringshastigheter (v b) for D1 og D2, respektivt. G, H) Avstanden ble plottet mot tid i Excel for apikale migrasjon før kjerne konvolutt nedbrytning (G) og fasen for hurtig basalmigrasjon for datteren celle D1 (H). Lineær regresjon kurver ble montert og funksjoner er gitt nedenfor diagrammene med den helling som representerer hastigheten. INL, Indre Nuclear lag; IPL, Indre Plexiform laget; Onl, Ytre Nuclear Layer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tg [GFAP: EGFP] nt11 Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19
laser makt gevinst laser makt gevinst
Top (stang fotoreseptoren) 1. 3 126 3,5 118 Middle (Müller gliaceller) 10 126 2.8 118
Bunn (GCL) 8 126 2.1 118

Tabell 1: Laser og får nivåer brukt for Z-Intensity Korreksjoner på forskjellige plan for eksperimenter vist i figur 2 - 4.

Figur 2
Film 1: Levende celler Imaging av Retinal explants av multiphoton Mikros. (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Studier som undersøker de mekanismene som styrer regenerering av skadet voksen sebrafisk netthinnen hovedsakelig brukte immunocytokjemiske metoder 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Etablering forhold til kultur retinal explants og å opptre live-cell imaging på fenomener som INM, gi oss en teknikk for å få i dybden romlig og tidsmessig informasjon. Denne teknikken gjør det mulig å bestemme vandringshastigheter, timing og plassering av kjernefysisk konvolutt sammenbrudd under prophase av mitose og lengde og plassering av celledeling. Dessuten er det mulig å etablere delingen planet og skjebnen til datterceller som oppstår i forhold til deres påfølgende plassering. Til syvende og sist vil dette kraftfull tilnærming avgjøre om M2; ller gliaceller og nevrale stamceller oppfører seg annerledes i forhold til INM under retinal regenerasjon. Bruken av transgene sebrafisk linjer som identifiserer prolifererende celler i regenererende hinnen på forskjellige stadier av regenerering svar vil hjelpe å tyde differensial oppførsel 6. I tilfelle av multiphoton mikroskop brukes her, er GFP reporter sebrafisk linjer foretrukket som eksitasjon av Red Fluorescent Protein (RFP) er ikke veldig effektiv; imidlertid, kan andre multiphoton systemer tillater effektiv eksitasjon av RFP eller tilsvarende fluoroforer.

En av de mest kritiske trinn i isoleringsprosedyren retinal er montering av netthinnen. Netthinne må monteres så flat som mulig for multiphoton lett å være i stand til å passere til de dypere z-nivåer i onl. Krumning av netthinnen særlig i kantområdet, gjenværende glasslegemet, og / eller akkumulering av agarose under retinal kultur, som brukes for å immobiliserevev, som oftest innføre ekstra plass mellom dekkglass og retinal kulturen. I tillegg økte laser makt og vinning må brukes til å hente bilder hvis netthinnen er ikke flat, og dette vil dermed føre til økt fotobleking og redusert levedyktighet av retinal kultur. Ukorrekt montering ofte resulterer også i dårligere bildekvalitet på grunn av redusert lys gjennomtrengning, og vil påvirke evnen til å måle avstander som kjerner hadde migrert, og derfor beregning av migreringshastigheter.

Hastighetene for apikal migrasjon før atom konvolutt sammenbrudd og basal migrasjon kan fastslås med sikkerhet i en bildeserie fra Tg [GFAP: nGFP] mi2004 sebrafisk retinal explants. Det er imidlertid for tiden ikke er mulig å bestemme hastigheten av apikal vandring av kromatin etter atom konvolutt sammenbrudd i denne transgene sebrafisk linje som GFP, fordeles gjennom hele cytoplasmaet. Labeling av netthinnens explants med atom fargestoffet Hoechst resulterte i dim opptak i Müller gliaceller kjerner som krevde endringen i bølgelengde 830 nm (Lahne & Hyde, upubliserte data), som påvirket levedyktigheten av vevet og forårsaket blokkering av cellesyklusen ( Lahne & Hyde, upubliserte data). Under retinal utvikling, Tg [h2afva: h2afva-GFP] har kca6 sebrafisk som uttrykker GFP smeltet til histone to blitt brukt til å overvåke INM og bestemme migrasjonshastigheter på ulike stadier av cellesyklus 12, 31. I fremtiden retinal explants fra Tg [h2afva: h2afva-GFP] vil kca6 sebrafisk også aktivere visualisering av kromatin gjennom cellesyklusen og vil tillate analyse av den apikale migrasjonshastigheten etter kjernemembranen sammenbrudd i den voksne regenererende sebrafisk netthinnen.

Etter å ha etablert vilkårene for å overvåke INM avLive-celle bildebehandling i netthinnens explants mot lys-skadet voksen sebrafisk og tilsvarende analyse av hastigheter vil danne grunnlag for å undersøke hvilke mekanismer som styrer INM. Noen studier begynte å undersøke mekanismer for INM i den voksne regenererer netthinnen ved å bruke immunocytokjemi for å bestemme plasseringen av mitotiske fosfo-histon 3-positive kjerner 6, 7. Imidlertid interfererer med signaliseringsveier kan ikke gjengi stillingen av mitose, men kan påvirke andre parametre slik som hastighet, timingen av mitose og divisjon som ikke ville være mulig / meget vanskelig å skjelne ved immunocytokjemi. Tidligere ble det vist at fosfo-histon-3-positive kjerner mitotiske mislocalized til flere basal stillinger i den tredje netthinnen i dynactin mutanter og morphants 11. Men påfølgende levende celle bildebehandling avslørte at atom migrasjon før celledeling ble forsinket i dynactin-kompromittert celles, mens en økt apikal migrasjon hastighet aktivert kjerner å nå og å gjennomgå celledeling ved apikale overflaten 11, 12. Dette eksemplet eksemplifiserer kraft levende celle bildebehandling. Tilsvarende når rakne mekanismer som letter INM i voksen regenererende sebrafisk netthinnen, vil levende celle imaging studier utfylle, og i ulike tilfeller vil være fordelaktig i forhold, immunocytokjemiske tilnærminger.

Som diskutert ovenfor, levende celle avbildning gir mange fordeler i forhold til immunhistokjemiske / statiske metoder; Men, det må være oppmerksom på at netthinnens explants er en ex vivo modell. Som sådan, skader påført under isoleringsprosedyren og / eller dyrkningsforhold kan påvirke cellulære prosesser. I tillegg kan avbildningsprosedyren selv utøver toksiske virkninger som kan påvirke cellulær oppførsel 23, 32. Mens det er disadvantages å leve-cell imaging av netthinnens kulturer, er det i dag vårt beste metoden for å oppnå dynamisk informasjon fra INM. Viktigere, vil live-cell imaging prosedyre av netthinnens explants være aktuelt for andre biologiske spørsmål under retinal regenerasjon. Basert på immunocytokjemiske data, ble det tidligere foreslått at Müller gliaceller fagocyttere døende fotoreseptorene / rusk etter lys-indusert fotoreseptoren skader 33. Justere parameterne til bilde denne prosessen Live vil bekrefte om fagocytose av døende fotoreseptorene skjer i regenererende sebrafisk netthinnen og kan brukes til å studere de underliggende mekanismene. Etter å ha vist at bilder kan bli kjøpt på nivå med stang kjerner og stang indre segmenter i Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 sebrafisk, bør det være mulig å justere betingelsene til bilde fotoreseptoren fagocytose. Tilsvarende er kunnskapen begrenset når det gjelder dynamiske egenskaper microglia og mekanismene som styrer deresfunksjon i degenereres og regenererende hinnen 34, 35. Utnyttelse microglia spesifikke transgen sebrafisk i forbindelse med levende celle bildebehandling vil også øke vår forståelse av funksjon av microglia i den voksne regenererende sebrafisk netthinnen 36, 37. For å oppsummere, er levende celle avbildning av netthinnens eksplantater et kraftig verktøy for å oppnå dynamisk informasjon av cellulære prosesser og for å bestemme oppførselen og funksjon av forskjellige celletyper i den regenererende hinnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi setter pris på støtten fra William Archer og Notre Dame Integrated Imaging Facility. Spesiell takk rettes til Freimann Life Sciences teknikere for deres kontinuerlig hjelp og deres omsorg og dyrehold av sebrafisk. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Eye Institute of NIH til DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) og Senter for Sebrafisk Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

Tags

Developmental Biology retinal explant multiphoton mikroskopi live-cell imaging sebrafisk interkinetic atom migrasjon kultur gjenfødelse Müller gliaceller mitose hastighet
Culture of Adult Transgene Sebrafisk Netthinne explants for Live-celle Imaging av multiphoton Mikros
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,… More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter