Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Behandling av ligamentkonstruksjoner med treningskondensert serum: en translasjonell vævsteknikkmodell

Published: June 11, 2017 doi: 10.3791/55339
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3
1Department of Neurobiology, Physiology, and Behavior, University of California, Davis, 2Department of Physiology and Membrane Biology, University of California, Davis, 3Faculty of Kinesiology and Physical Education, University of Toronto

Summary

Vi presenterer en modell av ligamentvev, hvor tredimensjonale konstruksjoner behandles med det menneskelige treningsconditionerte serum og analyseres for kollageninnhold, funksjon og cellulær biokjemi.

Abstract

In vitro- eksperimenter er avgjørende for å forstå biologiske mekanismer; Imidlertid er gapet mellom monolags vevskultur og menneskelig fysiologi stor, og oversettelsen av funn er ofte dårlig. Dermed er det god mulighet for alternative eksperimentelle tilnærminger. Her presenterer vi en tilnærming hvor menneskelige celler isoleres fra menneskelige fremre korsbåndsvevrester, utvidet i kultur, og brukes til å danne manipulerte ledbånd. Øvelse endrer det biokjemiske miljøet i blodet slik at funksjonen til mange vev, organer og kroppslige prosesser blir bedre. I dette forsøket ble ligamentkonstruksjonskulturmedier supplert med eksperimentelt humant serum som har blitt "kondisjonert" ved trening. Dermed er intervensjonen mer biologisk relevant siden et eksperimentelt vev utsettes for det fullstendig endogene biokjemiske miljøet, inkludert bindingsproteiner og tilleggsforbindelser som kan forandres i takt med aktiviteten til enUkjent agent av interesse. Etter behandling kan manipulerte ledbånd analyseres for mekanisk funksjon, kollageninnhold, morfologi og cellulær biokjemi. Samlet sett er det fire store fordeler i forhold til tradisjonelle monolagskultur og dyremodeller, av den fysiologiske modellen av ligamentvev som presenteres her. Først er ligamentkonstruksjoner tredimensjonale, slik at mekaniske egenskaper ( dvs. funksjon) som maksimal strekkspenning, maksimal strekkbelastning og modul, kan kvantifiseres. For det andre kan entesis, grensesnittet mellom boney og sengeelementer, undersøkes i detalj og innenfor funksjonell sammenheng. For det tredje, forbereder media med etterøvelsesserum effektene av det treningsinducerte biokjemiske miljøet, som er ansvarlig for det brede spekteret av helsemessige fordeler av trening, som skal undersøkes på en upartisk måte. Endelig fremmer denne eksperimentelle modellen vitenskapelig forskning på en human og etisk måte ved å erstatte bruken avDyr, et kjernemandat av National Institutes of Health, Senter for sykdomskontroll, og Food and Drug Administration.

Introduction

Tendon- og ligamentskader er vanlige og kan ha forstyrrende konsekvenser for normal mobilitet og livskvalitet. Kirurgisk inngrep er ofte nødvendig, men kan ha begrenset og variert suksess 4 , 5 . Den nåværende forståelsen av hvordan sener og leddbånd utvikler, modnes og reagerer på skade er ufullstendige, og dermed er det behov for effektive forskningsmodeller for å gi innsikt i utviklingen av mer effektive behandlinger 5 . For å løse dette kunnskapsgapet kan dyremodeller brukes, men in vivo- studier er iboende komplekse med vanskeligheter med å kontrollere miljøet og rettet mot inngrep til det tilsiktede vevet. I motsetning kan det eksperimentelle miljøet enkelt styres og overvåkes in vitro med tradisjonell monolagcellekultur. Denne teknikken kan imidlertid oversimplisere det kjemiske og mekaniske miljøet og kan derfor ikke rekapituereSen in vivo oppførsel av cellene. Vevsteknologi er i stand til å gifte seg med fordelene med det komplekse in vivo miljøet i dyremodeller med kontroll av in vitro- miljøet og gir et ekstra verktøy for å studere fysiologi. I tillegg, bevæpnet med en bedre forståelse av ligamentutvikling, kan vevsteknikk også gi en kilde til graftvev når kirurgisk rekonstruksjon kreves 6 . Således validerer fremgangsmåten beskrevet heri et in vitro 3D-konstruert vev som kan brukes til å studere ligamentfunksjon og morfologi.

Fibrinbaserte sener eller ligamentkonstruksjoner har blitt anvendt som en in vitro- modell for å studere fysiologiske prosesser, inkludert kollagenfibrillogenese 7 og senerutvikling 8 , samt translasjonsapplikasjoner hvor deres brukbarhet som graftvev har blitt evaluert i en fårmodell av fremre crudeCiate ligament (ACL) rekonstruksjon 9 . Vårt laboratorium har tidligere etablert en 3D-konstruert ligamentmodell som spenner over to pensitt, et kalsiumfosfatbein-erstatningsmateriale, sementankre. Denne modellen kan enkelt underkastes forskjellige eksperimentelle forhold ved å supplere kulturmediene med biologiske faktorer 10 eller anvende mekanisk stimulering 11 . Det er viktig at denne ben-til-ben-ligamentmodellen muliggjør en grundig analyse av enthesis, grensesnittet mellom boney og sengeelementer, som er utsatt for skade.

I studien uthevet 1 her for å presentere denne metoden, var vi interessert i effekten av treningsinducerte endringer i det biokjemiske miljøet på ligamentfunksjonen. Øvelse forbedrer mobil- og orgelfunksjonen i en rekke vev gjennom hele kroppen 2 , 3 , 12 , en effekt som kan tilskrives frigjøring av forskjellige kjente (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , meteorinlignende 15 , exosomer 16 , 17 ) og andre ukjente, biokjemiske faktorer frigjort i systemisk sirkulasjon . Videre er det biokjemiske miljøet etter øvelsen beriket med treningsresponsive hormoner, hvor frigjøringen stimuleres av sympatisk nervesystemstimulering av sekretoriske kjertler ( f.eks . Kortisol og katekolaminer fra binyrene 18 og veksthormon fra den fremre hypofysen 19 ). Imidlertid er det ikke mulig å skille mellom effektene av den mekaniske stimulansen til trening fra treningsinducerte biokjemiske endringer. Mens noen studier har preget den forventede økningen av visse sirkulerende hormoner og cytokiner som respons på exercisE som nevnt ovenfor, er det for mange faktorer, både kjente og ukjente, å trofaste rekapulere in vitro. Det vil si at isolering av noen få faktorer for en in vitro- studie tar ufullstendig hensyn til kompleksiteten av den biokjemiske responsen. I denne studien undersøkte vi hvordan endringer i det serologiske biokjemiske miljøet som følge av trening, påvirker konstruert ligamentfunksjon. For å isolere effektene av de biokjemiske endringene, oppnådde vi serum fra menneskelige deltakere før og etter en kamp mot motstandsøvelse og brukte den til å behandle 3D-konstruerte ligamenter dannet ved hjelp av human-anterior cruciate ligament (ACL) fibroblaster. Ved hjelp av denne modellen kan vi få funksjonelle data, inkludert effekter på mekaniske egenskaper og kollageninnhold, samt kvantifisere effekter på molekylær signalering.

Protocol

Følgende prosedyrer overholder en protokoll som ble godkjent av Institutional Review Board av University of California, Davis; Rådfør deg med det lokale etikkdokumentet før du begynner med forskning.

1. Isolere primære fibroblaster fra humane ACL-rester

MERK: Vedlikehold sterilitet og utfør alle trinn i et biologisk sikkerhetsskap (BSC).

  1. Få godkjenning fra det aktuelle etikkrevurderingsbordet for innsamling og bruk av humant vev som beskrevet nedenfor.
  2. Forbered 5x antibiotika / antimykotisk (ABAM) løsning ved å fortynne 100x antibiotika / antimykotisk oppløsning i 1X fosfatbuffert saltvann (PBS)
  3. Samle ACL vev fragmenter i 5X ABAM løsning i et 50 ml konisk rør, lagre ved 4 ° C til fordøyelsestrinnet. Klipp vev i mindre fragmenter med et knivblad hvis det er nødvendig til en maksimal størrelse på 1 x 1 x 1 cm 3 .
    FORSIKTIG: Følg lokale biohazardforskrifter forRiktig bruk av biohazard-materiale og dekontaminering og avhending av biohazard-avfall.
  4. Forbered et tilstrekkelig volum av kollagenaseoppløsning for å senke vevsfragmentene. Oppløs kollagenase type II (1 mg / mL) i høyt glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) som inneholder 1x penicillin / streptomycin og 20% ​​føtalt bovint serum (FBS) og filter ved 0,22 μm.
  5. Skyll ACL vev tre ganger i PBS.
  6. Fordøye vev. Overfør ACL-vev til et nytt 50 ml konisk rør og tilsett et tilstrekkelig volum av kollagenase-oppløsning for å senke vevet. Inkuber ved 37 ° C over natten (~ 17 timer).
  7. Før fordøyelsestiden er fullført, utarbeide vekstmedium (GM) ved å supplere DMEM høyt glukosemedium med 10% FBS og 100 U / ml penicillin.
  8. 15 minutter før fordøyelsestiden er fullført, vortexes det vevsholdige 50 ml rør 3 ganger hvert 5. minutt.
  9. Bruk en 25 ml serologisk pipette, triturate det fordøyede vevet kraftig for å bryte tiSsue opp lenger og dislodge celler.
  10. Sentrifuge ved 1500 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml GM.
  11. Gjenta trinn 1.8-1.9 tre ganger.
  12. Etter siste sentrifugering resuspender pelleten i 5-10 ml GM. Bruk en liten prøve av cellesuspensjonen til å utføre en celletelling med et hemocytometer og vurdere cellens levedyktighet ved hjelp av Trypan Blue.
  13. Plater cellesuspensjonen på 15 cm vevskulturplater ved en tetthet på 3-4 x 10 5 celler per plate.
  14. Kultur til 70% sammenflytelse i en steril inkubator opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO2, endring av GM hver tredje dag. Bruk eller lagre (se nedenfor) celler innen 5 passasjer.
  15. Frys celler for fremtidig bruk.
    1. Trypsiniser celler ved 70% sammenløp som følger. Aspirere medier og vaske celler med PBS. Legg til nok forvarmet (37 ° C) 0,05% trypsin for å bare dekke bunnen av vevskulturplater. Plasser plater i kultur-inkubAtor for ~ 5 min til cellene løsnes (kontroller at celler flyter ved hjelp av et lysmikroskop). Bruk en pipette til å samle inn celler og dispensere inn i et Falcon-rør.
    2. Sentrifuger til pelletsceller og resuspender celler i DMEM høyt glukosemedium som inneholder 20% FBS og 10% dimetylsulfoksid (DMSO). Aliquot cellesuspensjon i cryovials og avkjøl ved -1 ° C / min i minst 24 timer. Oppbevar frosne cryovials i flytende nitrogen.

2. Forbered silikonbelagte plater

  1. Forbered 35 mm vevskulturplater: Fjern lokkene og legg ut åpne plater på en flat overflate.
  2. Bland silikon elastomer sett i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Bruk en 10 ml sprøyte til å dispensere ca 2 ml per 35 mm plate.
  4. Tillat silikon å kurere ved romtemperatur i 2-3 dager.

3. Forbered Brushite Cement Anchors

  1. På forhånd, lag silikon revers-molds som inneholder sylindrisk viLls for ankerformasjon. Omvendte former kan gjøres til spesifikasjonene for ønsket ankerform og størrelse.
    1. Bestem ønsket høyde og diameter på sluttanker. Denne protokollen bruker en skreddersydd form som er dannet fra håndverkssilicone i en 35 mm vevskulturskål hvor plastsylindere på ca. 3,25 mm i diameter ble plassert, noe som muliggjør en endelig formhøyde på ca. 6,5 mm. Endelige ankermål er ca 3-3,5 mm i høyden og ca. 3,4 mm i diameter med 1,5 mm pin utragende fra bunnen av ankeret.
    2. Tilsett uherdet silikon i en 35 mm tallerken der støpeformen skal skje. Plasser plastbeholdere tilsvarende.
      MERK: Størrelsen på plastbeholdere vil bestemme diameteren til de endelige ankre. Plasseringen av plastsylindrene og mengden silikon som brukes kan modifiseres for å fremstille forankre av forskjellige høyder. Tykkelsen mellom bunnen av brønnene i formen og bunnen av formen selv vil dEtermin hvor mye stiftet kan stikke fra bunnen av ankeret, slik at ankeret senere kan festes fast i den silikonbelagte parabolen.
    3. Etter å ha slukket silikonet, fjern plastbeholdere og fjern støpeformen fra 35 mm fatet.
  2. Forbered en 3,5 M ortofosfor / 100 mM sitronsyreoppløsning. Oppløs 0,961 g sitronsyre i 11,5 ml ortofosforsyre. Oppløs volumet av oppløsningen opp til 50 ml med MilliQ vann. Oppbevares ved romtemperatur og beskyttes mot lys.
  3. Forbered mold: Legg en minutien pin i midten av hver sylindrisk brønn i formene.
  4. Kombiner β-tricalciumfosfat og ortofosforsyre / sitronsyreoppløsning ved en 1 g / ml konsentrasjon i en plastvektbåt på is.
  5. Bland sementet kraftig ved hjelp av en plastcelleskraper.
  6. Triturater sementen for å fortsette blanding og pipettblanding i formen
  7. Sentrifuger den fylte molden i 1 min ved 2,250 x g.
  8. La børstet sementankre settes til romtemperatur over natten.
  9. Fjern ankre fra formen og pin to ankre 12 mm fra hverandre i hver silikonbelagt plate.
  10. Steriliser pinnede plater ved å sprøyte med 70% etanol, fylle både platene og dekslene og sett inn i et BSC. Etter minst 30 min, aspirer plater og bytt lokk, lagre i BSC til behov.

4. Skaff menneskelig serum

  1. Sørg for at godkjenning fra det aktuelle etikkrevurderingsbordet er innhentet for denne protokollen.
  2. Sørg for at skriftlig informert samtykke er hentet fra mennesker for å delta i en gitt intervensjon (for eksempel trening, mat eller legemiddelintervensjon) som vil påvirke ønskede endringer i serum. Her beskriver vi samlingen i ro og 15 minutter etter motstandsøvelse.
  3. Ved hjelp av en trent phlebotomist, oppnå en hvilende blodprøve fra en deltaker ved venepunktur i en passende evakuert beholder. Samle en blodprøve etter 15 minutter etter at deltakerne har deltatt i ønsket treningsprotokoll. Som tidligere beskrevet 1 , bruk motstandsøvelsesprotokollen i dette eksperimentet for å stimulere en endogen biokjemisk respons.
    1. Få deltakere til å utføre fem sett med benpress med et minutt hvile mellom settene. Deretter skal deltakerne utføre et sett med knelengder og et sett med hamstringkrøller etter hverandre uten hvile, og gjenta deretter øvelsene tre ganger med 1 min hvile mellom settene.
  4. Tillat blod å koagulere før sentrifugering ved 1500 xg i 10 minutter. Under sterile forhold, overfør serum til sterile rør for fremtidig medietilskudd (serum lagret ved 4 ° C) og biokjemisk analyse (en liten alikvot av serum lagret ved -20 ° C).

5. Form Engineered Ligaments

MERK: I forkant utvide primærfibreBroblaster og klargjør silikonbelagte plater med pinnede børstetanker.

  1. Klargjør reagenser:
    1. Forbered trombin. Oppløs oksintrombin ved 200 U / mL i DMEM høyt glukose medium. Filtrer ved 0,22 μm, alikvot og lagre ved -20 ° C.
    2. Forbered fibrinogen. Oppløs bovint fibrinogen ved 20 mg / ml i DMEM høyt glukose medium. Inkuber i 3-4 timer i et 37 ° C vannbad, hvirv hver 30. minutt for å hjelpe oppløsning. Filter ved 0,22 μm (det kan være behov for flere filtre), alikvot og lagre ved -20 ° C.
    3. Forbered aprotinin. Oppløs aprotinin i 10 mg / ml i vann. Filtrer ved 0,22 μm, alikvot og lagre ved -20 ° C.
    4. Forbered aminohexansyre. Oppløs aminoheksansyre ved 0,1 g / ml i vann. Filter ved 0,22 μm, alikvot og lagre ved 4 ° C.
    5. Forbered ascorbinsyre. Oppløs askorbinsyre i DMEM høyt glukosemedium ved en konsentrasjon på 50 mM. Filtrer ved 0,22 μm og lagre ved 4 ° C.
      6. <Li> Forbered L-prolin. Oppløs L-prolin i PBS ved en konsentrasjon på 50 mM. Filtrer ved 0,22 μm og lagre ved 4 ° C.
    6. Forbered transformasjonsvekstfaktor-β1 (TGF-β1). Rekonstituer TGF-β1 i henhold til produsentens anvisninger ved en konsentrasjon på 10 μg / mL. Aliquot og lagre ved -20 ° C.
  2. Bestem antall konstruksjoner som kreves for forsøket, og sørg for at tilstrekkelig antall pinnede plater er utarbeidet. Både biologiske og tekniske replikater anbefales. I studien 1 uthevet her, bruk dupliserte tekniske replikater og 12 biologiske replikater (serum fra 12 personer i hvile og etter trening).
    MERK: Utfør følgende trinn under sterile forhold i en BSC.
  3. Utvide celler ved å dyrke i 15 cm plater til 70% sammenføyning. 2,5 x 10 5 celler kreves per konstruksjon.
  4. Trypsiniser celler og resuspender i GM ved en konsentrasjon på 3,67 x 105 celler / ml.
  5. Generer en masterblanding for antall konstruksjoner som kreves: For 1 konstruksjon inneholder masterblandingen 681 μL cellesuspensjon (inneholdende 2,5 x 10 5 celler), 29 μL trombin, 2 μl aprotinin og 2 μL aminoheksansyre.
  6. Etter å ha blandet masterblandingen godt, legg til 714 μL til hver spinnplate i et 'figur 8' mønster rundt penselt sementanker. Forsikre deg om at mastermixen har direkte kontakt med sidene på ankrene.
  7. Trykk forsiktig på hver plate for å fordele masterblandingen jevnt over platen.
  8. For en plate om gangen, legg 286 μL fibrinogen dråpevis jevnt over en plate og skyv platen frem og tilbake og side om side over overflaten av BSC for å distribuere fibrinogenet for å danne de celle-innebygde fibringelene . Fortsett til neste plate.
  9. Plasser konstruksjonene i en steril inkubator opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO2 og inkuberI minst 15 minutter for å tillate polymerisering av fibrinogenet.
  10. Forbered tilstrekkelig matemedia (FM) for 2 ml per konstruksjon. Supplement GM med 200 μM askorbinsyre, 50 μM prolin og 5 ng / ml TGF-β1.
  11. Legg til 2 ml FM for å dekke hver konstruksjon. Kultur konstruksjonene i en steril inkubator opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO 2 i totalt 14 dager eller til ønsket sluttpunkt, forfriskning av media hver andre dag med 2 ml FM

6. Trinntesting Engineered Ligaments

MERK: Tensilprøving ble utført ved hjelp av en skreddersydd tester i et PBS-bad; Omvendte støpegriper som er koblet til krafttransduktoren hold borstitt sement ankre på plass under testen.

  1. Bestem lengden og bredden av ligamentkonstruksjonene ved hjelp av digitale kalipre; Beregne tverrsnittsarealet av vevet.
  2. Løsne ligamentkonstruksjonen fra platen og plasser ankre iOmvendte støpte grep som sikrer at konstruksjonen er nedsenket i PBS.
  3. Juster avstanden mellom grepene, sett lengden på konstruksjonen til sin innledende lengde.
  4. Begynn testen: Stram konstruksjonen til feil ved en belastning på 0,4 mm / s (eller ~ 3% / s).
  5. Etter ferdigstillelse av testen, behandle vevrester for kollageninnhold (se avsnitt 7).
  6. Fra de resulterende belastningsdeformasjonsdataene, beregne stress-stamdata og kvantifisere mekaniske egenskaper av interesse; For eksempel maksimal strekkbelastning, maksimal strekkstyrke og modul ( dvs. elastisk egenskap over en lineær region av stress-belastningskurven).

7. Kvantifisering av kollageninnhold av konstruerte ligamenter

  1. Fjern konstruerte ledbånd fra borstet sementanker og tørk ved 120 ° C i 25 minutter.
  2. Bestem den tørre massen av konstruksjoner og plasser i individuelle 1,5 ml rør. Tørre konstruksjoner kan lagres ved romtemperaturTil videre behandling.
  3. Til hver konstruksjon tilsett 200 μl 6 M HC1. Kok ved 120 ° C i en oppvarmingsblokk i 2 timer i en avtrekksvifte.
    FORSIKTIG: HCl er sterkt etsende og surt, det anbefales å bruke kjelesikre / sikre låsrør eller andre metoder for sikring av rør.
  4. Sentrifuger rørene kort for å samle væske og la dem løsne for å fordampe ved 120 ° C i en oppvarmingsblokk i 1,5 timer i en avtrekksdeksel.
  5. Resuspender den resulterende pellet i 200 ul hydroksyprolin buffer. Oppbevares ved -20 ° C til behov.
    1. Forbered hydroksyprolin buffer. I 300 ml vann tilsettes 16,6 g sitronsyre, 4 ml eddiksyre, 11,4 g NaOH og rør til oppløsningen. PH til 6-6,5 og bring volum opp til 500 mL. Tilsett 250 μL toluen som konserveringsmiddel og lagre ved 4 ° C beskyttet mot lys.
  6. Klargjør reagenser.
    1. Forbered trans-4-hydroksy-L-prolin. Oppløs i vann for å lage en 4 mg / ml løsning.
      2. <Li> Klargjør kloramin-T. Oppløs i vann for å lage en 14,1 mg / ml løsning.
    2. Forbered aldehyd-perklorat. Oppløs 1,5 g 4-dimetylaminobenzaldehyd i 6 ml 1-propanol, 2,6 ml perklorsyre (FORSIKTIG: korrosiv, sterk oksidasjonsmiddel, bruk hensiktsmessige forholdsregler) og 0,5 ml vann.
  7. I et sett med nye 1,5 ml rør fortynnes en prøve av hver resuspendert pellet i hydroksyprolinbuffer til et volum på 200 ul.
    MERK: Fortynninger kan variere fra 1: 4 til 1:50 av prøven: buffer avhengig av det forventede kollageninnholdet i prøven; Det kan derfor være nødvendig med en prøve- og feilprøving for å bestemme en fortynningsfaktor som passer for det angitte utvalgssettet (dvs. plasser prøvene mot midten av standardkurven).
  8. Forbered hydroksyprolinestandarder. Fortynn hydroksyprolin i hydroksyprolinbuffer (se pkt. 7.5.1) til 80 μg / ml. Utfør serielle fortynninger for å gjøre 6-8 200 μL standarder mellom 0-20 μg / mL.
  9. Tilsett 150 μl 14,1 mg /Ml kloramin T oppløsning til hver standard og fortynnet prøve. Vortex og inkuber ved romtemperatur i 20 minutter.
  10. Tilsett 150 μL aldehyd-perkloratoppløsning til hver prøve og fortynnet prøve. Vortex og inkuber i en oppvarmingsblokk ved 60 ° C i 15 minutter. Kast overflødig aldehyd-perkloratoppløsning som farlig avfall i henhold til lokale bestemmelser (inneholder perklorsyre).
  11. La standardene og prøvene avkjøles før alikvotering av 200 μl av hver, i duplikat, til 96-brønnplater.
  12. Les plate ved 550 nm i et spektrofotometer. Kast platen og gjenværende volum i 1,5 ml rør som farlig avfall i henhold til lokale forskrifter (inneholder perklorsyre).
  13. Beregning av totalt kollagen og kollagenfraksjon.
    1. Konverter absorbansverdien for hver prøve til mikrogram av hydroksyprolin ved hjelp av hydroksyprolin standardkurven.
    2. Multipliser hver brønn med 2,5 for å beregne mengden av hydroksyprolin iDen fortynnede prøven. Husk at bare 200 av 500 μl totalblanding (200 μl fortynnet prøve + 150 μl kloramin T +150 μL AP-oppløsning) tilsettes til hver prøvebrønn.
    3. Multipliser med fortynningsfaktor (Seksjon 7.7) for å beregne mengden av hydroksyprolin i originalprøven.
    4. Del med 0,137 for å beregne mengden kollagen (antar at kollagen inneholder 13,7% hydroksyprolin 20 ).
      MERK: Mammalisk hydroksyprolin overflod i kollagen varierer litt over vev og pattedyrarter; For eksempel inneholder gris og får Achilles-sene 13,5 og 13,7% (hydroksyprolinmasse / tørrvevsmasse) henholdsvis 21 . Her bruker du 13,7% til å anslå prosent av hydroksyprolin i kollagen, som brukes til å beregne kollageninnholdet i en vevsprøve ved å bruke følgende ligning:
      Ligning 1
    5. Del av tørrmassen for å beregne kollagen fraCtion og konvertere til en prosentandel.
      Ligning 2

8. Kvantifisering av molekylære sluttpunkter

MERK: I tillegg til primære utfall av strekkprøving og kollageninnhold, kan molekylære endepunkter måles på 2D eller 3D-vev for å legge til mekanistisk innsikt. Bioassays kan brukes til å bestemme molekylære endepunkter (se følgende avsnitt nedenfor for konteksten Virkningen av serummiljøet etter øvelsen på in vitro- ligamentfunksjonen).

  1. For 3D-vev:
    1. Forbered konstruksjoner som i trinn 5 ovenfor.
    2. Etter konstruksjonsbehandling / -intervensjon, snap-fryse konstruksjoner i flytende nitrogen.
    3. Ved hjelp av en mørtel og pestle avkjølt på tørr is, grind konstruerer i et pulver. Fortsett ved trinn 8.4 / 5).
  2. For 2D vev:
    1. Kultur humant ACL fibroblaster til sammenflytelse i en myneOlayer i 6-brønnsplater inneholdende DMEM.
    2. Aspirer DMEM og bruk behandlingsmedier i henhold til eksperimentstrategien din ( f.eks . Tidskurs eller dosresponseksperimenter).
    3. Aspirer behandlingsmedier og vask celler med PBS.
    4. Skrape celler som skal samles ved hjelp av en passende ekstraksjonsbuffer / reagens (se neste).
  3. Proteinekspresjonsanalyse: Bruk en cytosolisk ekstraksjonsbuffer ( f.eks . 250 mM sukrose, 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM MgCl2 og protease / fosfataseinhibitor-cocktail) for å oppnå proteinlysater. Utfør proteinkonsentrasjonsanalyse og fortsett analyse i henhold til standard western blot-prosedyrer.
  4. Gene-ekspresjonsanalyse: Isoler totalt RNA ved bruk av 500 ul RNA-isolasjonsreagens i henhold til produsentens instruksjoner for å oppnå høy kvalitet RNA. Utfør revers-transkripsjon og sanntids kvantitativ PCR analyse i henhold til standard prosedyrer.
  5. DNA-isolasjon: Isoler og kvantifiser gEnomisk DNA ved bruk av DNA-isolasjonsreagens i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifiser DNA-konsentrasjon ved å bruke et spektrofotometer for å måle prøveabsorbansen ved 260 nm.

Representative Results

Oversikt over konstruert ligamentdannelse og eksperimentell inngrep

Figur 1 viser en oversikt over dannelsen av konstruerte ledbånd. Brushitt sement, et benutbyttemateriale 22, fremstilles ved å kombinere en ortofosforsyre / sitronsyreoppløsning med p-tricalciumfosfat i sylindriske brønner. Alternativt, hvis ikke direkte måling av mekanisk funksjon av vevene, kan 3-0 silke suturer brukes som ankre i dannelsen av et vev. Disse er festet 12 mm fra hverandre i silikonebelagte 35 mm tallerkener og steriliseres ved bløtlegging i 70% etanol. Fibroblaster isoleres fra fremre korsbåndsrester oppnådd under ACL-rekonstruksjonskirurgi. Etter ekspansjon innkapsles 2,5 x 10 5 celler i en fibringel dannet i borstet sement ankerpinne. Etter dannelse, ligament constrUcts kan undersøkes for endringer i mekaniske egenskaper, kollageninnhold, celleproliferasjon, genuttrykk, proteinnivåer og vevsmorfologi.

Gjennom hele kulturen samler cellene fibringelen og danner et lineært vev mellom de to ankre ( figur 2A ). Etter 1-2 dager i kultur, har cellene festet til fibringel, utvidede celleprosesser, og begynte å utøve trekkraftene ( figur 2B ). Da fibrin-gelen blir kontrahert av trekkraft og nedbrutt av cellulære enzymer, genereres spenning mellom de to ankerpunktene og cellene våre retter seg parallelt med denne aksen ( figur 2B ) og begynner å deponere kollagen. Etter 4-5 dager har konstruksjonene kommet seg rundt ankrene som danner et lineært sylindrisk vev ( figur 2A , på dette tidspunkt kan eksterne stimuli påføres systemet (intervjuEntion på denne tiden unngår å forstyrre den lineære vevdannelsesprosessen). Intervensjoner kan bestå i å supplere kulturmediet med humant eller dyre serum etter en gitt intervensjon, eksogene cytokiner og vekstfaktorer, ved hjelp av mekanisk stimulering eller endring av andre miljøfaktorer som oksygenspenning. Ved bruk av vekstmedier (DMEM med 10% FBS og 100 U / ml penicillin) tilsatt 200 μM askorbinsyre, 50 μM L-prolin og 5 ng / ml TGF-β1, har vi funnet ut at celleproliferasjon fortsetter gjennom en 2 ukers kultur Periode ( figur 2C ) og faktisk viser lysmikroskopi et tett vev som inneholder høyt justerte celler ved 14 dager med kultur ( figur 2B ).

Vurdering av konstruerte ledbånd

På slutten av kulturperioden kan manipulerte ledbånd vurderes i en variantY av måter. En stor fordel ved dette systemet er evnen til å bestemme funksjonelle endringer i vevet via mekanisk testing, en viktig vurdering gitt den mekaniske rollen som naturlig ligament. Uniaxial strekkprøving kan benyttes til å måle mekaniske egenskaper, inkludert belastning til svikt, maksimal strekkstyrke og Youngs modul. Viskoelastiske egenskaper kan også måles med stressavsla og kryp tester. Figur 3A viser et konstruert ligament som holdes i omvendte støpte grep i en spesialbygd uniaxial strekk tester. Det rette grepet er festet til en kraftgiver for å måle belastningen over ligamentet ettersom vevet er anstrengt for feil. Fig. 3B viser en representativ stresstrekningstest for en test til fiasko. Etter å ha gjennomgått mekanisk testing, kan de samme konstruksjonene tørkes og behandles for en hydroksyprolin-analyse 23 for å vurdere totalt kollageninnhold så vel som andre biokjemiskeMiske analyser. Med et tilstrekkelig antall ekstra prøver per tilstand, kan en grundig undersøkelse av en eksperimentell inngrep gjennomføres, inkludert dens effekter på celleproliferasjon, gen- og proteinuttrykk og histologisk morfologi. Mens 14 dager er et typisk sluttpunkt for våre studier, fortsetter de konstruerte leddbåndene i deres mekaniske egenskaper og kollageninnhold gjennom 28 dager med kultur som vist i figur 3C og kan overleve i minst 3 måneder i kultur 24 .

Donorvariabilitet er et viktig hensyn til eksperimentell repeterbarhet. Figur 4 viser et representativt eksperiment rapportert av Lee et al. 25 sammenligne 7 forskjellige ACL-donorer (n = 3 hann og n = 4 kvinner) som demonstrerer typiske strekkegenskaper og kollageninnhold etter en 2 ukers kultur i den tidligere beskrevne Supplerende vekstmedier. Ved bruk av celler fra lignende ACL-samlinger, alder av giver, tid etter skade, kjønn osv., Viser de konstruerte ligamenter lav variasjon mellom givere og lignende egenskaper mellom mannlige og kvinnelige donorer med unntak av forskjellen i kollagenfraksjon. I den nevnte studien ble manipulerte ledbånd brukt som en in vitro- modell for å undersøke hvorfor kvinner har en betydelig større risiko for ACL-skade enn menn, og demonstrert at ACL-fibroblaster isolert fra kvinnelige donorer ikke iboende danner svakere og mindre kollagenholdige konstruerte ledbånd 25 .

Virkningen av serummiljøet etter øvelsen på in vitro- ligamentfunksjonen

Vi har tidligere demonstrert muligheten for manipulerte ledbånd som skal brukes til å teste fysiologiske prosesser 1 ,Ss = "xref"> 25. I det følgende representative eksperiment som rapportert av West et al. 1 , bestemte vi de biokjemiske effektene av trening på ligamentfunksjon og markerte metodikken og funnene her. Vi dannet konstruerte ligamenter ved hjelp av humane ACL-celler og anvendt en intervensjon, på dag 7 av kulturen, bestående av kulturmedier konditionert med humant serum samlet pre- eller post-øvelse. Kort fortalt rekrutterte vi sunne unge mannlige deltakere og samlet inn blodprøver før og etter en akutt kamp mot motstandsøvelse som øker sirkulerende hormoner og cytokiner, inkludert humant veksthormon (GH). Humant serum ble isolert fra blodprøver før og etter utøve og brukt i stedet for føtalt bovint serum i kulturmediet for den andre uken med konstruert ligamentkultur ( Figur 5A ). Pre- og post-øvelses serumprøver ble analysert ved hjelp av ELISA for endringer i GH og insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1), denKonsentrasjon som kan endres ved trening ( figur 5B ). Denne informasjonen ble brukt til å korrelere serumeffekter på de konstruerte leddbåndene med endringer i serum som respons på trening. Etter en 14 dagers kulturperiode ble ligamentkonstruksjonene evaluert ved hjelp av mekanisk testing og en hydroksyprolinbestemmelse av kollageninnholdet og viste en signifikant økning i både maksimal strekkbelastning og kollageninnhold som svar på etterøvelsesserumet. I sikte på å vurdere om denne effekten var relatert til treningsinducerte utgivelser av GH eller IGF-1, ble konstruerte ligamenter dannet i et eget eksperiment og behandlet med en doserespons av enten human rekombinant GH eller IGF-1. Interessant, mens serum GH økte i blodet ( Figur 5B -i), økte ikke gradvis økningen av rekombinant GH-konsentrasjon i kulturmediet kollageninnholdet ( figur 5Di) eller mekaniskEgenskaper (data ikke vist) i konstruerte ligamenter. I motsetning til dette økte ikke serum-IGF-1-nivåene etter trening, men et dose-responsforsøk viste at økende nivåer i kulturmediene forbedret kollageninnholdet i ligamentkonstruksjoner ( figur 4D- iii). Således, mens øvelsen resulterte i robuste økning i GH etter utøvelse, danner det responsresponset som bruker rhGH tvil om GH er direkte ansvarlig for fenotypisk forbedring av de konstruerte ligamentene (i det minste gjør ikke 22 kDa isoformen alene Ser ut til å være ansvarlig). Omvendt, mens serum-IGF-1 ikke ble endret ved 15 min etterøvelse, viste testing av rhIGF-1 over et bredt spekter av konsentrasjoner at IGF-1 er i stand til å forbedre kollageninnholdet; Det bør imidlertid bemerkes at økende rhIGF-1 konsentrasjoner gjennom et område som anslår fysiologiske nivåer ikke økte kollageninnholdet signifikant. Dermed er den unike post-øvelsen serum enviroNment var viktig mot å forbedre mekanikken og kollagenet til konstruerte ledbånd.

I studien fremhevet her 1 var volumet av eksperimentelt serum begrenset på grunn av etiske hensyn; Så ble kortsiktige 2D bioassays, som hadde lavere serumkrav, brukt til ytterligere å sonde de molekylære mekanismene som var ansvarlige for økningen av kollagen som ble observert. ACL-fibroblaster ble dyrket til sammenflytning i 6-brønnsplater og behandlet i 1 time med hvile eller etterøvelsesserum, og sammenlignet med doseresponser av rekombinant GH, IGF-1, TGF-β1 og aktivering av mål i PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2 og Smad signalveier ble bestemt. I nærvær av serum etter utøvelse viste PI3K / mTORC1 og ERK1 / 2-bane større aktivering som bestemt ved fosforylering av henholdsvis S6K ( Figur 5D -i) og ERK1 / 2 ( Figur 5D- ii).Sammenlignet med hormon- og cytokindosresponsene, mens GH hadde en liten positiv effekt på mTOR-signalering ( Figur 5D -i) og IGF-1, viste en positiv effekt ved den laveste dosen, de tre behandlingene av GH, IGF-1 og TGF -P1 utgjorde ikke økningen i PI3K / mTORC1 og ERK1 / 2 signalering. Samlet sett antyder vår 3D-konstruerte ligamentmodell og 2D bioassay-data at serummiljøet etter utøvelse kan forbedre den mekaniske ligamentfunksjonen og kollageninnholdet ved aktivering av PI3K / mTORC1 og ERK1 / 2-banene.

I sammendraget, ved hjelp av en konstruert ligamentmodell kombinert med trenings-kondisjonert serum, kunne vi i) undersøke effekten av serummiljø etter utøvelse på konstruert ligamentfunksjon og kollagen, ii) korrelere endringer i ligamentfenotype med endringer i serumhormonkonsentrasjon, Med sikte på å bestemme hvilke endringer i serumet som førte til changEs i manipulerte leddbånd, og iii) videre arbeidets omfang ved å bruke 2D bioassays for å analysere molekylære mål i det serumbiokjemiske miljøet for å bestemme molekylære mekanismer som aktiveres av post-øvelsesserum som fører til forbedringer i ligamentfunksjonen.

Figur 1
Figur 1: Oversikt over dannelsen og bruken av konstruerte ledbånd. Brushite sementankere er produsert og festet til silikonbelagte plater. Primærfibroblaster isoleres og ekspanderes fra ACL-rester. Konstruerte ledbånd dannes ved innkapsling av fibroblaster i en fibringel rundt to borstet sementankre. Konstruerte ledbånd blir dyrket og behandlet med hvilken som helst spesifikk kjemisk eller mekanisk (for eksempel via en bioreaktor) stimuli som er ønsket. Ved ønsket sluttpunkt kan manipulerte ledbånd oppsamles og vurderes for mekanikkL egenskaper, genuttrykk, kollageninnhold, proteinuttrykk og histologi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2. Primære ligamentfibroblaster danner et fibrinbasert bein-til-ben-konstruert ligament som strekker seg over to borstet sementankre. ( A ) Over tid trekker fibroblastene fibringelen rundt borstitt sementanker som danner et lineært vev. ( B ) I de første tre dagene festes cellene til fibrin-gelen og utøver trekkraft, idet cellene tilpasses med konstruksens lange akse. Over 14 dager danner cellene et høyt justert vev. Skalestang = 160 μm. ( C ) DNA-innholdet i de konstruerte ligamentene fortsetter å øke oVer 14 dager i kultur som cellene proliferere. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD med n = 3-4 konstruksjoner per gruppe. grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Konstruerte ligamentmekaniske egenskaper og kollageninnhold forbedres over tid. ( A ) Ligamentkonstruksjoner testes ensaksikkert for å bestemme effekten av en gitt intervensjon på ligamentfunksjon. Som vist, holder to omvendte, 3D-trykte griper gjengjeld formade ankre som er brodd av den konstruerte senderen. Ankre er koblet til en stepper motor og kraftoverføreren for å generere stress / belastningskurver av testet vev, slik at mekaniske egenskaper kan bestemmes. ( B </ Strong>) Representativ stress-belastningskurve fra en konstruert ligament anstrenget til fiasko. I løpet av 28 dager, fortsetter C ( C ) maksimal strekkstyrke (UTS), ( D ) maksimal strekkbelastning (MTL), ( E ) Youngs modulus og ( F ) kollagenfraksjon. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD med n = 5 konstruksjoner per gruppe. * Indikerer signifikant forskjell fra alle andre grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Konstruerte ledbånd kan vurderes for funksjonalitet og biokjemisk innhold, som viser lav donorvariabilitet. Konstruerte ledbånd ble dannet 7 forskjellige donorer (n = 3 hann, n = 4 kvinnelige). Etter 2 uker oF-kultur, ble de vurdert for forskjeller i ( A ) maksimal strekkbelastning, ( B ) maksimal strekkfasthet (UTS), ( C ) Youngs modulus, ( D ) tverrsnittsareal (CSA), ( E ) totalt kollageninnhold per Konstruere, og ( F ) kollagen som en brøkdel av tørr masse. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD og statistisk signifikans var med Studentens t-test. * Indikerer signifikant forskjell fra andre grupper (p <0,05). Figur tilpasset fra Lee et al. 25 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5. Konstruerte leddbånd viser mekaniske og biokjemiske endringer som respons på bioloGiske inngrep. ( A ) Serum ble isolert fra bloddrakter samlet fra emner pre- (RestTx) og post-øvelse (ExTx) og brukes til å behandle manipulerte ledbånd i løpet av den andre uken av kulturen. ( B ) (i) Humant veksthormon (GH) og (ii) insulinlignende vekstfaktor (IGF) -1 nivåer i resten og øvelsesserum ble kvantifisert gjennom ELISA. ( C ) Konstruerte ledbånd behandlet med ExTx viste forbedret (i) kollageninnhold og (ii) maksimal strekkbelastning. Statistisk signifikans av parvise sammenligninger (RestTx og ExTx) ble analysert ved en t-test med signifikansnivå satt til p <0,05. ( D ) En dose-respons av (i) GH og (ii) IGF-1 ble brukt til å bestemme mulige bidrag av disse faktorene til endringene i kollageninnhold på grunn av ExTx. E) 2D bioassays ble brukt til å sammenligne effektene av økende doser av GH, RestTx og ExTx på molekylære signalmål som fosforyleringen av (i) S6K Thr389 og (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Statistisk sammenligning av mer enn to eksperimentelle grupper ble utført ved bruk av ANOVA og Tukey's HSD. Data presenteres som presentert som gjennomsnittlig ± SD. * Indikerer en signifikant forskjell fra kontroll (p <0,05) og § indikerer signifikant forskjell fra 150 ng / mL og 300 ng / ml IGF-1. Figur tilpasset fra West et al. 1 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Nåværende manuskript beskriver en modell av ligamentvev som er en nyttig eksperimentell plattform for etterforskere med et bredt spekter av forskningsemner, fra vevsutvikling til oversettelse / kliniske spørsmål. Den konstruerte ligamentmodellen beskrevet her er basert på en allsidig protokoll som kan tilpasses på ulike punkter gjennom arbeidsflyten ( Figur 1 og Diskusjonsseksjon ). Videre kan den iboende reduksjonstype av in vitro- miljøet bringes nærmere til det fysiologiske rike ved å supplere fodermedium med konditionert humant eller dyre serum.

Konstruksjoner kan dannes ved bruk av fibroblaster fra en rekke kilder
Mens metodologien og de representative resultatene vist her er basert på bruk av primære ACL-fibroblaster, kan cellisolasjonsprotokollen justeres for å samle andre typer primære fibroblaster. Som beskrevetI figur 4 viser konstruerte ligamenter dannet med primære celler isolert fra unge humane donorer lav donorvariabilitet. Primærceller er begrenset av innledende isolasjon og passasjerbegrensning; Bruken av cellelinjer kan forbedre reproduserbarheten av forsøkene. Bruken av andre celletyper kan kreve modifikasjoner i cellekulturmedium og fibringelformulering. For eksempel har vi observert at menneskelige mesenkymale stamceller (MSCs) ikke er i stand til å danne lineære vev mellom pensitt sementankre i løpet av 2 uker, mens equine overlegen digitale flexor tendon fibroblaster, equine benmarg stromal celler, kylling embryonale sene fibroblaster , Og murine C3H10T1 / 2 MSCs kontraherer raskt og fordøyer fibringelen for å danne et lineært vev (ikke offentliggjorte observasjoner). Denne kontrasten kan være en konsekvens av forskjeller i cellekontraktilitet, proliferasjon og fibrinolytisk enzymproduksjon.

Påføring av kjemikalierOg mekanisk stimulering
I fremgangsmåten beskrevet heri danner fibrinbasert vev rundt borstitt sementankre, som tillater påføring av mekanisk stimulering via en strekkbioreaktor 11 , samt for sluttpunktstesting. Tilstedeværelsen av borstet sement-mykt vev-grensesnitt (enthesis) gir også mulighet for videre undersøkelse og forbedring 22 , 26 (se avsnittet Klinisk bruk nedenfor). I dette in vitro- miljøet kan bidraget av kjemiske og mekaniske faktorer lettere identifiseres; Et eksempel på dette er vist i figur 5 , hvorved effekten av serummiljøet etter utøvelsen ble separert fra de mekaniske stimuli av trening. Pilotstudier kan være nødvendig for å bestemme tidsrammen for eksperimentelle inngrep, sammensetning av behandlinger og passende sluttpunkter for å forvente en observerbar forandring. foEksempelvis ble det i serumstudie 1 etter utøving begrenset av lengden av eksperimentell behandling ved tilførsel av serum som ble brukt til å supplere media, hvorfra konstruksjoner ble gitt hver annen dag. Videre ble kulturmediet i løpet av den andre uken av kulturen supplert med hvile eller etterøvelsesserum med ascorbinsyre og L-prolin opprettholdt mens TGF-β1 ble fjernet. TGF-β1 er en kjent profibrotisk vekstfaktor som øker i serum etter trening 27 . For å unngå å skjule TGF-β1-relaterte effekter av etterøvelsesserumet ble dette cytokinet ikke opprettholdt i kulturmediet.

Denne konstruerte ligamentmodellen kan også brukes til å teste effekten av mekanisk strekk. Ved å konstruere omvendte modellerte grep for å holde pensel sementankerendene (ligner den uniaxial strekkprøven som er vist i figur 1 ), kan strekke bioreaktorer være utformet for å imøtekomme eng Ineered ledbånd. Vårt laboratorium har tidligere brukt denne modellen til å undersøke molekylær signalrespons av konstruerte ledbånd til uniaxial strekkstreng i en skreddersydd bioreaktor 11 som vil gi en bedre forståelse for den rasjonelle utformingen av et in vitro- sträckeparadigma eller til og med potensielt in vivo Strekk / aktivitet / terapeutiske applikasjoner.

Vurdering av konstruerte ledbånd
Som med tradisjonell monolagskultur kan 3D-konstruksjoner analyseres for gen / proteinuttrykk; I tillegg gir deres 3D-morfologi muligheten til å vurdere funksjonelle og morfologiske endringer, og konstruksjoner kan opprettholdes i kultur for langsiktige studier ( Figur 3 ). Mens konstruerte ledbånd ikke er ekvivalente med native, modne leddbånd, bærer de likhet med å utvikle sener / ledbånd og oppfører seg på samme måte som nativt vev som svar på næringsstoffer"> 26, vekstfaktorer 10 , hormoner 25 og øvelse 11 , 28. Således, mens forsiktighet er berettiget før det gjøres brede generaliseringer fra en hvilken som helst in vitro- modell, kan resultater fra ligamentkonstruksjonstesting avsløre eller informere en bestemt fysiologisk mekanisme som ellers kan være Umulig å undersøke in vivo.

Tilleggsmedier med kondisjonert serum for en fleksibel og dynamisk modell med brede anvendelser
Det humane serummetabolom er et miljø med ~ 4500 forbindelser, inkludert, men ikke begrenset til, glykoproteiner, lipoproteiner, lipidderivater, energisubstrater, metabolitter, vitaminer, enzymer, hormoner, nevrotransmittere og en mengde byggeblokker / mellomprodukter. 29 Ytterligere inspeksjon av det humane serummetabolom ifølge forbindelsesklasser 29 avslører additiOnal fordeler ved å integrere eksperimentelt serum i in vitro eksperimenter. Det vil si at flertallet av de ~ 4500 forbindelsene i serum er hydrofobe eller lipid-avledet, understreker betydningen av bindende proteiner for transport / oppløseliggjøring. Det følger at eksperimentelt rekapitulerende endogen sammensatt transportdynamikk, og dermed biotilgjengelighet og sammensatte mål-interaksjoner, ville være nesten umulig. Således er eksperimentelt serum spesielt effektivt for studiet av forbindelser som er kjent for å avhenge av tilsetningsmolekyler for oppløsning, transport, målbinding og virkningsmekanisme.

Vårt laboratorium har langvarig interesse for helsemessige fordeler av trening. Øvelse forbedrer mobil- og orgelfunksjonen i en rekke vev gjennom hele kroppen 12 , en effekt som kan tilskrives en rekke faktorer (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 ,Eksosomer 16 , 17 ) som frigjøres i systemisk sirkulasjon. Det biokjemiske miljøet etter øvelsen reflekterer faktorer som frigjøres både fra kontraherende skjelettmuskulære treningsresponsive hormoner, samt faktorer som frigjøres som følge av sympatisk nervesystemstimulering av sekretoriske kirtler ( f.eks . Kortisol og katekolaminer fra binyrene 18 og vekst Hormon fra den fremre hypofysen 19 ). Vi har nylig brukt en modell av pre- og post-øvelses serum for å undersøke effekten av det treningsinducerte biokjemiske miljøet på manipulert vev. 1 Mens mange viktige oppgavespørsmål forblir, er modellen på ingen måte begrenset på denne måten. For eksempel kan serum oppnås, enten fra dyr eller mennesker, etter diett eller farmakologisk inngrep, eller fra forskjellige aldersgrupper eller klinisk populasjonS 30 . På denne måten vil eksogene eller endogene forbindelser av interesse være tilstede i serum og behandlingsmedier i biotilgjengelige mengder og vil samhandle med målvevet i samspill med det endogene miljøet ( dvs. i en mer fysiologisk sammenheng). Denne tilnærmingen er dynamisk siden det er høyst sannsynlig at en gitt intervensjon vil utøve en multi-organ (og multi-sammensatt) effekt, og dermed vil det fysiologiske miljøet bli kodifisert. Mens denne tilnærmingen gir visse utfordringer, siden flere systemiske biokjemiske variabler endres samtidig, er det en tilnærming som kan bidra til å overvinne ulemper med rent reduktivistisk eksperimentell metode 31 , 32 . Tillsammans kan implementering av betinget serum sammen med et vev-konstruert ( in vitro biomimetisk ) vev, brukes som et verktøy for fysiologi, ernæring og kliniske undersøkelsesspørsmål.

Vevsteknikkmodellen som presenteres her, kan brukes til å undersøke anatomiske og kliniske forskningsspørsmål som tradisjonelle in vitro- modeller ikke kan. Et ligament eller en senge in vivo inneholder en myk-til-hard vevsovergangsområde kalt enthesis. Innsatsen, som er sårbar for mekanisk stressrelatert skade 33 , kan studeres i tverrsnitt via histokemiske og elektronmikroskopiteknikker 22 , 26 . Dette unike grensesnittet er dobbelt viktig for de med lav eller begrenset mobilitet, siden fysisk inaktivitet forringer bindevevets evne til å overføre belastning til regioner med lav til høy overensstemmelse 34 , noe som resulterer i en generell reduksjon i vevsoverensstemmelse og økt skaderisiko.

Vårt laboratorium har nylig brukt denne vevsteknikkmodellen 25 </ Sup> å modellere en annen befolkning, kvinnelige idrettsutøvere, som er i fare for bindevevskader: forekomsten av ACL-skade er omtrent fem ganger større enn sine mannlige kolleger 35 . Potensielle mekanismer som ligger til grund for denne kjønnsbaserte ulempen ved skade ble undersøkt ved å behandle ligamentkonstruksjoner med fysiologiske konsentrasjoner av det kvinnelige kjønnshormonet, østrogen, i konsentrasjoner som etterliknet stadier av menstruasjonssyklusen. Interessant hindret høye konsentrasjoner av østrogen genuttrykk og aktivitet av lysloksidase, det primære enzymet som var ansvarlig for å skape lysin-lysin-kryssbindinger i kollagenmatrisen av ledbånd og sener. Det er viktig at 48 h høy østrogen (for å simulere follikulærfasen) reduserte ligamentkonstruksstivheten uten å endre kollagen tetthet av konstruksjonene. Fra et fysiologisk perspektiv antyder dette at økningen i ligamentslaksighet hos kvinner kan skyldes, i det minste delvis, å reduseresTverrbindingsdannelse. Fra et eksperimentelt perspektiv markerer disse funnene 25 nytten av 3D-konstruksjonsmodellen, som tillot funksjonell tverrbindingsaktivitet som skal undersøkes. Fra et klinisk perspektiv kan denne modellen nå brukes til å raskt skjerme for inngrep som kan forhindre de negative effektene av østrogen av ligamentfunksjon.

Avsluttende bemerkninger
Her har vi presentert en detaljert metodikk for dannelsen av konstruerte ledbånd og deres brukervennlighet som en 3D in vitro vevsmodell. Modellen er svært tilpassbar til et bredt spekter av mål, som gir fleksibilitet i celletype, intervensjoner og utfallsmålinger av interesse. Tilfylling av matemedia med kondisjonert serum legger til en fysiologisk kontekst som ikke kan oppnås i et tradisjonelt in vitro- miljø, og forbedrer modelleringen av in vivo fysiologi. Kort sagt, vi tror dette er en bredt anvendelig modusL med spennende implikasjoner for å fremme både fysiologi og vevsteknikk.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et NSERC postdoktoralt fellesskap (DWDW), en ARCS Foundation Scholarship (AL), og en UC Davis College of Biological Sciences grant (KB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 Entomoravia N/A For brushite cement anchors
β-tricalcium phosphate Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) N/A For brushite cement anchors
o-phosphoric acid, 85% (w/w) EMD Millipore PX0995 For brushite cement anchors
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500g For brushite cement anchors
Falcon 35 mm tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772A For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 4019862 For silicone-coated plates
1x Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific SH3002802 For cell isolation and expansion
100x antibiotic/antimycotic solution VWR 45000-616 For cell isolation
Type II collagenase Thermo Fisher Scientific 17101015 For cell isolation
100x penicillin/streptomycin solution Thermo Fisher Scientific 15140122 For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated EMD Millipore SCGP00525 For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine VWR 10-013-CV For cell and tissue culture
Fetal bovine serum BioSera FBS2000 Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt MP Biomedicals 0219453680 - 100 MU Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) VWR 82050-598 For cell culture
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282 For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 mL Fisher Scientific 367820 For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle Fisher Scientific 354221 For human serum collection
Thrombin, bovine origin Sigma-Aldrich T4648-1KU For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Fibrinogen, bovine origin Sigma-Aldrich F8630-5G For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A3428 For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
6-Aminohexanoic acid Sigma-Aldrich 07260-100g For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960-5G Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
L-proline Sigma-Aldrich P5607-25G Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
Transforming growth factor-β1 Peprotech 100-21 Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized EMD Millipore SCGPU02RE For reagent sterilization
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-212 Dilute in water to 6 M
4-Dimethylaminobenzaldehyde Sigma-Aldrich 39070-50g For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate Sigma-Aldrich 402869-100g For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline Sigma-Aldrich H54409-100g For hydroxyproline assay
1-propanol Sigma-Aldrich 279544-1L For hydroxyproline assay
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421-250ml For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial EMD Millipore AX0073-9 For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous Sigma-Aldrich 244511-1L For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-656 For hydroxyproline assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
  2. Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
  3. Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
  4. Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
  5. Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
  6. Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
  7. Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
  8. Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
  9. Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
  10. Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
  11. Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
  12. Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
  13. Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
  14. Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
  15. Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
  16. Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
  17. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).
  18. Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
  19. Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
  20. Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
  21. Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
  22. Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
  23. Woessner, J. F. Jr The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
  24. Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
  25. Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
  26. Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
  27. Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
  28. Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
  29. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
  30. Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
  31. Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
  32. Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists? J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
  33. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  34. Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
  35. Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).

Tags

Bioengineering utgave 124 vevsteknikk fremre korsbånd strekkprøving kollagen trening endogent biokjemisk miljø
Behandling av ligamentkonstruksjoner med treningskondensert serum: en translasjonell vævsteknikkmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D.… More

Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D. W. D. Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model. J. Vis. Exp. (124), e55339, doi:10.3791/55339 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter