Summary
Zebrafisk retinal förnyelse har mestadels studerats med hjälp av fasta näthinnor. Men dynamiska processer såsom interkinetic kärn migration inträffar under den regenerativa svar och kräver levande cell imaging att undersöka de bakomliggande mekanismerna. Här beskriver vi kultur och avbildningsbetingelser för att övervaka Interkinetic Nuclear Migration (INM) i realtid med hjälp av multifotonmikroskop.
Abstract
En endogen förnyelseprogram initieras av Müller glia i den vuxna zebrafisk (Danio rerio) näthinnan efter nervskada och dödsfall. Muller Glia tillbaka in i cellcykeln och producera neuronala progenitorceller som genomgår efterföljande omgångar av celldelning och differentierar till de förlorade neuronala celltyper. Både Müller Glia och neuronal progenitor cellkärnor replikera sitt DNA och genomgår mitos i distinkta platser i näthinnan, dvs de migrerar mellan de basala Inre Kärn- Layer (INL) och yttre kärnlagret (ONL), respektive, i en process som beskrivs som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM har främst studerats i utvecklings näthinnan. För att undersöka dynamiken i INM i vuxen regenererande zebrafisk näthinnan i detalj krävs levande cell imaging av fluorescensmärkta Müller glia / neuronala stamceller. Här ger vi förutsättningar för att isolera och kultur rygg näthinnorfrån Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk som utsattes för konstant intensivt ljus för 35 h. Vi visar också att dessa retinala kulturer är lönsamt att utföra levande cell imaging experiment kontinuerligt förvärva z-stack bilder hela tjockleken av näthinnans Explantation för upp till 8 h med multifotonmikroskop att övervaka migrations beteende GFAP: nGFP -positiva celler . Dessutom beskriver vi detaljerna att utföra efter bildanalys för att bestämma hastigheten för apikala och basala INM. Sammanfattningsvis har vi etablerat förutsättningar för att studera dynamiken i INM i en vuxen modell av neuronal regeneration. Detta kommer att öka vår förståelse av denna viktiga cellulär process och ger oss möjlighet att bestämma de mekanismer som styr INM.
Introduction
Till skillnad från människor, zebrafisk (Danio rerio) uppvisar en robust regeneresvar vid celldöd av retinala neuroner 1, 2, 3, 4. Tumörnekrosfaktor α, en signalerande molekyl som frisätts från döende retinala neuroner inducerar Muller Glia bosatt i basal Inre Kärn- Layer (INL) av näthinnan, att proliferera 5 och producera neuronala progenitorceller som fortsätter att föröka sig före differentiera till den neuronala cellen typer som dog 2, 3, 4. Under den proliferativa fasen av förnyelse svar kärnorna av Müller glia och deras härledda neuronala stamceller genomgå en repetitiv migrationsmönster i fas med cellcykeln (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 >, 7. Kärnor placeras i de basala INL replikera sitt DNA innan den vandrar till yttre kärnlagret (ENDA) där de delar innan de uppstår kärnorna återgår basalt till INL. Denna process beskrevs först under neuroepiteliala utveckling med histologiska metoder, medan levande celler avbildning senare bekräftade tolkningen av Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Både histokemiska och live-cell imaging metoder har använts för att bestämma mekanismerna bakom INM och dess funktion i att utveckla neuroepithelia inklusive näthinnan 9, 11, 12, 13. Däremot har de mekanismer som styr INM i vuxen regenere näthinnan inte studerats i stor detaljxref "> 6, 7. Live-cell imaging kommer att vara en ovärderlig metod för att förbättra vår kunskap om de signalvägar som styr INM i vuxen regenere näthinnan.
Tills nyligen var levande cell imaging av INM i näthinnan begränsad till antingen levande zebrafisk embryon eller embryonala chick eller postnatal mus näthinnan explants 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Medan näthinnan explants från vuxna djur av en mängd olika arter, inklusive mus, råtta och zebrafisk har använts för olika cellbiologiska metoder 17, 18, 19, 20, imaging levande cell experiment med användning av retinala explants have varit begränsad till korta tidsperioder och har inte utförts kontinuerligt under flera timmar 21, 22. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att odla ljus skadade vuxna zebrafisk näthinnor att utföra levande cell imaging experiment övervakning INM med hjälp av multi-foton mikroskopi 6. Live-cell imaging metoder är fördelaktiga över immunhistokemiska metoder när man undersöker de mekanismer som styr INM, eftersom dynamiken i INM, till exempel, hastigheter kan påverkas snarare än placeringen av mitos, som eventuellt inte kan upptäckas med hjälp av immuncytokemi.
I framtiden, har denna metod också potential att ändras för att studera andra dynamiska processer under retinal förnyelse, såsom fagocytos att dö fotoreceptorer från Müller glia eller beteende mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Zebrafish höjdes och underhållas i Notre Dame Zebrafish anläggning i Freimann Life Sciences Center. De metoder som beskrivs i detta manuskript är godkända av University of Notre Dame Animal Care och användning kommittén och är i överensstämmelse med uttalandet för användning av djur i en syn forskning av Föreningen för forskning i Vision och Ophthalmology.
1. Lösningar
- Förbered 70% etanol för att sterilisera vävnadsodling huva och all utrustning / reagenser som överförs till vävnadsodling huven.
- Tillsätt 2 ml av 2-fenoxietanol till 1 L av systemvatten (1: 500 2-fenoxietanol).
- Förbereda 0,1 mM NaHCOs 3, pH 8,0. Använd en 10 ml spruta och en 0,2 | im porstorlek sprutfilter för att sterilisera lösningen i ett steriliserat vävnadsodling huva.
OBS: NaHCOs 3 används för att på ett effektivt sätt sprida cell- och vävnads adhesiv tvärs över täckytan hos fluorodishes (sesteg 3,2). - Förbered 1,0 M CaCl2 och 1,0 M MgCl2. Sterilisera med en 10 ml spruta och 0,2 | j, m porstorlek sprutfilter i en steriliserad vävnadsodling huva.
- För att framställa Hank's-balanserad saltlösning (HBSS), tillsätt steril CaCl2 och sterilt MgCl2 till 1x HBSS utan Ca 2 + / Mg2 +, utan fenolrött vid en slutlig koncentration av 1 mM vardera. Arbete i en steril miljö.
- Att förbereda odlingsmedium, blanda 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) utan fenolrött, 25% HBSS innehållande CaCl2 och MgCl2 (se avsnitt 1.4), 25% hästserum (HS), 10 enheter / ml penicillin, och 10 | ig / ml streptomycin. Arbete i en steril miljö.
OBS: Undvik medium innehållande fenolrött som det autofluoresces, vilket påverkar signal till brusförhållanden. 23 - Preparera 10 mL av 1% lågsmältande agaros i 1x MEM utan fenolrött. Smält agaros / 1x MEM med hjälp av en microave. Förbereda små volymer av agaros (t ex 10 ml) under det repetitiva återuppvärmning kommer att ändra jonkoncentrationer på grund av vätskeavdunstning.
- Före odling, sterilisera 1,5 ml mikrocentrifugrör genom autoklavering.
2. Ljus skada Paradigm
- Mörk anpassning
- Placera 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk (eller annan transgen zebrafisk av intresse) vid 6 - 14 månaders ålder i en miljö som saknar ljus för 14 d. För ytterligare detaljer se referens 2, 6, 24, 25.
- Placera behållaren med 2-3 mörk anpassad transgen zebrafisk i systemet vatten mellan två lysrör som avger ljus av 2800 lux 2, 6, 24, 25. Exponera zebrafisk till konstant intensivt ljus för 35 h. Under ljusexponeringen, försäkra att vattentemperaturen hålles mellan 31-33 ° C.
3. Beredning för odling (På dagen av näthinnan Isolering)
- Använda 70% etanol, sterilisera vävnadsodling huva och komponenter / verktyg som överförs till vävnadsodling huven (t.ex. flaskor innehållande MEM och HBSS, pipetter, sterila pipettspetsar, etc.).
- Framställning av fluorodishes
- Coat en fluorodish för varje näthinnan med cell- och vävnads lim (se tabell of Materials).
- Späd cell- och vävnads lim i 0,1 mM NaHCOs 3 till en slutlig koncentration av 70 | ig / ml, tillsätt 50 mikroliter till varje fluorodish och sprida lösningen över mitten av den fluorodish med en 200 mikroliter pipettspets (omkring 1-1,2 cm i diameter ).
- Inkubera de belagda fluorodishes för 1 - 3 h vid RT; (Alternativt, inkubera O / N vid 4 ° C).
- Ta bort lösningen och skölj 3x med 500 mikroliter av 1x MEM för varje tvätt. För att undvika de belagda fluorodishes från uttorkning, hålla dem i MEM tills näthinnan explants är monterade.
- Förbereda odlingsmedium såsom beskrivs i steg 1,6. Odlingsmediet kan förvaras i upp till en vecka vid 4 ° C.
4. Isolering och odling av retinala explants
OBS: det protokoll som beskrivs nedan är för isolering av den dorsala näthinnan, vilket är det retinala region som huvudsakligen är lesioned av den beskrivna ljusskador paradigm. Därför skada-inducerad proliferation och tillhörande händelse av interkinetic kärn migration förekommer i rygg näthinnan. Emellertid kan isoleringsförfarandet justeras för att ge näthinnans regioner enligt de särskilda krav som forskaren / frågeställningen.
- Avliva en ljusskadad transgen zebrafisk enta tid på 1: 500 2-fenoxietanol.
- Ta bort MEM från en fluorodish med en 1000 mikroliter pipett så att endast en tunn film av vätska återstår.
- Överför zebrafisk på en torr pappershandduk, avlägsna ögat med en böjd par Dumont pincett (pincett # 5, 45 ° vinkel) och överför den på fluorodish.
- Med användning av ett stereomikroskop, orientera ögat med pupillen på locket glida av fluorodish så att bakre delen av ögat med synnerven är synlig (Figur 1D).
- Med ett par McPherson-Vannas sax bort synnerven, kapning nära bakre delen av ögat. Dessutom avlägsna bindväv foder på utsidan av ögat.
- Hålla ögat mellan dess nasala och temporala sidan med ett par # 5 pincett samtidigt göra ett snitt vid synnerven stjälken genom att sticka hål med en saxbladet genom lamina cribrosa och skära längs både nasala och temporala sidor av ögat (se fig 1E , segmenterad line).
- Använder två par # 5 pincett, en för att hålla ryggsidan av näthinnan och det andra paret för att separera den ventrala från den dorsala näthinnan, dra vävnaden.
OBS: Det är lämpligt att orientera rygg näthinnan så att linsen och ganglion cellager möta täck medan sklera är vänd uppåt. - Ta sklera från rygg näthinnan med ett par # 5 pincett, medan du håller linsen som är ansluten till näthinnan med ett andra par # 5 pincett (Figur 1H, I).
- För att ta bort objektivet, använd McPherson-Vannas sax och klippa bakom linsen utan att skada näthinnan (Figur 1I, J). Ibland, separerar linsen i steg 4,7. I detta fall, ta bort sklera försiktigt med pincett genom att hålla näthinnan vid en skärkant med ett andra par # 5 pincett.
- Ta bort glaskroppen när du tar bort objektivet utan att skada näthinnan. Platta näthinnan med ganglion cellager mot täckglasetav fluorodish (figur 1L, M).
- Omger näthinnan med 10 mikroliter av 1% lågsmältande agaros och låta agarosen stelna.
- Titta att vätskan agarosen inte lyfter näthinnan som även en liten höjd kan påverka förmågan att fokusera djupt in i vävnaden. Om lyft observeras, använd en pipett för att ta bort agaros. Låt rest agaros set innan du försöker lägga till fler.
- Upprepa steg 4,12 flera gånger innan du lägger 1% låg smältpunkt agaros för att täcka hela fluorodish. När agarosen har stelnat, tillsätt 1,5 ml odlingsmedium.
- Bibehålla näthinnans Explantation kultur i en 5% CO2 / luftmiljö inställd på 32 ° C under cirka 12 timmar för att tillåta näthinnan att återhämta sig från den stress som verkställts av isoleringsförfarandet. Ställ in temperaturen på 32 ° C för att bibehålla näthinnor vid samma temperatur som ljus-behandlade zebrafisk (se steg 2.3).
5. multifoton Mikroskopi
tabell of Materials), en 40X Apo långväga nedsänkning i vatten mål (NA 1,15), en galvanometer scanner och en miljökammare som innehåller en insats för fyra 35 mm petriskålar. Bilderna förvärvades med en icke-descanned detektor (R-NDD).
- Före avbildning, ekvilibrera miljökammaren för att uppnå en 5% CO2 / luftatmosfär. Se till att tomma petriskålar sätts in i hållaren för att undvika läckage av gas in i rummet.
- Slå på mikroskopi systemet.
- När miljökammaren utjämnas, tillbrytningsindex vätska på 40X Apo långväga nedsänkning i vatten mål (NA 1,15).
OBS: Brytningsindex vätska med optiska egenskaper som liknar vatten används för att undvika avdunstning av vatten under långvarig avbildning. - plats influensaorodishes med retinala explants in i kammaren. Med hjälp av bright ljus, placera provet i ljusstrålen och föra mittenregionen av rygg näthinnan i fokalplanet.
- Använda GFP epifluorescent ljus att fokusera på GFAP: nGFP -positiva Müller Glia kärnor (figur 2A, C).
OBS: Om explants inte monterad platt eller agaros ackumulerats under explantatet, kommer det att vara svårt att fokusera på GFAP: nGFP-positiva kärnor eller de fluorescerar svagt.- Kontrollera om att flytta till en annan region inom samma retinal Explantation kommer att övervinna fokuserings frågan. Annars flyttar till en annan retinal explantation.
- I bilden förvärvet programvara, öppna "A1 MP GUI", den "TiPad", den "A1 Compact GUI" och "ND förvärv" fönster. För multifoton bildbehandling, se till att "IR NDD alternativet väljs i" A1 Compact GUI.
- I 'setting 'fält väljer IR-DM för en st dikroiska spegeln och välj bandpassfiltret 525/50 att förvärva GFP fluorescens.
- Slå på IR-laser i fönstret märkt "A1MP GUI. Det kommer att ta några minuter för lasern att vara redo. Ställ in våglängden på 910 nm för att excitera GFP fluorescens och rikta lasern genom att klicka på "Auto justering" -knappen i "A1 MP GUI" fönster.
- Se till att rummet och utrustning lampor är avstängda eller täckas innan du öppnar luckan i "A1 MP GUI" för att undvika överexponering av fotomultiplikatorröret. För att minska bullernivåerna, hus mikroskopet i ett mörklagt miljö.
- Förvärva bilder av ett synfält på 300 x 300 pixlar, vid en zoom på två, och en pixel bostad tid på 4,8 ^ s / pixel. Ungefär ställa in lasereffekten genom att ändra "förvärvsområdet" i "A1MP GUI" och vinsten i "A1 Compact GUI" fönster.
- Ställa in z-stack
- Fokus på ganglion cellager att ställa in övre fokalplan z-stack i "Z'-fönster inom" ND förvärv "fönstret. Vissa GFAP: nGFP -positiva celler är typiskt belägna i ganglion cellager, som hjälper till att identifiera de basala gränsen för näthinnan (Figur 2A, D).
- Flytta fokalplanet genom nivån av ENDA (Figur 2A, B), som kännetecknas av närvaron av svagt märkta GFAP: nGFP -positiva celler som är runda och förstorad i förhållande till sina motsvarigheter i INL (figur 2A, C) .
- Ställ detta plan som botten av z-stack. Säkerställa att hela ONL kommer att avbildas (figur 2A, B).
- När upplever Focal Plane skift som kräver åter justering under bildperioden, dubbelklicka på mittläget i "z" fönster för att tilldela det som "hemma" -läge. Byt till "symmetrisk läge definieras"och klicka på "släkting".
- Ställa in z-stegstorleken mellan 0,7-1 | im.
- Z-intensitet korrigering:
- Applicera z intensitet korrigeringar för att kompensera för förlusten av pixelintensiteten på grund av ljusspridning när avbildning i djupa lager av vävnad.
- För att ställa in korrigeringen, öppnar "z-intensitet korrigering" fönstret. För att ställa in "z-stack intervall", välj "Från ND.
- Klicka på den nedre fokalplanet i "z-intensitet korrigering" fönster (i detta fall, motsvarar ganglion cellager) och ställ in laserintensiteten (förvärvsområdet "i" A1MP GUI) och vinst (A1 Compact GUI ).
- Klicka på pilen bredvid "z-värden" i "z-intensitet korrigering" fönstret för att bekräfta de inställningar som därefter visas under "Enhetsinställningar" i "z-intensitet korrigering" fönster för det valda fokalplanet.
- Upprepa processen för mitten ennd bästa plan, ökar lasereffekt och vinst. Ytterligare fokalplan kan läggas till vid behov. Se tabell 1 för specifika laser och förstärkningsinställningar för experiment i figurerna 2 - 4.
- Ställ förvärvsområdet "i" A1 MP GUI "fönster. Undvik att välja ett inhämtningsområde större än 15 och en vinst högre än 126 vid början av avbildning att kringgå fotoblekning och ökad ljudnivå.
OBS: Som lasrar och fotomultiplikatorrör skiljer sig mellan mikroskopi system, test laser och förstärkningsinställningar för att få optimala avbildningsbetingelser för mikroskopet inrättas samtidigt undvika fotoblekning. - Välj "relativ intensitet korrigering" i "z-intensitet korrigering" fönstret.
- I "tidsserier" fönster i "ND förvärv" fönster, ange hur länge till 8 timmar och intervallet till "utan fördröjning". Se sedan till att klicka på "Kör z-korrigering" i tHan z-stack "sub fönster i" ND förvärv "fönstret för att förvärva de tre-D tidsserier.
- Bibehålla näthinnans explants vid en temperatur av 27-29 ° C under hela bilden förvärvet.
- Hela bildinhämtningsperioden, om det är nödvändigt, justera effektnivån och förstärkningen för att bibehålla bildkvaliteten för post-bildanalys. Justeringar utför steg 5.11.2 - 5.11.4.
- Om Focal Plane skift, pausa eller stoppa körningen och utför steg 5,11 igen.
OBS: Om "relativa z-korrigering" valdes i steg 5.12.7 och steg 5.11.4 utfördes bör det inte vara nödvändigt att justera kraft och förstärkningsnivåer, om inte omfattande fotoblekning inträffade.
6. Analys av Velocity
- Extrahera tid, sätta en "region av intresse" på bilden. Använd "tidmätningen" verktyg och exportera tidsvärdena till ett kalkylblad.
- Beskära en region som innehåller en diViding GFAP: nGFP -positiv kärna.
- Välja den beskurna regionen så att den innehåller minst en kärna som inte genomgår INM för att fastställa en referenspunkt för att därefter mäta avstånden att skilje nucleus migrerade i förhållande till den basala INL. OBS: För att välja en kärna som finns kvar i den basala INL, hjälper det att förbereda en 3-D rekonstruktion av tidsserier.
- Alternativt, om en GFAP: nGFP -positivt cell observeras i ENDA hela förvärvsperioden, använd en vertikal linje med fast längd som sträcker sig från den ENDA kärnan till de basala INL för att identifiera en referenspunkt.
- Med hjälp av "visa skivor view" funktion, generera ortogonala projektioner. Därefter ändra läge från "slice" till "maximal intensitet projektion.
- Stäng av "xy syn på den ortogonala största projektionen. Beroende på orienteringen vid vilken migrerande / dividera kärnan är bäst synliga, enLSO stänga antingen "xz'- eller" yz'-view.
- Klicka på den återstående bilden med höger musknapp och extrahera "xz" eller "yz'-bildserie med" Skapa nytt dokument från den här vyn "funktion. Om det behövs, rotera bilden.
- Med hjälp av "manuell mätning" -funktion, dra en horisontell linje över bilden på bottennivån av kärnan som finns kvar i de basala INL och inte genomgår INM (= referenspunkt, Figur 4A - E, röd horisontell linje).
- Mät avståndet mellan referenslinjen och den basala punkten för migrerande kärna för tidsserier med hjälp av "line mätning" verktyg i analysprogrammet (se figur 4A - E).
- När kärnhöljet går sönder, mäta den basala positionen av soma om det är identifierbar efter diffusionen av GFP in i hela cellen.
- Med hjälp av en kalkylprogram, rita avståndet en nucleus migrerade mot tiden gick (Figur 4F).
- För att bestämma apikala migrering hastighet (v), diagram avstånden reste för perioden innan kärnhöljet uppdelning sker (Figur 4G).
- Välj dataserie i diagrammet, högerklicka med musen och infoga en linjär regressionskurva inklusive motsvarande funktion "y = mx + c". Lutningen "m" i funktionen representerar hastigheten, v en (Figur 4G).
- Upprepa steg 6.11.1 och 6.11.2 för den första fasen av snabb basal migration för att bestämma den basala migreringshastighet, Vb (figur 4H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringen av näthinnan i enlighet med förfarandet som skisseras i den schematiska i fig 1 medger odling av en tillplattad dorsal näthinna från ljus-skadade vuxna Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk under en period av minst 24 timmar i en 5% CO 2 / luftmiljö. Dessa platt-monterade retinala explants kan användas för att avbilda fokalplan på djupa vävnadsnivåer. Ett exempel är Müller Glia / neuronala stamfadercellkärnor märkta med GFP från Müller Glia specifik promotor GFAP (gliafibrillärt surt protein) som finns i ONL under mitos i Ijusskadade näthinnan (figurerna 2A - D, 3). För att ytterligare bekräfta att detta tillvägagångssätt är tillämplig på bild de olika retinala cellager var akut isolerade näthinnan explants framställs från oskadade Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebrafisk ögon som uttrycker EGFP i stavfotoreceptorer iden rodopsin-promotorn. Figur 2E - H visar att det är möjligt att få bilder av GFP-positiva stav ljusmätare och deras inre segment. Som stavinnersegmenten sträcker sig mellan kon fotoreceptorer mot näthinnans pigmentepitel, skulle dessa uppgifter antyder att det också är möjligt att bild cone fotoreceptorer. Detta var dock inte vidare undersökt.
Med observerade Müller glia / neuronala progenitorceller cellkärnor i ENDA i ljus skadade näthinnan, vi kännetecknas deras migrations beteende i detalj (figur 3 och Film 1). Müller Glia / neuronala stamceller cellkärnor märkta av GFP migrera dubbelriktat mellan de basala position INL där de vanligtvis är bosatta och ENDA, platsen för fotoreceptor förlust. Typiskt, GFAP: nGFP-positiva kärnor migrerat en kort sträcka i INL (Figur 3A - C) innan de genomgickkärnhöljet uppdelning, medan den fortfarande placerad i INL, baserat på omfördelningen av GFP in i cytoplasman hos hela Müller Glia / neuronal progenitor cell (Figur 3D). Efter celldelning i ENDA, två GFAP: nGFP-positiva kärnor blev synlig i ENDA (figur 3F, G) som återvände till basal INL (figur 3H - J). Vid celldelning, de nyuppkomna kärnorna var inledningsvis mycket svagt och därför svårt att identifiera (figur 3G). Men inom en till två tidsramar efter mitos, blev kärn GFP fluorescens ljus, vilket gjorde det möjligt för visualisering av kärn migration (figur 3H - J). Live-cell imaging får också visualisering av division plan (figur 3F, G), som inträffade horisontellt till den apikala ytan av näthinnan för cellen som visas i figur 3. Det är även tänkbart att använda andra transgena zebrafisklinjer sådanasom Tg [GFAP: EGFP] nt11 zebrafisk som uttrycker GFP i cytoplasman (data ej visade). Även om det är möjligt att på ett tillförlitligt sätt bestämma apikala rörelse och horisontella celldelningar, är det ofta svårt att exakt identifiera läget för basalt migrera dotter kärnor och vertikala celldelningar i Tg [GFAP: EGFP] nt11 zebrafisk näthinnan (data visas ej).
För att bestämma hastigheten, en GFAP: var nGFP -positivt kärna som inte flyttar hela registreringsperioden valts som referenspunkt (stjärna, figur 4A - E). Avståndet mellan migrerande kärna (vertikal röd linje, Figur 4A - E) bestämdes i förhållande till referens GFAP: nGFP -positivt kärnan (horisontell röda linjen, Figur 4A - E) vid varje tidpunkt av bildserie på maximal xz eller YZ-projektioner (beroende på vilken vinkel kärnorna kan vara visualized mest effektivt). Avståndet att kärnan migrerat plottades mot tiden i ett kalkylblad (Figur 4F - H). Nukleära membranet uppdelning ades ofta observeras i grafen som en initial basalward rörelse på grund av omfördelning av GFP i den hela cellen (basal största delen av cellkroppen i detta fall). Den apikala hastighet bestämdes innan kärnhöljet uppdelning, passar en linjär regressionskurva (grå streckade linjen, Figur 4G) avståndet avsatt mot tiden för perioden före kärnhöljet uppdelning (röd diamant, figur 4G). Lutningen "m" för den linjära regressionskurvan (y = mx + c) representerar hastigheten 'dx / dt'. Den apikala hastigheten för cellen som presenteras i figur 4 var 10,89 | j, m / tim. Samma metod tillämpades för att beräkna hastigheten hos den initiala snabba basala rörelse (v b) av den nybildade dotter kärnor (Figur 4F, H). Den basala migreringshastigheter Vb av -67,71 och 33,51 pm / h dotterceller D1 och D2, respektive, var jämförelsevis snabbare än den apikala hastighet. Tyvärr var det inte möjligt att fastställa den apikala hastighet efter kärnhöljet uppdelning som GFP sprids över hela cellen. I stället var den momentana hastigheten beräknas baserat på tidpunkten och positionen av kärnan innan kärnhöljet sammanbrott och den första visualisering av nybildade dotter kärnor. Den momentana hastigheten för 7,9 ^ m / h för cellen som visas i figur 4 är sannolikt en underskattning, eftersom kromatin når ONL före telofas av mitos, när dotterkärnorna blir synliga.
För att sammanfatta, kulturen av retinala explants tillåter levande cell imaging av INM i vuxen regenerezebrafisk näthinnan och fastställandet av migration och celldelning pametrar av enskilda kärnor.
Figur 1: Retinal isoleringsförfarande. A) Schematisk illustrerar en zebrafisk huvud med dess öga. B) Ögat avlägsnas från zebrafisk och inriktade för att visa på framsidan av ögat med pupillen. C) Vrid ögat 180 ° så att den bakre delen av ögat med den optiska stjälk (fylld svart cirkel) blir synlig i (D) och eleven är vänd nedåt. Den grå färgen indikerar närvaron av sklera hos ögat. E) Ett blad av ett par McPherson-Vannas sax sätts in i optisk stjälk i ögat (fylld svart cirkel) att skära i sin rygg och ventrala sidor som indikeras av den vita segmenterade linjen. F) Rygg halvan av ögat efter den ventrala halv avlägsnades. Den svarta halv cirkel anger tHan kvarvarande delen av den optiska stjälk. G) Slå ögat 90 ° bakåt för att avslöja (H) på insidan av ögat med näthinnan (brun), glaskroppen (ej visad) och linsen (L, ljusgrå cirkel) som fortfarande är inneslutna av sklera (grå linje ). I) Sklera lossades (notera, är grå linje saknas) och J) linsen och glaskroppen avlägsnades, vilket gav upphov till endast näthinnan (brun). K) Retina vände 90 ° framåt ger upphov till en platt-mount tanke på rygg näthinnan (L). M) Dorsal retinal explantatet platt-monterad på en glasbotten fluorodish. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 3-D rekonstruktion avRetinal multifoton Z-Stacks. A) 3-D rekonstruktion av ett multifoton z-stack bildserie av GFAP: nGFP- positiva celler i näthinnan hela monterade kulturer från zebrafisk efter 48 timmar av ljus-skada. B - D) Single multifoton xy-bilder av GFAP: nGFP -positiva celler som visas i 3D-rekonstruktion i (A) vid nivån för den ENDA (B), INL (C), vilket motsvarar det lager som innehåller Muller glia soma och GCL (D). Pilen i (B) indikerar en förstorad runda Muller Glia i ONL efter kärnhöljet uppdelning. E) 3-D rekonstruktion av ett multifoton z-stack bildserie av en retinal explantat från en oskadad Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebrafisk. F - H) Single multifoton xy-bilder på nivån för stången inre segment (RIS, F), stav nukleära lagret (G) Och på nivån för den inre näthinnan (H). GCL, ganglion cellager; INL, Inre kärnlagret; ENDA, yttre kärnlagret; RIS, Rod inre segment. Skalstrecket i A, D, E och H, 10 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Timelapse Image Series of INM. A - J) Bild serie 3D-rekonstruktion av z-stack Timelapse-serien visar Tg [GFAP: nGFP] mi2004 -positiva kärnor som genomgår INM att dela i ENDA i näthinnan explants (översta raden). Placeringen av en apikalt migrera kärna och dess basalt migrera dotter kärnor indikeras med röda pilar. Röd stjärna indikerar kärnhöljet uppdelning under mitos. A - J, nedersta raden) Densamma bildserie som i den översta raden var övermättad och beskärs för att fokusera på delande celler i ENDA. INL, Inre kärnlagret; IPL, Inre Plexiform Layer; ENDA, yttre kärnlagret. Skala bar i A, 10 mikrometer och är densamma för B - J. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av apikala och basala migreringshastigheter. A - E) Maximal yz-projektion av en z-stack bildserie av Tg [GFAP: nGFP] mi2004 retinala explants vid olika tidpunkter av Timelapse inspelning förvärvats av flera foton mikroskopi. Använder linjen verktyget enligt "manuell mätning" funktionen, var en horisontell linje placerad vid nivån för referenscellen, som anges med en stjärna. En vertikal migasurement linje positionerades med början vid den horisontella linjen och sträcker sig till den basala positionen för migrerande GFAP: nGFP -positiv kärna. Längden på mätningslinjen ges i de vita rutorna på bilderna och för läsbarhet under bilderna. L1 = längd som dottercell 1 migrerade; L2 = längd som dottercell 2 migreras. F) Avstånd att cellen (F0) mätt i (A - E) migrerade apikalt och att de uppstår dottercellerna D1 och D2 migrerade basalt i multifoton Timelapse inspelning. Den röda linjen visar mätningarna som den apikala migreringen hastighet (v) beräknades medan de svarta och gråa linjer visar de mått som används för att beräkna de basala migrationshastigheter (v b) för D1 och D2 resp. G, H) Avståndet avsattes mot tiden i Excel för apikal migration innan kärnhöljet uppdelning (G) och fas av snabb basalamigration för dottercell D1 (H). Linjära regressionsKurvor anpassades och funktionerna ges nedan de grafer med lutningen representerar hastigheten. INL, Inre kärnlagret; IPL, Inre Plexiform skikt; ENDA, yttre kärnlagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tg [GFAP: EGFP] nt11 | Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 | ||||||||
| lasereffekt | få | lasereffekt | få | ||||||
| Top (stav fotoreceptor) | 13 | 126 | 3,5 | 118 | USA (Müller glia) | 10 | 126 | 2,8 | 118 |
| Botten (GCL) | 8 | 126 | 2,1 | 118 | |||||
Tabell 1: Laser och Gain nivåer som används för Z-Intensitets Rättelser på olika plan för experiment visas i figurerna 2 - 4.
Film 1: Live-cell imaging av näthinnan explants av multifotonMicrosCopy. (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier som undersöker de mekanismer som styr regenerering av skadade vuxna zebrafisk näthinnan främst används immunocytokemiska metoder 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Skapa förutsättningar för kultur retinala explants och utföra levande cell imaging på företeelser, såsom INM, ger oss en teknik för att erhålla ingående rumslig och temporal information. Denna teknik gör det möjligt att bestämma migrationshastigheter, tidpunkten och läget för kärnhöljet uppdelning under profas av mitosen och längden och placeringen av celldelning. Dessutom är det möjligt att fastställa fördelningen planet och öde uppstår dottercellerna när det gäller deras senare läge. I slutändan kommer detta kraftfull metod bestämma huruvida M2; ller glia och neuronala progenitorceller beter sig annorlunda när det gäller INM under retinal förnyelse. Användningen av transgena zebrafisklinjer som identifierar prolifererande celler i den regenererande näthinnan i distinkta skeden av regenereringssvar kommer att hjälpa dechiffrera differential beteende 6. I fallet med multifotonmikroskop som används här, är GFP reporter zebrafisk linjer föredra eftersom excitering av Red fluorescerande protein (RFP) är inte mycket effektivt; emellertid kan andra multifoton system möjliggöra en effektiv excitering av RFP eller motsvarande fluoroforer.
En av de mest kritiska stegen i näthinnans isoleringsförfarandet är montering av näthinnan. Näthinnor måste monteras så platt som möjligt för multifoton ljus för att kunna övergå till de djupare z-nivåer i ENDA. Krökning av näthinnan i synnerhet i kantområdet, kvarvarande glaskroppen, och / eller ackumulering av agaros under retinal kultur, som används för att immobiliseravävnad, oftast införa extra utrymme mellan täckglaset och retinal kultur. Dessutom ökade lasereffekt och förstärkning måste användas för att få bilder om näthinnan är inte platt och det kommer därför att leda till ökad fotoblekning och minskad lönsamhet retinal kultur. Felaktig montering ofta också resulterar i sämre bildkvalitet på grund av minskad ljuspenetration och kommer att påverka förmågan att mäta avstånd som kärnorna hade migrerat och därför beräkningen av migrationshastigheter.
Hastigheterna av apikal migration före kärnhöljet uppdelning och av basal migration kan på ett tillförlitligt sätt i en bildserie från Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk näthinnan explants. Det är dock för närvarande inte möjligt att bestämma hastigheten för apikala migrering av kromatin efter kärnhöljet uppdelning i denna transgena zebrafisk linje som GFP åter distribuerar i hela cytoplasman. Labeling av retinala explants med kärn färgämnet Hoechst resulterade i svagt upptag i Müller Glia kärnor som krävs för förändringen i våglängd till 830 nm (Lahne & Hyde, opublicerade data), vilket påverkade lönsamheten i vävnaden och orsakade blockering av cellcykeln ( Lahne & Hyde, opublicerade data). Under retinal utveckling, Tg [h2afva: h2afva-GFP] har kca6 zebrafisk som uttrycker GFP smält till histon 2 med framgång använts för att övervaka INM och bestämma migrationshastigheter på olika stadier av cellcykeln 12, 31. I framtiden, retinala explants från Tg [h2afva: h2afva-GFP] kommer kca6 zebrafisk också möjliggöra visualisering av kromatin hela cellcykeln och gör det möjligt att analysera den apikala migrationshastigheten efter nukleära membranet uppdelning i vuxen regenerezebrafisk näthinnan.
Efter att ha fastställt villkoren för att övervaka INM avlevande cell imaging i näthinnan explants från lätta skadade vuxna zebrafisk och motsvarande analys av hastigheter kommer att ligga till grund för att undersöka de mekanismer som styr INM. Vissa studier började undersöka mekanismerna hos INM i den vuxna regenere näthinnan med användning av immuncytokemi för att bestämma positionen för mitotiska fosfo-histon 3-positiva kärnor 6, 7. Dock utan att störa signalvägar inte kan göra läget för mitos, men kan påverka andra parametrar såsom hastighet, tidpunkten för mitos och division som inte skulle vara möjligt / mycket svårt att urskilja genom immuncytokemi. Tidigare var det visat att fosfor-histon 3-positiva mitotiska kärnor mislocalized till mer basala positioner i utvecklings näthinnan i dynactin mutanter och morphants 11. Men visade efterföljande levande cell imaging att kärn migration före cell division försenades i dynactin-äventyras cells, medan en ökad apikal migration hastighet aktiverade kärnor att nå och att genomgå celldelning på den apikala ytan 11, 12. Detta exempel exemplifierar kraften i levande cell imaging. Likaså när reda ut de mekanismer som underlättar INM i vuxen regenerezebrafisk näthinnan, kommer levande cell imaging studier kompletterar och vid olika tillfällen kommer att vara fördelaktigt över, immunocytokemiska metoder.
Som diskuterats ovan, erbjuder levande cell imaging många fördelar jämfört med immunhistokemiska / statiska metoder; emellertid, måste det hållas i minnet att näthinnan explants är en ex vivo-modell. Som sådan skada som uppkommit under isoleringsförfarandet och / eller odlingsbetingelser kan påverka cellulära processer. Dessutom kan förfarandet imaging själv utövar toxiska effekter som kan påverka cellbeteende 23, 32. Medan det finns disadvantages att live-cell imaging av retinala kulturer, är det för närvarande vår bästa metoden för att få dynamisk information om INM. Framför allt kommer den levande cell imaging förfarande av retinala explants tillämpas på andra biologiska frågor under retinal förnyelse. Baserat på immuncytokemiska data var det tidigare föreslagits att Müller glia fagocyterar döende fotoreceptorer / skräp efter ljusinducerad fotoreceptor skada 33. Justera parametrar för att avbilda denna process Live kommer att verifiera om fagocytos av döende fotoreceptorer förekommer i den regenererande zebrafisk näthinnan och kan användas för att studera de underliggande mekanismerna. Efter att ha visat att bilder kan förvärvas på samma nivå som stång kärnor och stånginnersegmenten i Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebrafisk, bör det vara möjligt att justera villkoren för bildljusmätare fagocytos. På samma sätt är kunskap begränsad när det gäller dynamiska beteende mikroglia och de mekanismer som styr derasfunktion i degenererande och regenere näthinnan 34, 35. Utnyttja mikroglia-specifik transgen zebrafisk i samband med levande cell imaging kommer också att öka vår förståelse för funktionen av mikroglia i vuxen regenererande zebrafisk näthinnan 36, 37. För att sammanfatta, är levande cell imaging av retinala explants ett kraftfullt verktyg för att få dynamisk information om cellulära processer och för att bestämma beteendet och funktionen hos olika celltyper i regenere näthinnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi uppskattar stödet från William Archer och Notre Dame Integrated Imaging Facility. Ett särskilt tack riktas till Freimann Life Sciences tekniker för deras kontinuerliga hjälp och deras vård och djurhållning av zebrafisk. Denna studie har finansierats med bidrag från National Eye Institute of NIH till DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) och Centrum för Zebrafish Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
- Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
- Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
- Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
- Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
- Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
- Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
- Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
- Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
- Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
- Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
- Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
- Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
- Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
- Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
- Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
- Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
- Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).
