Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Summary

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Abstract

Bir endojen rejenerasyon programı nöronal hasar ve ölümünden sonra (Danio rerio) retina yetişkin zebrafish Müller glia tarafından başlatılır. Müller glia hücre döngüsünü tekrar girin ve hücre bölünmeleri daha sonraki mermi geçmesi ve kayıp nöronal hücre tiplerine ayırt nöronal progenitör hücreler üretmek. Hem Müller glia ve nöronal progenitör hücre çekirdekleri kendi DNA'sını çoğaltmak ve Interkinetic olarak tanımlanan bir süreç içinde retinanın, yani sırasıyla, bazal İç Nükleer Katmanı (INL) ve (onl) Dış Nükleer Katman arasında göç ayrı yerlerde mitoz geçiren nükleer Göç (INM). INM ağırlıklı gelişmekte olan retinada incelenmiştir. detaylı Zebra balığı retina rejenere erişkin INM dinamiklerini incelemek için, floresan etiketli Müller glia / nöronal progenitör hücrelerin canlı hücre görüntüleme gereklidir. Burada, biz izole etmek için koşullar ve kültür dorsal retina sağlamakTg dan [GFAP: nGFP] 35 saat süreyle sürekli yoğun ışığa maruz bırakıldı mi2004 zebra balığı. Biz de bu retina kültürleri sürekli olarak GFAP göç davranışlarını izlemek için multiphoton mikroskopi kullanılarak en fazla 8 saat retina eksplant kalınlığı boyunca z-yığın görüntüleri elde, canlı hücre görüntüleme deneyleri gerçekleştirmek için geçerli olduğunu göstermektedir: nGFP pozitif hücreler . Ayrıca, apikal ve bazal INM hızını belirlemek için post-görüntüleme analizi gerçekleştirmek ayrıntıları açıklar. Özetlemek gerekirse, biz nöronal rejenerasyon bir yetişkin modelinde INM dinamiklerini incelemek için koşulları oluşturmuştur. Bu, bu çok önemli hücresel sürecin anlayışımızı ilerletmek ve bize INM kontrol mekanizmaları belirlemek için izin verecektir.

Introduction

Insanlarda farklı olarak, zebra balığı (Danio rerio) sergiler retina nöronlarının, 1, 2, 3, 4, hücre ölümü üzerine sağlam bir rejenerasyon yanıt. Tümör nekroz faktörü α, retina nöronlarının ölen salınan bir sinyal molekülü nöronal hücre ayırma yöntemi önce çoğalmaya devam nöronal progenitör hücreler 5 çoğalır ve üretilmesi için taban iç nükleer tabaka retinanın (INL) ikamet Müller glia indüklemektedir 2 ölen türleri, 3, 4. Yenilenmesi tepkisinin çoğalma fazı sırasında, Müller glia çekirdekleri ve elde edilen nöronal progenitör hücreler, hücre siklüsü (Interkinetic Nükleer Göç, INM) 6 aşamasında tekrar eden göç desen geçmesi > 7. bazal INL konumlandırılmış Çekirdekler çıkan çekirdekleri INL için dorsalde dönmeden önce onlar bölmek Dış Nükleer Layer (onl) göç önce DNA çoğaltırlar. Canlı hücre görüntüleme teknikleri, daha sonra Sauer 8, 9, 10, 11, 12 ile bir yorum teyit Bu süreç ilk olarak, histolojik yöntemlerle nöroepitelyal gelişimi sırasında açıklanmıştır. Hem histokimyasal ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları İNM ve retina 9, 11, 12, 13 olmak üzere neuroepithelia gelişmekte işlevini altında yatan mekanizmaları belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, retina yenileyici yetişkin İNM yöneten mekanizmalar çok ayrıntılı olarak araştırılmamıştırxref "> 6, 7. Canlı hücre görüntüleme yetişkin yenileyici retina İNM kontrol sinyal yollarının bilgimizi ilerletmek için paha biçilmez bir yaklaşım olacaktır.

Yakın zamana kadar, retina INM canlı hücre görüntüleme canlı zebra balığı embriyolar ya ya da piliç embriyonik veya postnatal fare retinal eksplantlar 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16 ile sınırlı kalmıştır. Fare, sıçan ve zebrabalıkları içeren türlerin çeşitli yetişkin hayvanların retina eksplantlar, farklı hücre biyolojik yaklaşımlar 17, 18, 19, 20 için kullanılmış olmakla birlikte, canlı hücre görüntüleme deneyleri retina eksplantlar ha kullanılarakziyaretinde sürelerde bilgilendirmek kısıtlandı ve birkaç saat 21, 22 üzerinde sürekli olarak gerçekleştirilir edilmemiştir. Burada, çoklu foton mikroskopi 6 kullanarak canlı hücre görüntüleme deneyleri izleme İNM gerçekleştirmek için kültür ışık hasarlı yetişkin zebrabalıkları retina için ayrıntılı bir protokol açıklar. INM dinamikleri olarak, örneğin, hızlar oldukça potansiyel immünsitokimya kullanılarak tespit olmaz mitoz konumu, daha etkilenebilir, INM kontrol mekanizmaları araştırılırken Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları immünohistokimyasal yöntemlere göre avantajlıdır.

Gelecekte, bu yöntem aynı zamanda bir potansiyele sahip gibi Müller glia ya da mikroglia davranışları ile fotoreseptör ölme fagositoz gibi retinal rejenerasyon sırasında diğer dinamik süreçleri incelemek için modifiye edilmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Zebra balığı kaldırdı ve Freimann Yaşam Bilimleri Merkezi'nde Notre Dame Zebra balığı tesiste muhafaza edildi. Bu yazıda anlatılan yöntemleri Notre Dame Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği tarafından görme araştırma hayvanların kullanımı için deyimi ile uyum içindedir vardır.

1. Çözümler

  1. doku kültürü kaput ve herhangi bir ekipman / doku kültürü kaputu aktarılır reaktif sterilize etmek için% 70 etanol hazırlayın.
  2. (: 500 2-fenoksietanol 1) sistem 1 L su, 2-fenoksietanol 2 mL ekleyin.
  3. 0.1 mM NaHCO 3, pH 8.0 hazırlanır. steril doku kültürü kaputu çözüm sterilize etmek 10 ml şırınga ve bir 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi kullanın.
    NOT: NaHCO 3 verimli fluorodishes bir lamel yüzeyi boyunca hücre ve doku yapıştırıcı yaymak için kullanılır (bkz) 3.2 adım.
  4. Hazırlama 1.0 M CaCl2 ve 1.0 M MgCI2. steril doku kültürü kaputu 10 ml şırınga ve 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi ile sterilize edin.
  5. Hank's dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlamak için, 1 mM, her bir son konsantrasyonda fenol kırmızısı olmadan Ca2 + / Mg2 + olmaksızın 1x HBSS için MgCl2 CaCl2 steril ve steril ekleyin. Steril bir ortamda çalışın.
  6. % 50 fenol kırmızısı olmaksızın 1x en az temel ortam (MEM),% 25 CaCl2 ve MgCl2 içeren HBSS (bölüm 1.4),% 25 at serumu (HS), 10 birim / ml penisilin ve 10 karışımı, kültür ortamı hazırlamak ug / ml streptomisin. Steril bir ortamda çalışın.
    NOT: bu suretle gürültü oranı sinyali etkileyen autofluoresces olarak fenol kırmızısı içeren orta kaçının. 23
  7. fenol kırmızısı olmadan 1x MEM içinde% 1 düşük erime noktalı agaroz 10 ml hazırlayın. agaroz / 1x MEM bir Mikrodalga fırın kullanarak eritinave. Sıvı buharlaşmaya bağlı iyonu konsantrasyonları değiştirecek tekrar tekrar ısıtma agaroz (örneğin, 10 mL) arasında küçük hacimli hazırlayın.
  8. kültür önce, otoklav 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri sterilize edin.

2. Işık hasar Paradigma

  1. Koyu-adaptasyon
    1. 2 koyun - 3 Tg [GFAP: nGFP] 6'da mi2004 zebrabalıkları (ya da diğer ilgi transgenik zebrafish) - 14 gün boyunca ışık yoksun bir ortama yaşı 14 ay. Daha ayrıntılı bilgi için referans 2, 6, 24, 25 bkz.
  2. 2800 lux 2, 6, 24, 25 ışık yayarlar iki floresan lamba arasındaki sistem suda 3 koyu adapte transgenik zebrafish - 2 içeren tankı yerleştirin. 35 saat boyunca sabit yoğun ışığa zebrafish Açığa. 33 ° C - ışık pozlama sırasında, su sıcaklığı 31 arasında muhafaza edilmektedir emin.

Kültür için 3. Hazırlık (Retina İzolasyon gününde)

  1. % 70 etanol kullanılarak, doku kültürü kaputu ve bileşenleri sterilize / doku kültürü kaputu aktarılır araçlar (örneğin, MEM ve HBSS, pipet, steril pipet uçları, vb içeren şişeler.).
  2. fluorodishes hazırlanması
    1. Hücre ve doku yapıştırıcı ile her retina için Coat bir fluorodish (Malzeme Tablo).
    2. 70 ug / ml bir son konsantrasyona kadar 0.1 mM NaHCO 3 hücre ve doku yapıştırıcı seyreltilir Her fluorodish 50 uL ekleyin ve 200 uL pipet ile fluorodish merkezi boyunca çözeltisi yayılır (yaklaşık 1-1,2 cm çapında ).
    3. Oda sıcaklığında 3 saat - 1 kaplı fluorodishes inkübe(Alternatif olarak, 4 ° C'de O / N inkübe).
    4. çözüm çıkarın ve her yıkama için 1x MEM 500 uL ile 3x yıkayın. retina eksplantlar monte kadar kurumasını kaplanmış fluorodishes önlemek için, MEM onları korumak.
  3. Adım 1.6 açıklandığı gibi kültür ortamı hazırlayın. Kültür ortamı 1 haftaya kadar 4 ° C saklanabilir.

Retina Eksplantlarından 4. İzolasyon ve Kültürleme

Not: Aşağıda belirtilen protokol ağırlıklı tarif edilen ışık hasarı paradigmasının lezyonlu retinal bölgedir dorsal retina, izolasyonu içindir. Bu nedenle, hasar kaynaklı çoğalması ve interkinetic nükleer göç ilişkili olay dorsal retinada meydana gelir. Ancak, izolasyon prosedürü araştırmacı / araştırma sorusunun özel ihtiyaçlarına göre retina bölgeleri elde etmek için ayarlanabilir.

  1. Bir ışık hasarlı transgenik zebrafish a euthanize1'de ta süresi: 500 2-fenoksietanol.
  2. 1000 uL pipet ile bir fluorodish gelen MEM Kaldır sıvı kalıntılarının sadece ince bir film böylece.
  3. Kuru bir kağıt havlu üzerine zebrafish aktarın Dumont forseps (forseps # 5, 45 ° açı) bir eğri çifti ile göz çıkarmak ve fluorodish aktarabilirsiniz.
  4. Optik sinir ile gözün arka görünecek şekilde bir stereomikroskop kullanılarak, (Şekil 1D) fluorodish kapak kayma üzerine öğrenci ile göz yönlendirmek.
  5. McPherson-Vannas bir makas ile gözün arka yakın kesim, optik sinir çıkarın. Buna ek olarak, gözün dışında astar bağ dokusu kaldırmak.
  6. Lamina cribrosa aracılığıyla bir makas bıçağı ile piercing ve nazal ve gözün zamansal taraflarında boyunca keserek optik sap bir kesi yaparken 5. forseps bir çift ile nazal ve temporal tarafı arasındaki göz tutun (Şekil 1E bkz , parçalı line).
  7. retina dorsal yüzü ve dorsal retina ventral ayrı doku çekmek için diğer çifti tutmak için # 5 forseps iki çift, bir kullanma.
    NOT: sklera yukarı bakacak iken objektif ve ganglion hücre tabakası lamel karşı karşıya böylece dorsal retina yönlendirmek için tavsiye edilir.
  8. 5. forseps (Şekil 1 H, I) 'in ikinci bir çift retina bağlı lens tutarken, 5. forseps bir çift dorsal retinadan sklera çıkarın.
  9. Merceği çıkarmak için, McPherson-Vannas makas kullanın ve retina (Şekil 1I, J) zarar vermeden merceğin arkasında kesti. Bazen, objektif adım 4.7 ayırır. Bu durumda, 5. forseps ikinci bir çift ile bir kesim kenarında retina tutarak forseps ile dikkatlice sklera çıkarın.
  10. retina zarar vermeden lensi çıkarırken vitrözü çıkarın. kapak kayma bakan ganglion hücre tabakası ile retina düzleştirmekfluorodish (Resim 1L, M).
  11. % 1 düşük erime noktası agaroz 10 uL ile retina Surround ve agaroz katılaşmaya edelim.
  12. Hatta hafif bir yükseklik dokusuna derinlemesine odaklanma yeteneğini etkileyebilir sıvı agaroz retina asansör olmadığını izleyin. Kaldırma görülürse, agaroz kaldırmak için bir pipet kullanın. daha eklemek denemeden önce kalan agaroz seti olsun.
  13. tüm fluorodish kapsayacak şekilde% 1 düşük erime noktası agaroz eklemeden önce birkaç kez adımı yineleyin 4.12. Agaroz katılaşmış sonra, 1.5 ml kültür ortamı ilave edin.
  14. Retina izolasyon prosedürü ile, oluşan stres kurtarmak sağlamak için yaklaşık 12 saat boyunca 32 ° C'de ayarlanmış bir% 5 CO2 / hava ortamında retina eksplant kültürünü koruyun. Işık ile muamele zebrabalıkları aynı sıcaklıkta retina korumak için 32 ° C sıcaklık ayarlama (adım 2.3).

5. multiphoton Mikroskopi

(Malzeme Tabloya bakınız), 40X Apo uzun mesafe suya daldırma hedefi (1.15 NA) ile donatılmış bir multiphoton mikroskop, bir galvanometre tarayıcı ve bir için optimize edildi dört adet 35 mm Petri kapları için bir ekleme içeren çevresel odası. görüntüleri olmayan bir descanned detektörü (R-NDD) ile elde edildi.

  1. Görüntüleme önce, bir% 5 CO 2 / hava atmosferi elde etmek için çevresel odasını dengelenmesi. Boş Petri kapları odasına gaz sızıntısını önlemek için tutucu takılı olduğundan emin olun.
  2. mikroskopi sistemi açın.
  3. Çevre odası dengelenmiş sonra, 40X Apo uzun mesafe suya daldırma hedefi (NA 1.15) üzerine kırılma endeksi sıvı ekleyin.
    Not: suya benzer optik özelliklere sahip kırılma endeksi sıvı uzun süreli görüntüleme sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için kullanılır.
  4. Yeri gribiodasına retina eksplant ile orodishes. aydınlık ışığını kullanarak, ışık yoluna örnek konumlandırmak ve odak düzlemi içine dorsal retinanın midregion getirmek.
  5. GFAP odaklanmak GFP epifluorescent ışığı kullanın: nGFP Müller glia çekirdekleri (Şekil 2A, C) pozitif.
    NOT: nGFP pozitif çekirdekler ya da loş floresan olacaktır: eksplantlar düz veya agaroz eksplant altında biriken monte değilseniz, bu GFAP üzerine odaklanmak zor olacaktır.
    1. Aynı retina eksplant içinde farklı bir bölgeye hareket odaklama sorunu aşmak olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde farklı bir retina eksplant taşıyın.
  6. görüntü elde etme yazılımı olarak, 'A1 Milletvekili GUI', 'TiPad', 'A1 Kompakt GUI' ve 'ND edinme' pencereleri açın. multiphoton görüntüleme için, 'IR NDD' seçeneği 'A1 Kompakt GUI' seçilen olduğundan emin olun.
  7. 'Batan içindegın 'alanına, 1. dikroik ayna IR-DM seçin ve GFP floresan elde etmek 525/50 bant geçiren filtre seçin.
  8. 'A1MP GUI' etiketli bir pencerede IR lazer açın. Lazer hazır olmak için bir kaç dakika sürer. GFP floresan heyecanlandırmak ve 'A1 Milletvekili GUI' penceresinde 'Otomatik hizalama' butonuna tıklayarak lazer hizalama için 910 nm dalga boyu ayarlayın.
  9. Oda ve ekipmanları ışıkları photomultiplier tüpünün aşırı pozlamayı önlemek için 'A1 Milletvekili GUI' deklanşör açmadan önce kapalı veya örtülü olduğundan emin olun. gürültü seviyelerini azaltmak için, karanlık bir ortamda mikroskop ev.
  10. ikisinin bir zoom ve 4.8 us / piksel piksel konut anda 300 x 300 piksel, görüş alanı görüntülerini elde edin. Kabaca 'A1MP GUI' ve 'A1 Kompakt GUI' penceresindeki kazanç 'satın alan' değiştirerek lazer gücünü kurdu.
  11. z-yığını ayarlama
    1. ND edinme 'penceresinde' içinde Z'-altpencere 'z-yığınının üst odak düzlemini ayarlamak için ganglion hücre tabakası odaklanın. Bazı GFAP: nGFP pozitif hücreler tipik olarak retina (Şekil 2A, D) taban sınırı belirlemeye yardımcı olur ganglion hücre tabakası, yer almaktadır.
    2. Onl düzeyi ile odak düzlemi hareket ettirin (Şekil 2A, B), loş etiketli GFAP varlığı ile karakterize edilir: INL (Şekil 2A, C) muadilleriyle yuvarlak ve genişlemiş göreli nGFP pozitif hücreler .
    3. z-yığının altında bu uçağı ayarlayın. Tüm onl (Şekil 2A, B) yansıması olacaktır emin olun.
    4. Görüntüleme döneminde yeniden ayarlama gerektiren odak düzlemi vardiya, yaşıyor yaparken 'ev' pozisyon olarak atamak için 'z' altpencere orta konumda çift tıklayın. değişiklik 'simetrik mod tanımlanan've 'göreli' tıklayın.
    5. 1 mikron 0.7 arasında z-adım boyutunu ayarlamak.
  12. Z-yoğunluk düzeltmesi:
    1. nedeniyle ışık saçılması piksel yoğunluğu kaybını telafi etmek için z-yoğunluk düzeltmeleri yaparken dokusunun derin katmanlarında görüntüleme.
    2. düzeltme kurmak için, 'z-yoğunluk düzeltme' penceresini açın. 'Z-yığın aralığı', 'ND Kimden' seçin ayarlamak için.
    3. ve kazanç (A1 Kompakt GUI ( 'A1MP GUI' in 'edinim alan') lazer yoğunluğu (bu durumda, ganglion hücre tabakası karşılık gelir) 'z-yoğunluk düzeltme' penceresinde alt odak düzlemi üzerine tıklayın ve set ).
    4. sonradan seçilen odak düzlemi için 'z-yoğunluk düzeltme' penceresinde 'cihaz ayarları' başlığı altında gösterilen ayarları onaylamak için 'z-yoğunluk düzeltme' penceresinde 'z-değerleri' yanındaki oku tıklayın.
    5. Orta a için işlemi tekrarlayınlazer gücü ve kazancı artan nd üst düzlemler. Gerekirse ek odak düzlemi eklenebilir. 4 - Şekil 2 deneyler için özel lazer ve kazanç ayarları için Tablo 1'e bakınız.
    6. 'A1 Milletvekili GUI' penceresindeki 'satın alan' olarak ayarlayın. 15 daha büyük bir kazanç alanı ve photobleaching atlatmak için görüntüleme başında bir kazanç daha yüksek 126 seçmekten kaçınmak ve gürültü seviyeleri arttı.
      NOT: lazerler ve photomultiplier tüpleri photobleaching kaçınarak kurmak mikroskop için en uygun görüntüleme koşulları elde etmek mikroskopi sistemleri, deney lazer ve kazanç ayarları arasında farklılık gösterdiğinden.
    7. 'Z-yoğunluk düzeltme' penceresinde 'nispi yoğunluk düzeltme' seçin.
  13. 'ND edinme' penceresinde 'timeseries' altpencere içinde, 8 saat süre ile 'hayır gecikme' için aralığını ayarlayın. Ardından, t 'Run z-düzeltme' tıklayın emin olun'ND edinme' penceresi düğmesini o z yığın 'alt pencere 3-D timeseries elde etmek.
  14. görüntü alımı süresince 29 ° C - 27 arasındaki bir sıcaklıkta retina eksplantlar koruyun.
  15. görüntü elde etme dönemi boyunca, gerekirse, post-görüntüleme analizi için görüntü kalitesini korumak için güç seviyesini ve kazanç yeniden ayarlayın. 5.11.4 - ayarlamaları için adımları 5.11.2 gerçekleştirin.
  16. odak düzlemi kayarsa, duraklatmak veya akışını durdurur ve yeniden adımı 5.11 gerçekleştirin.
    NOT: 'göreli z-düzeltme' adım 5.12.7 seçildi ve adım 5.11.4 gerçekleştirildi Eğer geniş photobleaching oluştu sürece, güç ve kazanç düzeylerini yeniden ayarlamak için gerekli olmamalıdır.

Hız 6. Analizi

  1. görüntüde 'faiz bölgeyi' ayarı, zaman ayıklayın. 'Zaman ölçümü' aracını kullanın ve bir elektronik tabloya zaman değerleri ihracat.
  2. DI içeren bir bölgeyi kırpmaviding GFAP: nGFP pozitif çekirdeği.
  3. o sonradan bölme çekirdeği bazal INL ile ilgili olarak göç mesafeleri ölçmek için bir referans noktası ayarlamak için İNM uğramayan en az bir çekirdeğin içerecek şekilde kırpılmış bölgenizi seçin. Not: Bazal INL kalan bir çekirdek seçmek için, bu timeseries bir 3-D yeniden hazırlanması için yardımcı olur.
  4. Bir GFAP Alternatif olarak,: nGFP pozitif hücre elde etme süresi boyunca ONL gözlenir, bir referans noktası belirlemek için, bazal INL için onl çekirdekten yayılan sabit uzunluktaki dikey bir çizgi kullanın.
  5. 'Gösteri dilimleri görünümü' fonksiyonunu kullanarak, dik projeksiyonlar oluşturabilir. Daha sonra, 'maksimum intensite projeksiyonu' ile 'dilim' dan modunu değiştirmek.
  6. dik maksimum projeksiyon 'xy' görünümü kapatın. göç / bölme çekirdeği, en iyi görünür hangi yönüne bağlı olarakLSO 'xz'- ya da' yz'-görünüm ya da kapatın.
  7. farenin sağ tuşu ile kalan resmin üzerine tıklayın ve bu görünümden yeni belge oluşturma 'fonksiyonu' xz 'veya' ile yz' görüntü serisi 'ayıklayın. Gerekirse, görüntüyü döndürmek.
  8. 'Manuel ölçüm' fonksiyonunu kullanarak, bazal INL kalır ve İNM uğramayan çekirdeğin alt düzeyde görüntü boyunca yatay bir çizgi çizin (= referans noktası Şekil 4A - E, kırmızı yatay çizgi).
  9. Referans çizgisi ve analiz yazılımı 'hat ölçümü' aracını (- E Şekil 4A) kullanarak timeseries için göç çekirdeğin bazal noktası arasındaki mesafeyi ölçün.
  10. nükleer zarf ayırır kez tüm hücreye GFP difüzyon aşağıdaki tanımlanabilir ise, soma bazal konumunu ölçmek.
  11. Bir tablo yazılımı kullanarak, mesafeyi bir nu arsaçekirdeğinde (Şekil 4F) geçen zamana karşı göç.
    1. Oluşur (v), grafik mesafeler nükleer zarf arıza öncesi dönem için gitti apikal göç hızı (Şekil 4G) belirlemek.
    2. grafik içinde veri serisini seçin, fare sağ tıklayın ve ilgili fonksiyon 'y = mx + c' dahil bir lineer regresyon eğrisini yerleştirin. Işlevinde eğimi 'm' hızı temsil v (Şekil 4G).
    3. Tekrarlayın bazal göç hızı, v b (Şekil 4H) belirlemek için hızlı bazal göç birinci faz için 6.11.1 ve 6.11.2 adımları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 'de şematik olarak tarif edilen prosedüre göre retina izolasyonu hafif zarar görmüş yetişkin Tg'sinden yassılaştırılmış dorsal retinanın kültürlenmesini sağlar [GFAP: nGFP]% 5 CO en az 24 saatlik bir süre boyunca mi2004 zebra balığı 2 / hava ortamı. Bu düz monte retina eksplantlar derin doku seviyelerinde görüntü odak düzlemleri için kullanılabilir. Bir örnek olarak Müller glia / hafif zarar görmüş retinada mitoz sırasında ONL bulunan Müller glia-spesifik promotör GFAP (glial fibrilar asidik protein) GFP ile işaretlenmiş nöronal progenitör hücre çekirdekleri (Şekiller 2A - D, 3). Altında çubuk fotoreseptör EGFP ifade nt19 zebrabalıkları gözler: Daha bu yaklaşım, çeşitli retinal hücre tabakaları görüntüye uygulanabilir olduğunu doğrulamak için, akut izole retina eksplantlar hasarsız Tg [Eco.NfsB EGFP rho] hazırlandırodopsin yükselticisidir. Şekil 2E - H o GFP pozitif çubuk fotoreseptör ve kendi iç kesimlerinin görüntüler elde etmek mümkün olduğunu göstermektedir. çubuk iç kesimleri retina pigment epiteli doğru koni fotoreseptör arasında uzanan gibi, bu veriler görüntü koni fotoreseptör da mümkün olduğunu ima eder. Bu ancak daha fazla araştırılması değildi.

Işık hasarlı retina onl gözlenen Müller glia / nöronal progenitör hücre çekirdekleri olması, detaylı (Şekil 3 ve Film 1) onların göç davranışı ile karakterize edilir. GFP etiketli Müller glia / nöronal progenitör hücre çekirdekleri bunlar genellikle ikamet INL ve onl, fotoreseptör kaybı sitenin bazal konumu arasındaki iki yönlü göç. Tipik olarak, GFAP: - onlar uygulandı önce nGFP pozitif çekirdekler INL kısa bir mesafe (C Şekil 3A) göçnükleer zarf arıza, hala tüm Müller glia / nöronal progenitör hücre (Şekil 3D) sitoplazması içine GFP yeniden dağıtılması dayalı INL konumlandırılmış iken. Onl hücre bölünmesi ardından, iki GFAP: nGFP pozitif çekirdekler bazal INL (- J Şekil 3H) iade onl (Şekil 3F, G) görünür hale gelmiştir. Hücre bölünmesi üzerine, yeni doğan çekirdekler başlangıçta çok loş ve (Şekil 3G) tanımlamak için bu nedenle zor. Ancak, mitoz sonra bir-iki süreler dahilinde, nükleer GFP floresan nükleer göç görselleştirme (- J Şekil 3H) etkin olan, parlak oldu. Canlı hücre görüntüleme, Şekil 3'te gösterilen bir hücre için retina apikal yüzeyine yatay olarak meydana gelen bölümü düzleminin (Şekil 3F, G), görselleştirme izin verdi. Diğer transjenik zebrabalıkları çizgiler olarak kullanılması da mümkündürTg [GFAP: EGFP] ile sitoplazmada GFP ifade NT11 zebrabalıkları (veriler gösterilmemiştir). Güvenilir apikal hareketi ve yatay hücre bölünmeleri belirlemek mümkün olsa da, tam olarak Tg içinde dorsalde göç kızı çekirdekleri ve dikey hücre bölünmeleri konumunu belirlemek oldukça zordur [GFAP: EGFP] NT11 zebra balığı retina (veriler gösterilmemiştir).

Hız belirlemek için, bir GFAP: nGFP pozitif çekirdek kayıt dönemi boyunca göç etmedi referans noktası (- E yıldızı, Şekil 4A) olarak seçildi. Maksimum xz veya görüntü serisinin her zaman noktasında - nGFP pozitif çekirdeğin (E yatay kırmızı çizgi, Şekil 4A): - göç çekirdeğinin (dikey kırmızı çizgi, Şekil 4A E) mesafe referans GFAP ile ilgili olarak tespit edildi yz-çıkıntılar (bağlı hangi açıdan en çekirdekleri olabilir visuali) En verimli şekilde zed. Çekirdek göç mesafesi bir elektronik tabloya (- H Şekil 4F) zamana karşı çizilmiştir. Çekirdek zarı analizi çoğu zaman, tüm hücre içinde GFP yeniden dağıtımı (bu örnekte hücre gövdesi bazal büyük bir kısmı) bir ilk basalward hareketi olarak grafikte görülmektedir. Apikal hız nükleer zarf arıza öncesi dönem (kırmızı elmas, Şekil 4G) için zamana karşı çizilen mesafeye bir lineer regresyon eğrisi (gri noktalı çizgi, Şekil 4G) uydurma, nükleer zarf arıza öncesi tespit edildi. lineer regresyon eğrisi (y = mx + c) yamaç 'm' hız 'dx / dt' temsil eder. Şekil 4'de yer alan hücre için apikal hızı 10.89 mm / saat idi. Aynı yaklaşım, başlangıçtaki hızlı bazal hareket hızı (v b) yeni oluşan kızı çekirdeklerinin (Şekil 4F hesaplamak için uygulanmıştır H). Yavru hücre D1 ve D2 -67,71 ve 33.51 mm / saat bazal geçiş hızları V B sırasıyla hızlı apikal hızından nispeten edildi. Ne yazık ki, tüm hücre boyunca yayılmış GFP nükleer zarf arıza sonrası apikal hızını tespit etmek mümkün değildi. Bunun yerine, anlık hız nükleer zarf arıza ve yeni kurulan kızı çekirdeklerinin ilk görselleştirme önce çekirdeğinin zamanlaması ve pozisyonuna göre hesaplandı. Kızı çekirdekleri görünür hale geldiğinde kromatin, mitoz telofaz için onl önce ulaştığında Şekil 4'te gösterilen hücre için 7.9 mm / h anlık hız muhtemelen gerçek rakamın altındadır.

Özetlemek gerekirse, retina eksplant kültürü zebrabalıkları retina ve göç ve hücre bölünmesi pa belirlenmesi yenileyici yetişkinde INM canlı hücre görüntüleme sağlarBireysel çekirdek nütrisyonel parametrelerin değerlendirilerek nütrisyonel.

Şekil 1
Şekil 1: Retina İzolasyon Prosedürü. A) şematik olarak göz ile bir Zebra balığı kafasını gösteren. B) göz zebrabalıkları çıkarıldı ve öğrenci ile göz önüne göstermek için aydınlatmaktadır. Optik sap (dolu siyah daire) ile gözün arka (D görünür hale gelir) ve öğrenci aşağıya bakacak şekilde C) gözü 180 ° döndürün. Gri renkli gözün sklera varlığını gösterir. E) McPherson-Vannas bir makas biri bıçak beyaz parçalı çizgi ile gösterilmektedir onun dorsal ve ventral tarafta içine kesmek için gözün optik sap (dolu siyah daire) sokulur. F) ventral yarısı çıkarıldı sonra gözün Dorsal yarısı. Siyah yarım daire t gösterirO optik sapı kalan kısmı. G) hala sklera (gri çizgi ile kaplı retina (kahverengi), vitreus (gösterilmemiştir) ve lens (L, açık gri daire) ile 90 ° geriye ortaya çıkarmak için göz (H) gözün içini açın ). I) sklera (not, gri çizgi) eksik müstakil ve J) objektif ve vitreus sadece retina (kahverengi) sebebiyet veren kaldırıldı. K) Retina dorsal retina (L) düz monte görünümüne 90 ° ileri veren yükselişi döndü. M) Dorsal retina eksplant bir cam alt fluorodish düz monte. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: 3-D İmarRetina multiphoton Z-Yığınları. GFAP bir multiphoton z yığın görüntü serisi A) 3-D yeniden: Işık hasarı 48 saat sonra zebrabalıkları retina tüm montaj kültürlerde nGFP- pozitif hücreler. B - D) GFAP tek multiphoton XY-fotoğraflar Müller içeren katmanına karşılık gelir ONL'deki (B) INL (C) seviyesinde) A (3D-yeniden görüntülenen nGFP pozitif hücrelerin glia soma ve GCL (D). Nükleer zarf arıza sonrasında onl büyütülmüş yuvarlak Müller glia gösterir (B) Ok. E) hasar görmemiş bir Tg bir retina eksplant bir multiphoton z yığın görüntü serisi 3-D rekonstrüksiyon [rho: Eco.NfsB EGFP] nt19 zebra balığı. F - H) çubuk iç kesimleri (RIS, F), çubuk nükleer tabaka düzeyinde Tek multiphoton xy-images (G) Ve iç retina (H) düzeyinde. GCL, ganglion hücre tabakası; INL, İç Nükleer Katman; Onl, dış nükleer tabaka; RIS, Rod İç Segmenti. A, D, E ve H, 10 um 'deki ölçek çizgisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: INM Timelapse Resim Serisi. A - Tg görüntüleyen z yığın timelapse serisi 3D-yeniden J) Görüntü serisi [GFAP: nGFP] mi2004 retina eksplantlar onl (üst satır) bölmek için İNM geçmesi pozitif çekirdekleri. bir apikal göç çekirdek ve onun dorsalde göç kızı çekirdeklerinin pozisyonu kırmızı oklarla gösterilir. Kırmızı yıldız mitoz sırasında nükleer zarf arıza olduğunu gösterir. A - J, alt sıra)Üst üste aynı görüntü serisi doygun ve onl içinde bölünen hücreleri odaklanmak kırpılmış. INL, İç Nükleer Katman; IPL, İç Pleksiform Katman; Onl, dış nükleer tabaka. A Ölçek çubuğu, 10 mikron ve B için aynıdır - J. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: Apikal ve Bazal Göç Hızları Analizi. A - E) Tg z-yığın görüntü serisi maksimum yz-projeksiyon [GFAP: nGFP] çoklu foton mikroskobu ile elde edilen timelapse kayıt farklı zaman noktalarında mi2004 retina eksplantlar. 'Manuel ölçüm' fonksiyonu altında satırı aracını kullanarak, bir yatay çizgi bir yıldız ile gösterilen referans hücre düzeyinde yerleştirildi. Dikey measurement çizgi yatay çizgi başlayan ve göç GFAP bazal pozisyonuna uzanan konumlandırılmış edildi: nGFP pozitif çekirdekten. Ölçüm hattının uzunluğu görüntüleri ve görüntülerinin altında okunabilmesi için beyaz kutulara verilmiştir. L1 yavru hücre 1 göç = uzunluk; L2 yavru hücre 2 göç = uzunluğu. F) Uzaklık hücre (A ölçülen (F0) o - E) apikal göç ve ortaya çıkan yavru hücre D1 ve D2 multiphoton timelapse kayıt dorsalde göç söyledi. Kırmızı çizgi siyah ve gri çizgiler sırasıyla, (v b) D1 ve D2 bazal göç hızları hesaplamak için kullanılan ölçümler işaret ederken apikal göç hızı (v) hesaplanmış olduğu ölçümlerini gösterir. G, H) mesafe nükleer zarf arıza (G önce apikal göç için Excel zamana karşı çizilen) ve hızlı bazal fazyavru hücre D1 (H) için göç. Doğrusal regresyon eğrileri monte edildi ve işlevleri hızı temsil eğimli grafikler aşağıda verilmiştir. INL, İç Nükleer Katman; IPL, İç Pleksiform tabakası; Onl, dış nükleer tabaka. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tg [GFAP: EGFP] NT11 Tg [rho: Eco.NfsB EGFP] nt19
lazer gücü kazanç lazer gücü kazanç
En (çubuk fotoreseptör) 13 126 3.5 118 Orta (Müller glia) 10 126 2.8 118
Alt (GCL) 8 126 2.1 118

Tablo 1: Lazer ve Şekil 2 Görüntülenen Deney için farklı düzlemler de Z-Yoğunluk Düzeltmeler için kullanılır Kazanç Düzeyleri - 4.

şekil 2
Film 1: multiphoton Mikroskobu Retina Eksplantlarından Canlı hücre Görüntüleme. (Sağ indirmek için tıklayın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hasarlı yetişkin Zebra balığı retinanın ağırlıklı kullanılan immünositokimyasal yöntemler 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30 yenilenmesini düzenleyen mekanizmaları araştıran çalışmalar. kültür retina eksplantlar koşulları oluşturulması ve bu tür INM olarak fenomenler, canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek bize derinlik mekansal ve zamansal bilgi elde etmek için bir teknik sağlamaktır. Bu teknik, taşıma hızları, mitoz ve uzunluk ve hücre bölünmesinin pozisyonda ön fazı ve başlangıç ​​zamanı çekirdek zarı arıza konumunun belirlenmesi izin verir. Ayrıca, onların sonraki konumu açısından ele bölünme uçağı ve ortaya çıkan yavru hücrelere kaderini kurmak mümkündür. Sonuçta, bu güçlü yaklaşım belirleyecek M olsun2; ller glia ve nöronal progenitör hücreler retina rejenerasyon sırasında INM açısından farklı davranır. Rejenerasyon yanıtının farklı aşamalarında yenileyici retinada çoğalan hücreleri tanımlamak transgenik zebrafish hatlarının kullanımı diferansiyel davranışını 6 deşifre yardımcı olacaktır. Burada kullanılan multiphoton mikroskop durumunda, GFP raportör zebra balığı hatları çok etkili değildir kırmızı flöresanlı proteinin (RFP) uyarılması olarak özellikle tercih edilir; bununla birlikte, diğer multiphoton sistemleri RFP veya eşdeğer fluorophores etkin uyarma izin verebilir.

retina izolasyon prosedürü en kritik adımlardan biri retina artıyor. Retinalar multiphoton ışık onl derin z-seviyelere geçmek için edebilmek için mümkün olduğunca düz monte edilmelidir. immobilize etmek için kullanılan retina kültürü altında, özellikle sınır bölgesinde retina kalıntı vitröz ve / veya agaroz birikimi, kavisliDoku, en yaygın kapak kayma ve retina kültür arasındaki ekstra boşluk tanıtmak. retina düz değildir ve bu sonuç artan photobleaching ve retina kültürünün azaltılmış canlılığı neden olur Buna ek olarak, artan lazer gücü ve kazanç görüntüler elde etmek için kullanılması gerekmektedir. Yanlış montaj genellikle nedeniyle de azalmış ışık penetrasyonu daha düşük görüntü kalitesi ile sonuçlanır ve çekirdekler nedenle göç hızlarının hesaplanması göç ve vardı mesafeleri ölçmek için yeteneğini etkiler.

Mi2004 Zebra balığı retina eksplantlar: Nükleer zarf arıza öncesi ve bazal göç apikal göç hızları güvenilir Tg [nGFP GFAP] 'den bir görüntü serisinde tespit edilebilir. Ancak, tüm sitoplazma boyunca GFP yeniden dağıtımların olarak bu transgenik zebrafish doğrultusunda nükleer zarf arıza sonrası kromatin apikal göç hızını belirlemek mümkün değil. LabeliNükleer boya Hoechst ile retina eksplant ng dokusunun canlılığını etkilemiş ve hücre döngüsünün durmasına neden 830 nm (Lahne & Hyde, yayınlanmamış veri), için dalga boyu değişikliği gerekli Müller glia çekirdekleri içine loş alımı sonuçlandı ( Lahne & Hyde, yayınlanmamış veri). Retina gelişimi sırasında, Tg [h2afva: h2afva-GFP] histon 2 kaynaşmış GFP ifade kca6 zebra balığı başarıyla INM izlemek ve hücre döngüsü 12, 31 farklı aşamalarında geçiş hızları belirlemek için kullanılmıştır. Gelecekte, Tg [h2afva: h2afva-GFP] retina eksplantlar kca6 zebrabalıkları aynı zamanda hücre döngüsü boyunca kromatin görselleştirme sağlayacak ve Zebra balığı retinanın yenileyici yetişkin nükleer membran arıza sonrası apikal göç hızının analizine imkân verecektir.

tarafından İNM izlemek için koşulları kuranIşık hasarlı yetişkin zebrabalıkları ve hızların gelen analizinden retina eksplant canlı hücre görüntüleme İNM düzenleyen mekanizmaların araştırılması temel teşkil edecektir. Bazı çalışmalar mitotik fosfo-histon 3-pozitif çekirdeklerin 6, 7 konumunu belirlemek için immünsitokimya kullanarak retina yenileyici erişkin INM mekanizmaları incelemeye başladı. Ancak, sinyal yolları ile müdahale mitoz pozisyonunu hale olmayabilir, ama böyle / olası immünsitokimya tarafından ayırt etmek çok zor olmaz hızı, mitoz ve bölünme zamanlama gibi diğer parametreleri etkileyebilir. Önceleri, dynactin mutantlar ve morphants 11 gelişmekte olan retinada daha bazal pozisyonları mislocalized o fosfo-histon 3-pozitif mitotik çekirdeklerini gösterilmiştir. Ancak, sonraki canlı hücre görüntüleme nükleer göç bölümü hücre önce dynactin-tehlikeye hücrede gecikmiş olduğunu ortaya koymuşturs, artan apikal göç hızı ulaşmak ve apikal yüzeye 11, 12, hücre bölünmesi geçmesi çekirdek etkin iken. Bu örnek canlı hücre görüntüleme gücünü örneğidir. Zebra balığı retinanın yenileyici erişkin İNM kolaylaştıracak mekanizmalar çözülüyor Benzer şekilde, canlı hücre görüntüleme çalışmaları tamamlayacak ve çeşitli durumlarda, immünositokimyasal yaklaşımlar üzerinde avantajlı olacaktır.

Yukarıda tartışıldığı gibi, canlı hücre görüntüleme immünohistokimyasal / statik yöntemler üzerinde birçok avantaj sunuyor; Bununla birlikte, retina eksplantlar bir ex vivo modeli olduğu akılda tutulmalıdır. Böyle, hasar izolasyon prosedürü sırasında ortaya çıkan ve / veya kültür koşulları hücresel süreçleri etkileyebilir. Buna ek olarak, görüntüleme işlemi kendisi hücresel davranışı 23, 32 etkileyebilir toksik etkilerini gösterebilirler. disadv olmaklaüstünlükleri-canlı hücre retina kültürlerin görüntüleme için, bu INM dinamik bilgi almak için elimizden geleni yöntem şu anda. En önemlisi, retina eksplant canlı hücre görüntüleme prosedürü retina rejenerasyon sırasında diğer biyolojik sorulara geçerli olacaktır. Immünositokimyasal verilere dayanarak, daha önce Müller glia ışık kaynaklı fotoreseptör hasarı 33 aşağıdaki fotoreseptör / enkaz ölüyor fagosite olduğu öne sürüldü. ölen Fotoreseptörlerin fagositoz yenileyici Zebra balığı retinada meydana gelir ve altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanılabilir, bu süreç görüntü parametreleri canlı ayarlanması teyit edecektir. Images [rho: Eco.NfsB EGFP] Tg rod çekirdekleri ve çubuk iç kesimleri düzeyinde elde edilebilir olduğunu göstermiştir sonra nt19 Zebra balığı, görüntü fotoreseptör fagositozu koşulları ayarlamak için uygun olmalıdır. Benzer şekilde, bilgi mikroglia dinamik davranışı ve onların yöneten mekanizmaları ile ilgili sınırlıdejenere fonksiyon ve yenileyici retina 34, 35. Canlı hücre görüntüleme ile birlikte mikroglia özel transgenik zebrafish Kötüye da zebrabalıkları retina 36, 37 yenileyici yetişkin mikroglia işlevi anlayışımızı artacaktır. Özetlemek gerekirse, retina eksplant canlı hücre görüntüleme hücresel süreçlerin dinamik bilgi edinmek ve yenileyici retinada farklı hücre tiplerinin davranış ve işlevini belirlemek için güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

William Archer ve Notre Dame Entegre Görüntüleme Tesisi tarafından sağlanan destek için teşekkür ederiz. Özel teşekkür onların sürekli yardım ve onların bakım ve zebrafish hayvancılık için Freimann Yaşam Bilimleri teknisyenleri yönlendirilir. Bu çalışma DRH için NIH Ulusal Göz Enstitüsü (R01-EY018417, R01-EY024519) ve Zebra balığı Araştırma Merkezi, Notre Dame Üniversitesi, Notre Dame, IN hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 120 retina eksplant multiphoton mikroskopisi canlı hücre görüntüleme Zebra balığı interkinetic nükleer göç kültür rejenerasyon Müller glia mitoz hız
Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,… More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter