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Bioengineering

Trattamento delle strutture ligamentali con serum esercitato-condizionato: un modello di ingegneria tessuto transazionale

doi: 10.3791/55339 Published: June 11, 2017

Summary

Presentiamo un modello di tessuto ligamentario in cui i trattamenti tridimensionali vengono trattati con il siero umano esercitato condizionato e analizzati per il contenuto di collagene, la funzione e la biochimica cellulare.

Abstract

Gli esperimenti in vitro sono essenziali per comprendere i meccanismi biologici; Tuttavia, il divario tra la cultura del tessuto monolayer e la fisiologia umana è grande e la traduzione dei risultati è spesso scarsa. Pertanto, vi sono ampie opportunità per approcci sperimentali alternativi. Qui presentiamo un approccio in cui le cellule umane sono isolate da residui di tessuto ligamentario crociato anteriore umano, estesi in coltura e utilizzati per formare legamenti ingegnerizzati. L'esercizio fisico altera l'ambiente biochimico nel sangue, in modo da migliorare la funzione di molti tessuti, organi e processi corporei. In questo esperimento, il substrato di coltura del legamento è stato completato con siero umano sperimentale che è stato "condizionato" dall'esercizio fisico. Quindi l'intervento è più biologicamente rilevante in quanto un tessuto sperimentale è esposto all'ambiente pieno biochimico endogeno, comprese le proteine ​​leganti e composti addizionali che possono essere alterati in tandem con l'attività di unAgente sconosciuto di interesse. Dopo il trattamento, i legamenti ingegnerizzati possono essere analizzati per la funzione meccanica, il contenuto di collagene, la morfologia e la biochimica cellulare. Nel complesso, ci sono quattro vantaggi principali rispetto alla cultura monolayer tradizionale e ai modelli animali, del modello fisiologico del tessuto del legamento qui presentato. Innanzitutto, i costrutti del legamento sono tridimensionali, consentendo di quantificare le proprietà meccaniche ( cioè la funzione) come lo sforzo di trazione finale, il carico massimo di trazione e il modulo. In secondo luogo, l'entità, l'interfaccia tra gli elementi di boney e sinew, può essere esaminata in dettaglio e all'interno del contesto funzionale. In terzo luogo, la preparazione di mezzi con il siero di post-esercizio consente di essere studiati in modo imparziale gli effetti dell'ambiente biochimico indotto dall'esercizio, che è responsabile della vasta gamma di benefici per la salute dell'esercizio fisico. Infine, questo modello sperimentale avanza la ricerca scientifica in modo umano ed etico sostituendo l 'uso diAnimali, un mandato fondamentale degli Istituti Nazionali di Salute, del Centro per il Controllo delle Malattie e della Food and Drug Administration.

Introduction

Tendone e lesioni del legamento sono comuni e possono avere effetti debilitanti sulla normale mobilità e qualità della vita. L'intervento chirurgico è spesso necessario, ma può avere successo limitato e variato 4 , 5 . L'attuale concezione di come tendini e legamenti si sviluppano, maturano e rispondono al pregiudizio sono incompleti e pertanto sono necessari modelli di ricerca efficaci per fornire un'idea dello sviluppo di trattamenti più efficaci 5 . Per affrontare questo divario di conoscenze, i modelli animali possono essere usati, ma gli studi in vivo sono intrinsecamente complessi con difficoltà nel controllo dell'ambiente e direttamente destinati ad interventi al tessuto previsto. Al contrario, l'ambiente sperimentale può essere facilmente controllato e monitorato in vitro con la tradizionale cultura cellulare monolayer. Tuttavia, questa tecnica può sovrapplicare l'ambiente chimico e meccanico e pertanto non può recapituareIn ritardo il comportamento in vivo delle cellule. L'ingegneria dei tessuti è in grado di sposare i vantaggi del complesso ambiente in vivo in modelli animali con il controllo dell'ambiente in vitro e fornisce uno strumento aggiuntivo per studiare la fisiologia. Inoltre, armato di una migliore comprensione dello sviluppo del legamento, l'ingegneria tissutale può anche fornire una fonte di tessuto dell'intestino quando è necessaria una ricostruzione chirurgica 6 . Quindi il metodo descritto qui convalida un tessuto 3D progettato in vitro che può essere utilizzato per studiare la funzione del legamento e la morfologia.

Strutture a tendine o legamenti a base di fibrina sono stati utilizzati come un modello in vitro per studiare processi fisiologici tra cui la fibrillogenesi 7 del collagene e lo sviluppo del tendine 8 , nonché le applicazioni di traslazione in cui la loro utilità come tessuto graft è stata valutata in un modello di pecora di anterior cruLa ricostruzione del legamento (ACL) 9 . Il nostro laboratorio ha stabilito in precedenza un modello di legamento modificato 3D, che comprende due pennuti, un materiale sostitutivo osseo di fosfato di calcio, ancoranti di cemento. Questo modello può essere sottoposto a diverse condizioni sperimentali semplicemente integrando il mezzo di coltura con fattori biologici 10 o applicando la stimolazione meccanica 11 . Importante, questo modello di legamento osso-osso permette l'analisi approfondita dell'entesi, l'interfaccia tra gli elementi di boney e di sinew, suscettibili di lesioni.

Nello studio evidenziato qui per presentare questa metodologia, siamo stati interessati all'effetto dei cambiamenti indotti dall'esercizio nell'ambiente biochimico sulla funzione del legamento. L'esercizio migliora la funzione cellulare e l'organo in una varietà di tessuti in tutto il corpo 2 , 3 , 12 , un effetto che può essere attribuito al rilascio di varie conosciute (ad es. IL-6 13 , IL-15 14 , 15 esotomi come meteorici, esosomi 16,17 ) e altri fattori bichimici sconosciuti rilasciati nella circolazione sistemica . Inoltre, l'ambiente biochimico post-esercizio è arricchito da ormoni reagenti all'esercizio fisico, il cui rilascio è stimolato dalla stimolazione simpatica del sistema nervoso delle ghiandole secretari ( ad es. , Cortisolo e catecolamine dalla ghiandola surrenale 18 e ormone della crescita dalla pituitaria anteriore 19 ). Tuttavia, in vivo , è impossibile differenziare gli effetti dello stimolo meccanico dell'esercizio da cambiamenti biochimici indotti dall'esercizio fisico. Mentre alcuni studi hanno caratterizzato l'aumento previsto di alcuni ormoni circolanti e citochine in risposta all'esercizioE come sopra accennato, ci sono troppi fattori, sia conosciuti che sconosciuti, per ricapitolare fedelmente in vitro. Cioè, isolare alcuni fattori per uno studio in vitro inadeguato indirizza la complessità della risposta biochimica. In questo studio abbiamo studiato come i cambiamenti nell'ambiente biochimico sierico, causati dall'esercizio fisico, influenzino la funzionalità del legamento ingegnerizzato. Per isolare gli effetti dei cambiamenti biochimici, abbiamo ottenuto il siero dai partecipanti umani prima e dopo un periodo di esercizio di resistenza e usato per trattare i legamenti 3D progettati formando fibroblasti umani crociati anteriori (ACL). Utilizzando questo modello, possiamo ottenere dati funzionali, inclusi effetti sulle proprietà meccaniche e sul contenuto di collagene, nonché quantificare gli effetti sulla segnalazione molecolare.

Protocol

Le seguenti procedure sono conformi ad un protocollo approvato dal Consiglio di revisione istituzionale dell'Università della California, Davis; Consultare il consiglio di etica locale prima di iniziare la ricerca.

1. Isolare i fibroblasti primari da residui ACL umani

NOTA: mantenere la sterilità e eseguire tutti i passaggi in un armadio di sicurezza biologico (BSC).

  1. Ottenere l'approvazione da parte del comitato di revisione etica appropriato per la raccolta e l'uso dei tessuti umani come descritto di seguito.
  2. Preparare la soluzione antibiotica / antimicotica 5x (ABAM) diluendo una soluzione antibiotica / antimicotica da 100x in soluzione salina fosfata tamponata (PBS)
  3. Raccogli i frammenti di tessuto ACL in soluzione ABX 5X in un tubo conico da 50 ml, conservare a 4 ° C fino alla fase di digestione. Tagliare il tessuto in frammenti più piccoli con una lama di rasoio se necessario ad una dimensione massima di 1 x 1 x 1 cm 3 .
    ATTENZIONE: attenersi alle normative biologiche locali perL'uso corretto del materiale biologico e la decontaminazione e lo smaltimento dei rifiuti biologici.
  4. Preparare un volume sufficiente di soluzione collagenasi per immergere i frammenti di tessuto. Sciogliere la collagenasi tipo II (1 mg / ml) in algato Dulbecco, mezzo modificato Eagle (DMEM) contenente 1x penicillina / streptomicina e 20% siero fetale bovino (FBS) e filtrare a 0,22 μm.
  5. Sciacquare il tessuto ACL 3 volte in PBS.
  6. Tessuto di digestione. Trasferire il tessuto ACL in un nuovo tubo conico da 50 mL e aggiungere un volume sufficiente di soluzione collagenasi per immergere il tessuto. Incubare a 37 ° C per una notte (~ 17 h).
  7. Prima di completare la durata della digestione, preparare i mezzi di crescita (GM) completando i supporti alti di glucosio DMEM con 10% FBS e 100 U / mL penicillina.
  8. 15 minuti prima che il tempo di digestione sia completato, brevemente vortice il tubo da 50 ml contenente tessuto 3 volte ogni 5 min.
  9. Utilizzando una pipetta serologica da 25 ml triturare il tessuto digerente in modo vigoroso per rompere il tiProseguire ulteriormente e dispiegare le cellule.
  10. Centrifugare a 1.500 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di GM.
  11. Ripetere i passaggi 1.8-1.9 ancora tre volte.
  12. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet in 5-10 ml di GM. Utilizzare un piccolo campione della sospensione cellulare per eseguire un conteggio delle cellule con un emocitometro e valutare la vitalità cellulare utilizzando Trypan Blue.
  13. Piattare la sospensione cellulare su piastre di coltura tissutale da 15 cm a una densità di 3-4 x 10 5 cellule per piastra.
  14. Cultura al confluenza del 70% in un incubatore sterile mantenuto a 37 ° C e 5% CO 2 , cambiando GM ogni tre giorni. Utilizzare o memorizzare le celle (vedere sotto) all'interno di 5 passaggi.
  15. Bloccare le cellule per uso futuro.
    1. Le cellule trypsinizzano alla confluenza del 70% come segue. Aspirare i supporti e lavare le cellule con PBS. Aggiungere abbastanza pre-riscaldato (37 ° C) 0,05% di trysina per coprire solo il fondo delle piastre di coltura tissutale. Place le piastre nel coltura incubAtor per ~ 5 minuti fino a quando le cellule sono staccate (verificare che le cellule galleggiano utilizzando un microscopio leggero). Usare una pipetta per raccogliere le celle e distribuire in un tubo Falcon.
    2. Centrifugare le cellule di pellet e risospendere le cellule in supporti alti di glucosio DMEM contenenti il ​​20% di FBS e il 10% di dimetilsolfossido (DMSO). La sospensione della cellula di aliquota in crioviali e raffreddare a -1 ° C / min per almeno 24 h. Conservare i cryovials congelati in azoto liquido.

2. Preparare piastre rivestite in silicone

  1. Preparare le piastre di coltura da 35 mm: rimuovere i coperchi e posare le piastre aperte su una superficie piana.
  2. Miscelare il kit di elastomero in silicone secondo le istruzioni del produttore.
  3. Usare una siringa da 10 ml per erogare circa 2 mL per piastra da 35 mm.
  4. Lasciare silicone a curare a temperatura ambiente per 2-3 giorni.

3. Preparare ancoraggi di cemento Brushite

  1. In anticipo, preparare silicone reverse-molds contenenti cilindrica noiLls per la formazione di ancoraggio. Le stampe inverse possono essere fatte alle specifiche della forma e della dimensione dell'ancora desiderata.
    1. Determinare l'altezza e il diametro desiderati dell'ancora finale. Questo protocollo utilizza uno stampo su misura realizzato in silicone artigianale in un piatto di coltura da 35 mm in cui sono stati collocati cilindri di plastica di diametro di circa 3,25 mm, consentendo un'altezza finale di stampo di circa 6,5 ​​mm. Le dimensioni dell'ancora finale sono di circa 3-3,5 mm di altezza e di circa 3,4 mm di diametro con pin da 1,5 mm sporgenti dal fondo dell'ancora.
    2. Aggiungere silicone indurito a un piatto da 35 mm in cui sarà realizzato lo stampo. Posizionare i cilindri in plastica di conseguenza.
      NOTA: La dimensione dei cilindri di plastica determinerà il diametro degli ancoraggi finali. Il posizionamento dei cilindri di plastica e la quantità di silicone utilizzati possono essere modificati per produrre ancore di diverse altezze. Lo spessore tra il fondo dei pozzetti dello stampo e il fondo dello stesso stampo dDeterminare quanto parte del perno possa sporgere dal fondo dell'ancoraggio permettendo all'ancora di essere successivamente fissato saldamente nel piatto rivestito in silicone.
    3. Dopo aver permesso al silicone di curarsi, rimuovere i cilindri di plastica e rimuovere lo stampo dal piatto da 35 mm.
  2. Preparare una soluzione di acido citrico acido ortofosforico / 100 mM da 3,5 M. Sciogliere 0,961 g di acido citrico in 11,5 ml di acido ortofosforico. Portare il volume della soluzione fino a 50 ml con acqua MilliQ. Conservare la soluzione a temperatura ambiente e proteggere dalla luce.
  3. Preparazione di stampi: Posizionare un perno di minuti in corrispondenza del centro di ciascun pozzetto cilindrico negli stampi.
  4. Combinare il fosfato β-tricalcium e l'acido ortofosforico / acido citrico ad una concentrazione di 1 g / ml in una barca di pesatura in plastica su ghiaccio.
  5. Mescolare il cemento vigorosamente utilizzando un raschiatore di celle di plastica.
  6. Triturare il cemento per continuare la miscelazione e la miscela pipetta nello stampo
  7. Centrifugare lo stampo pieno per 1 min a 2.250 x g.
  8. Lasciare che gli ancoraggi del cemento a spazzolino impostino a temperatura ambiente durante la notte.
  9. Rimuovere gli ancoraggi dallo stampo e fissare due ancore di 12 mm in ciascuna piastra rivestita in silicone.
  10. Sterilizzare le piastre appuntite spruzzando con il 70% di etanolo, riempiendo entrambe le piastre e coperchi e inserendo in un BSC. Dopo almeno 30 minuti, aspirare le piastre e sostituire i coperchi, conservando nella BSC fino a quando necessario.

4. Ottenere il siero umano

  1. Assicurarsi che sia stato ottenuto l'approvazione da parte del comitato di revisione etica appropriato per questo protocollo.
  2. Assicurarsi che il consenso informato scritto sia stato ottenuto da soggetti umani a partecipare ad un dato intervento ( ad es. Esercizio fisico, alimenti o interventi farmacologici) che provocherà le modifiche desiderate nel siero. Qui descriviamo la raccolta a riposo e 15 minuti dopo l'esercizio di resistenza.
  3. Usando un flebotomista addestrato, ottenere un campione di sangue di riposo da un partecipante venipunctura in un contenitore evacuato appropriato. Raccogliere un campione di sangue dopo l'esercizio 15 minuti dopo aver coinvolto i partecipanti nel protocollo di esercizio desiderato. Come descritto in precedenza 1 , utilizzare il protocollo di esercizi di resistenza in questo esperimento per stimolare una risposta biochimica endogena.
    1. I partecipanti devono eseguire cinque set di pressa per gambe con un minuto di riposo tra i set. Successivamente, i partecipanti eseguono una serie di estensioni del ginocchio e una serie di arricciature consecutivamente senza riposo e quindi ripetere gli esercizi di back-to-back tre volte con riposo di 1 min tra i set.
  4. Lasciare che il sangue possa coagulare prima di centrifugare a 1.500 xg per 10 minuti. In condizioni sterili, trasferire il siero in tubi sterili per un'ulteriore integrazione dei supporti (siero conservato a 4 ° C) e analisi biochimica (una piccola aliquota di siero conservata a -20 ° C).

5. Formare i legamenti progettati

NOTA: in anticipo, espandere il primario fiBroccare e preparare piastre in silicone con ancoraggi a spazzola appuntiti.

  1. Preparare reagenti:
    1. Preparare la trombina. Sciogliere la trombina bovina a 200 U / mL in supporti alti di glucosio DMEM. Filtrare a 0,22 μm, aliquota, e conservare a -20 ° C.
    2. Preparare fibrinogeno. Sciogliere il fibrinogeno bovino a 20 mg / mL in supporti alti di glucosio DMEM. Incubare per 3-4 h in un bagno d'acqua di 37 ° C, swirling ogni 30 minuti per aiutare la dissoluzione. Filtro a 0,22 μm (possono essere necessari più filtri), aliquota e conservare a -20 ° C.
    3. Preparare aprotinina. Sciogliere l'aprotinina in 10 mg / mL in acqua. Filtrare a 0,22 μm, aliquota, e conservare a -20 ° C.
    4. Preparare l'acido aminohexanoico. Sciogliere l'acido aminohexanoico a 0,1 g / ml in acqua. Filtrare a 0,22 μm, aliquota, e conservare a 4 ° C.
    5. Preparare l'acido ascorbico. Sciogliere l'acido ascorbico in supporti alti di glucosio DMEM ad una concentrazione di 50 mM. Filtro a 0,22 μm e conservare a 4 ° C.
    6. <Li> Preparare L-prolina. Sciogliere L-prolina in PBS a una concentrazione di 50 mM. Filtro a 0,22 μm e conservare a 4 ° C.
    7. Preparare il fattore di crescita della trasformazione-β1 (TGF-β1). Ricostituire TGF-β1 secondo le istruzioni del produttore ad una concentrazione di 10 μg / mL. Aliquota e conservare a -20 ° C.
  2. Determinare il numero di costrutti richiesti per l'esperimento e assicurare il numero sufficiente di lastre apposte. Si raccomandano sia repliche biologiche che tecniche. Nello studio 1 evidenziato qui, utilizzare repliche tecniche duplicate e 12 repliche biologiche (siero da 12 individui a riposo e dopo l'esercizio fisico).
    NOTA: Effettuare le seguenti operazioni in condizioni sterili in un BSC.
  3. Espandere le cellule coltivando in piatti da 15 cm al confluenza del 70%. Sono necessarie 2,5 x 10 celle per ogni costrutto.
  4. Trypsinizzare le cellule e risospendere in GM con una concentrazione di 3,67 x 105 cellule / ml.
  5. Generare un mix master per il numero di costrutti richiesti: Per 1 costrutto, il master mix contiene 681 μL di sospensione cellulare (contenente 2,5 x 10 5 cellule), 29 μL di trombina, 2 μL di aprotinina e 2 μl di acido aminoheico.
  6. Dopo aver mescolato bene il mix master, aggiungere 714 μL a ciascuna piastra fissata in un "modello 8" intorno agli ancoraggi di cemento brushite. Assicurarsi che il mix master abbia direttamente contatto con i lati degli ancoraggi.
  7. Toccare delicatamente ogni piastra per distribuire uniformemente il mix master attraverso la piastra.
  8. Per una piastrina alla volta, aggiungete rapidamente 286 μL di fibrinogeno in modo gocciolato uniformemente su una piastra e spingete immediatamente la piastra avanti e indietro e fianco a fianco sulla superficie della BSC per distribuire il fibrinogeno per formare i gel di fibrinio . Procedere alla piastra successiva.
  9. Posizionare i costrutti in un incubatore sterile mantenuto a 37 ° C e 5% CO 2 e incubarePer almeno 15 minuti per consentire la polimerizzazione del fibrinogeno.
  10. Preparare un supporto sufficiente (FM) per 2 ml per ogni costrutto. Supplemento GM con acido ascorbico 200 μM, 50 μM proline e 5 ng / mL TGF-β1.
  11. Aggiungere 2 mL FM per coprire ogni costrutto. Coltivare i costrutti in un incubatore sterile mantenuto a 37 ° C e 5% CO 2 per un totale di 14 giorni o all'estremità desiderata, rinfrescando il supporto ogni secondo giorno con 2 mL FM

6. Tensostrutture

NOTA: Il test di trazione è stato eseguito usando un tester di trazione su misura in un bagno PBS; Le apposite manopole stampate invertite che sono accoppiate al trasduttore di forza fissano ancoraggi di cemento spazzolato durante la prova.

  1. Determinare la lunghezza e la larghezza dei costrutti del legamento utilizzando pinze digitali; Calcolare la sezione trasversale del tessuto.
  2. Disimpegnare il legamento dal piatto e posizionare gli ancoraggi nellaImpugnature retromarcia, assicurando che il costrutto sia sommerso in PBS.
  3. Regolare la distanza tra le impugnature, impostando la lunghezza del costrutto alla sua lunghezza iniziale.
  4. Iniziare la prova: strappare il costrutto al guasto ad una velocità di deformazione di 0,4 mm / s (o ~ 3% / s).
  5. Dopo il completamento del test, elaborare i residui tissutali per il contenuto di collagene (vedere la sezione 7).
  6. Dai dati di carico-deformazione risultanti, calcolare i dati di stress-strain e quantificare le proprietà meccaniche di interesse; Ad esempio, il carico massimo di trazione, la resistenza alla trazione e il modulo ( vale a dire , proprietà elastiche su una regione lineare della curva di stress-strain).

7. Quantificazione del contenuto di collagene di legamenti progettati

  1. Togliere i legamenti progettati dagli ancoraggi di cemento brushite e asciugare a 120 ° C per 25 min.
  2. Determinare la massa secca dei costrutti e collocare in singoli tubi da 1,5 ml. I costrutti secchi possono essere conservati a temperatura ambienteFino all'ulteriore elaborazione.
  3. Ad ogni costrutto aggiungere 200 μl di 6 M HCl. Fare bollire a 120 ° C in un blocco di riscaldamento per 2 ore in una cappa di fumo.
    ATTENZIONE: l'HCl è altamente corrosivo e acido, si raccomanda l'uso di tubi a prova di ebollizione o di altri sistemi di fissaggio dei tubi.
  4. Centrifugare brevemente i tubi per raccogliere liquidi e lasciarli incaptati per evaporare a 120 ° C in un blocco di riscaldamento per 1,5 h in una cappa di fumo.
  5. Resuspendere il pellet risultante in 200 μl di idrossiprolina. Conservare a -20 ° C fino a quando necessario.
    1. Preparare il tampone idrossiprolina. In 300 ml di acqua, aggiungere 16,6 g di acido citrico, 4 ml di acido acetico, 11,4 g di NaOH e mescolare fino a dissolvere. PH a 6-6,5 e portare volume fino a 500 ml. Aggiungere 250 μl di toluene come conservante e conservare a 4 ° C protetto dalla luce.
  6. Preparare reagenti.
    1. Preparare la trans-4-idrossi-L-prolina. Sciogliere in acqua per ottenere una soluzione da 4 mg / ml.
    2. <Li> Preparare la cloramina-T. Sciogliere in acqua per ottenere una soluzione di 14,1 mg / mL.
    3. Preparare l'aldeide-perclorato. Sciogliere 1,5 g di 4-dimetilammobenzaldehide in 6 ml di 1-propanolo, 2,6 ml di acido perclorico (ATTENZIONE: corrosivo, forte ossidante, usare opportune precauzioni) e 0,5 ml di acqua.
  7. In un set di nuovi tubi da 1,5 ml, diluire un campione di ciascun pellet resuspendato in idrossiprolina fino a un volume di 200 μL.
    NOTA: Le diluizioni possono variare da 1: 4 a 1:50 di campione: tampone a seconda del contenuto di collagene atteso del campione; Quindi alcuni test di prova e errore possono essere necessari per determinare un fattore di diluizione appropriato per il set di campioni dato (ad esempio, posizionare i campioni verso la metà della curva standard).
  8. Preparare gli standard idrossiprolici. Diluire l'idrossiprolina nel tampone idrossiprolina (vedere sezione 7.5.1) a 80 μg / mL. Eseguire le diluizioni seriali per produrre 6-8 200 μL di standard tra 0-20 μg / mL.
  9. Aggiungere 150 μL 14,1 mg /ML di cloramina T ad ogni campione standard e diluito. Vortex e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  10. Aggiungere a ciascun campione e campione diluito 150 μL di aldeide-perclorato. Vortex e incubare in un blocco di riscaldamento a 60 ° C per 15 minuti. Smaltire la soluzione di aldeide-perchlorato in eccesso come rifiuto pericoloso secondo le normative locali (contiene acido perclorico).
  11. Lasciare raffreddare gli standard ei campioni prima di aliquotare 200 μL di ciascuno, in duplicato, in piastre a 96 pozzetti.
  12. Leggere la lastra a 550 nm in uno spettrofotometro. Smaltire la piastra e il volume residuo in tubi da 1,5 ml come rifiuti pericolosi secondo le normative locali (contiene acido perclorico).
  13. Calcolo della frazione totale del collagene e del collagene.
    1. Convertire il valore di assorbanza per ogni campione a microgrammi di idrossiprolina usando la curva standard di idrossiprolina.
    2. Moltiplica ogni pozzetto di 2,5 per calcolare la quantità di idrossiprolina inIl campione diluito. Ricordiamo che ad ogni pozzetto di campione viene aggiunto solo 200 di 500 μL di miscela totale (200 μL di campione diluito + 150 μL di cloroammina T +150 μL di soluzione AP).
    3. Moltiplicare per fattore di diluizione (Sezione 7.7) per calcolare la quantità di idrossiprolina nel campione originale.
    4. Divide per 0,137 per calcolare la quantità di collagene (presuppone che il collagene contiene 13,7% di idrossiprolina 20 ).
      NOTA: L'abbondanza di idrossiprolina di mammiferi nel collagene varia leggermente tra i tessuti e le specie di mammiferi; Per esempio, il tendine di Achille di maiale e pecora contiene 13,5 e 13,7% (massa di idrossiprolina / massa secca), rispettivamente 21 . In questo caso, utilizzare il 13,7% per stimare la percentuale di idrossiprolina nel collagene, che viene utilizzato per calcolare il contenuto di collagene di un campione di tessuto utilizzando la seguente equazione:
      Equazione 1
    5. Dividere per la massa secca per calcolare il collagene fraE convertirà in una percentuale.
      Equazione 2

8. Quantificazione degli endpoint molecolari

NOTA: Oltre agli esiti primari del test di trazione e del contenuto di collagene, gli endpoint molecolari possono essere misurati su tessuti 2D o 3D per aggiungere una comprensione meccanica. I bioassay possono essere utilizzati per determinare gli endpoint molecolari (si veda la seguente sezione sotto per il contesto L'impatto dell'ambiente serico dopo l'esercizio sulla funzione ligamentaria in vitro ).

  1. Per il tessuto 3D:
    1. Preparare i costrutti come indicato al punto 5 sopra.
    2. Dopo la costruzione di un trattamento / intervento, i conglomerati a congelamento in azoto liquido.
    3. Utilizzando un mortaio e un pestello raffreddato su ghiaccio secco, la macina costruisce in una polvere. Continuare al punto 8.4 / 5).
  2. Per il tessuto 2D:
    1. Coltivare fibroblasti umani ACL per confluire in un monOlayer in piastre a sei pozzetti contenenti DMEM.
    2. Aspirare il DMEM e applicare i mezzi di trattamento secondo la tua strategia di sperimentazione ( ad es. , Corsi di tempo o esperimenti di risposta dose).
    3. Aspirare i supporti di trattamento e lavare le cellule con PBS.
    4. Bloccare le celle da raccogliere usando un appropriato tampone di estrazione / reagente (vedi successivo).
  3. Analisi delle espressioni proteiche: utilizzare un tampone di estrazione citosolica ( ad es. , 250 mM saccarosio, 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM MgCl2 e cocktail inibitore proteasi / fosfatasi) per ottenere lisati proteici. Eseguire il test di concentrazione della proteina e continuare l'analisi secondo le procedure standard di blot western.
  4. Analisi della espressione di geni: Isolare il RNA totale usando reagenti di isolamento RNA da 500 μL secondo le istruzioni del produttore per ottenere RNA di alta qualità. Esegue analisi quantitativa PCR a trascrizione inversa e in tempo reale secondo procedure standard.
  5. Isolamento del DNA: Isolare e quantificare gDNA enomico utilizzando il reagente di isolamento del DNA secondo le istruzioni del produttore. Quantificare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza del campione a 260 nm.

Representative Results

Panoramica della formazione del legamento e degli interventi sperimentali

La figura 1 mostra una panoramica della formazione di legamenti progettati. Il cemento brushite, un materiale sostitutivo osseo 22, viene preparato combinando una soluzione di acido ortofosforico / acido citrico con il fosfato β-tricalcico nei pozzetti cilindrici. In alternativa, se non direttamente misurando la funzione meccanica dei tessuti, suture di seta da 3-0 possono essere utilizzate come ancoraggi nella formazione di un tessuto. Questi sono apposti a 12 mm in piastre di 35 mm rivestiti in silicone e sterilizzati con l'aggiunta di etanolo al 70%. I fibroblasti sono isolati da residui di legamento cruciali anteriori ottenuti durante la chirurgia di ricostruzione ACL. Dopo l'espansione, 2,5 x 10 5 cellule sono incapsulate in un gel di fibrina formato nel piatto ancorato a cemento spazzolato. Dopo la formazione, legamento constrPossono essere esaminati per cambiamenti nelle proprietà meccaniche, contenuto di collagene, proliferazione cellulare, espressione genica, livelli proteici e morfologia tissutale.

Durante la cultura, le cellule contraggono il gel di fibrina e formano un tessuto lineare tra i due ancoraggi ( Figura 2A ). Dopo 1-2 giorni di coltura, le cellule hanno attaccato al gel di fibrina, processi di cellule estese e hanno cominciato a esercitare forze di trazione ( figura 2B ). Poiché il gel fibrinico è contratto da forze di trazione e suddiviso per enzimi cellulari, viene generata una tensione tra i due punti di ancoraggio e le nostre cellule allineano parallelo a questo asse ( Figura 2B ) e cominciano a depositare il collagene. Dopo 4-5 giorni, i costrutti si sono contratti intorno agli ancoraggi che formano un tessuto cilindrico lineare ( figura 2A , a questo punto stimoli esterni possono essere applicati al sistema (intervEntion in questo momento evita di interrompere il processo di formazione dei tessuti lineari). Gli interventi possono consistere nel completamento del mezzo di coltura con siero umano o animale dopo un dato intervento, citochine esogene e fattori di crescita, impiegando stimolazione meccanica o cambiando altri fattori ambientali come la tensione dell'ossigeno. Utilizzando mezzi di crescita (DMEM con 10% FBS e 100 U / mL penicillina) integrati con acido ascorbico 200 μM, 50 μM L-prolina e 5 ng / mL TGF-β1, abbiamo determinato che la proliferazione cellulare continua per tutta una cultura di 2 settimane Infatti, la microscopia leggera rivela un tessuto densa contenente cellule altamente allineate a 14 giorni di coltura ( Figura 2B ).

Valutazione dei legamenti ingegnerizzati

Alla fine del periodo di coltura, i legamenti progettati possono essere valutati in una varietàY di modi. Un importante vantaggio di questo sistema è la capacità di determinare le modifiche funzionali al tessuto attraverso test meccanici, una valutazione vitale data il ruolo meccanico del legamento nativo. Il test di trazione uniaxial può essere utilizzato per misurare le proprietà meccaniche, compreso il carico all'insufficienza, la resistenza alla trazione e il modulo Young. Le proprietà viscoelastiche possono anche essere misurate con il rilassamento dello stress e le prove di creep. La figura 3A illustra un legamento costruito in appositi manicotti stampati in un tester a trazione uniaxial su misura. La presa giusta è attaccata ad un trasduttore di forza per misurare il carico attraverso il legamento in quanto il tessuto è teso al guasto. La figura 3B mostra una trama rappresentativa dello stress-strain per una prova di guasto. Dopo essere stati sottoposti a prove meccaniche, gli stessi costrutti possono essere essiccati e trattati per un test di idrossiprolina 23 per valutare il contenuto totale del collagene e altri biocheSaggi micali. Con un numero sufficiente di campioni aggiuntivi per condizione, può essere condotto un approfondito esame di un intervento sperimentale, inclusi i suoi effetti sulla proliferazione cellulare, sull'espressione di geni e proteine ​​e sulla morfologia istologica. Mentre 14 giorni è un endpoint tipico per i nostri studi, i legamenti ingegneristici continuano a migliorare nelle loro proprietà meccaniche e nel contenuto di collagene attraverso 28 giorni di coltura come mostrato nella Figura 3C e possono sopravvivere per almeno 3 mesi nella cultura 24 .

La variabilità dei donatori è una considerazione importante per la ripetibilità sperimentale. La figura 4 mostra un esperimento rappresentativo riportato da Lee et al. 25 confrontando 7 donatori ACL diversi (n = 3 maschi e n = 4 femmine) che dimostrano caratteristiche tipiche di tensione e contenuto di collagene dopo una cultura di 2 settimane nelle precedenti Mezzi di crescita integrati. Utilizzando le cellule da raccolte ACL simili, l'età del donatore, il tempo dopo lesioni, il sesso, ecc., I legamenti progettati dimostrano una scarsa variabilità tra donatori e caratteristiche simili tra donatori maschi e femmine, ad eccezione della differenza nella frazione di collagene. Nello studio sopra citato, i legamenti ingegnerizzati sono stati utilizzati come un modello in vitro per indagare perchè le donne presentano un rischio significativamente maggiore di lesioni ACL rispetto agli uomini e hanno dimostrato che i fibroblasti ACL isolati dai donatori femminili non formano intrinsecamente legamenti ingegnerizzati meno collagene 25 .

L'impatto dell'ambiente serico dopo l'esercizio sulla funzionalità del legamento in vitro

Abbiamo dimostrato in precedenza la capacità dei legamenti ingegnerizzati di sondare i processi fisiologici 1 ,Ss = "xref"> 25. Nel seguente esperimento rappresentativo riportato da West et al. 1 , abbiamo determinato gli effetti biochimici dell'esercizio sulla funzione del legamento e mettere in evidenza la metodologia ei risultati qui. Abbiamo formato legamenti ingegnerizzati utilizzando cellule ACL umane e applicato un intervento, al giorno 7 della cultura, costituito da supporti di coltura condizionati con siero umano raccolti prima o dopo l'esercizio fisico. In breve, abbiamo reclutato giovani partecipanti maschii sani e raccoglievano campioni di sangue prima e dopo un esercizio acuto di esercizi di resistenza che aumenta gli ormoni circolanti e le citochine tra cui l'ormone della crescita umana (GH). Il siero umano è stato isolato dai campioni di sangue pre- e post-esercizio e utilizzato in sostituzione del siero fetale fetale nel mezzo di coltura per la seconda settimana di coltura del legamento progettato ( figura 5A ). I campioni di siero pre- e post-esercizio sono stati analizzati usando ELISA per cambiamenti nel GH e fattore di crescita 1 (IGF-1) come l'insulinaLa cui concentrazione può essere alterata dall'esercizio ( figura 5B ). Queste informazioni sono state utilizzate per correlare gli effetti del siero sui legamenti progettati con cambiamenti nel siero in risposta all'esercizio fisico. Dopo un periodo di coltura di 14 giorni, i costrutti del legamento sono stati valutati usando test meccanici e determinazione di idrossisprolina del contenuto di collagene e hanno dimostrato un significativo aumento sia del carico massimo di trazione che del contenuto di collagene in risposta al siero post-esercizio. Allo scopo di valutare se questo effetto fosse correlato a emissioni indotte da GH o IGF-1, i legamenti ingegnerizzati sono stati formati in un esperimento separato e trattati con una risposta dose di GH o IGF-1 ricombinante umano. È interessante notare che, mentre il siero GH aumentava nel sangue ( Figura 5B -i), aumentando progressivamente la concentrazione ricombinante di GH nei campioni di coltura non aumentava il contenuto di collagene ( Figura 5D -i)Proprietà (dati non mostrati) in legamenti progettati. Al contrario, i livelli di siero IGF-1 non aumentano dopo l'esercizio, ma un esperimento di risposta dose ha rivelato che i livelli crescenti nei supporti di coltura migliorarono il contenuto di collagene dei costrutti di legamento ( Figura 4D -ii). Così, mentre l'esercizio ha portato ad un forte aumento dell'attività post-esercizio GH, l'esperimento di dose-risposta usando rhGH solleva dubbi sul fatto che GH sia direttamente responsabile della valorizzazione fenotipica dei legamenti ingegnerizzati (almeno l'isoforma 22 kDa da solo Sembrano essere responsabili). Viceversa, mentre il siero IGF-1 non è stato alterato a 15 minuti dopo l'esercizio, il test rhIGF-1 su una vasta gamma di concentrazioni ha rivelato che IGF-1 è in grado di migliorare il contenuto di collagene; Tuttavia, va notato che aumentando le concentrazioni di rhIGF-1 attraverso un intervallo che i livelli stimati fisiologici non aumentano significativamente il contenuto di collagene. Quindi, l'unico enviro del siero post-esercizioNm era importante per migliorare la meccanica e il collagene dei legamenti ingegnerizzati.

Nello studio evidenziato qui 1 , il volume del siero sperimentale era limitato a causa di considerazioni etiche; Quindi, i bioassay a breve termine a 2D, che avevano esigenze più basse del siero, sono state utilizzate per sondare ulteriormente i meccanismi molecolari responsabili dell'aumento del collagene osservato. I fibroblasti ACL sono stati coltivati ​​a confluenza in piastre a 6 pozzetti e trattati per 1 ora con riposo o dopo l'esercizio siero e confrontati con le reazioni di dose di GH ricombinante, IGF-1, TGF-β1 e l'attivazione di bersagli nel PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2 e Smad sono stati determinati. In presenza di un siero post-esercizio, il percorso PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2 ha mostrato una maggiore attivazione stimata dalla fosforilazione di S6K ( Figura 5D -i) e ERK1 / 2 ( Figura 5D -ii) rispettivamente.Rispetto alle risposte della dose di ormone e della citocina, mentre GH ha avuto un piccolo effetto positivo sulla segnalazione mTOR ( Figura 5D -i) e IGF-1 ha mostrato un effetto positivo alla dose più bassa, i tre trattamenti di GH, IGF-1 e TGF -β1 non ha rappresentato l'aumento del segnale PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2. Considerati insieme, il nostro modello di legamento 3D e 2D bioassay suggeriscono che l'ambiente di siero dopo l'esercizio è in grado di migliorare la funzionalità del legamento e il contenuto di collagene mediante l'attivazione dei percorsi PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2.

In sintesi, utilizzando un modello di legamento ingegneristico combinato con un siero esercitato con condizionamento, siamo riusciti a i) studiare l'effetto dell'ambiente di siero dopo l'esercizio sulla funzione del legamento e del collagene ingegneristico, ii) correlare le variazioni nel fenotipo del legamento con le concentrazioni dell'ormone serico, Con l'obiettivo di determinare quali cambiamenti nel siero hanno portato a changIii) aggiustare l'ambito del lavoro utilizzando bio-analisi 2D per sondare obiettivi molecolari del milieu biochimico serico per determinare meccanismi molecolari che sono attivati ​​da post-esercizio serum che portano a miglioramenti nella funzione del legamento.

Figura 1
Figura 1: Panoramica della formazione e utilizzo dei legamenti progettati. Gli ancoraggi di cemento Brushite sono fabbricati e fissati in piastre rivestite con silicone. I fibroblasti primari sono isolati ed espansi dai residui ACL. I legamenti progettati sono formati mediante incapsulamento dei fibroblasti in un gel di fibrina attorno a due ancoranti di cemento brushite. I legamenti progettati vengono coltivati ​​e trattati con qualsiasi stimolo chimico o meccanico specifico ( ad esempio , tramite un bioreattore) desiderato. Al punto finale desiderato, i legamenti progettati possono essere raccolti e valutati per meccanicaL proprietà, espressione genica, contenuto di collagene, espressione proteica e istologia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. I fibroblasti del legamento primario costituiscono un legamento artificiale osso-osso basato su fibrina che comprende due ancoranti di cemento brushite. ( A ) Nel tempo, i fibroblasti contrappongono il gel di fibrina intorno agli ancoraggi di cemento brushite che formano un tessuto lineare. Nei primi tre giorni le cellule si collegano al gel di fibrina e esercitano forze di trazione, allineando le cellule con l'asse lungo del costrutto. Oltre 14 giorni, le cellule formano un tessuto altamente allineato. Barra di scala = 160 μm. ( C ) Il contenuto del DNA dei legamenti progettati continua ad aumentare oVer 14 giorni nella cultura come le cellule proliferano. I dati sono presentati come media ± SD con n = 3-4 costruzioni per gruppo. gruppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Le proprietà meccaniche del legamento e del collagene sono migliorate nel tempo. ( A ) I costrutti del legamento sono testati in modo uniaxially tensile per determinare l'effetto di un dato intervento sulla funzione del legamento. Come mostrato, due impugnature stampate in rilievo, stampate in rilievo, sono dotate di ancore a forma di reciprocità, che sono colmate dal sinistro progettato. Gli ancoraggi sono accoppiati ad un motore passo-passo e trasduttore di forza per generare curve stress / tensione del tessuto testato, consentendo di determinare proprietà meccaniche. ( B </ Strong>) Rappresentante curva di stress-strain da un legamento ingegnerizzato teso al fallimento. Nel corso di 28 giorni, la resistenza alla trazione massima (UTS), ( D ) il carico massimo di trazione (MTL), ( E ) il modulo Young e la frazionazione di collagene continuano a migliorare. I dati sono presentati come media ± SD con n = 5 costruzioni per gruppo. * Indica una differenza significativa da tutti gli altri gruppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: I legamenti progettati possono essere valutati per funzionalità e contenuto biochimico, mostrando una scarsa variabilità dei donatori. I legamenti progettati sono stati formati 7 donatori diversi (n = 3 maschi, n = 4 femmine). Dopo 2 settimane o( C ), ( D ) area trasversale (CSA), ( E ) contenuto totale di collagene per Costruire, e ( F ) collagene come una frazione di massa secca. I dati sono presentati come media ± SD e la significatività statistica è stata con il t-test di Student. * Indica una differenza significativa da altri gruppi (p <0,05). Figura adattata da Lee et al. 25 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. I legamenti progettati dimostrano cambiamenti meccanici e biochimici in risposta al bioloGli interventi gicali. ( A ) Il siero è stato isolato dai raccolti di sangue raccolti da soggetti pre- (RestTx) e post-esercizio (ExTx) e usato per trattare i legamenti ingegnerizzati durante la seconda settimana di cultura. ( B ) (i) L'ormone della crescita umana (GH) e (ii) i livelli di fattore di crescita dell'insulina (IGF) -1 nel resto e nel siero di esercizio sono stati quantificati mediante ELISA. ( C ) I legamenti progettati trattati con ExTx hanno dimostrato un miglioramento (i) del contenuto di collagene e (ii) il carico massimo di trazione. La significatività statistica dei confronti accoppiati (RestTx e ExTx) è stata analizzata mediante un t-test con livello di significato impostato a p <0,05. ( D ) Una risposta dose-risposta di (i) GH e (ii) IGF-1 è stata utilizzata per determinare i possibili contributi di questi fattori ai cambiamenti nel contenuto di collagene dovuti a ExTx. E) I bioassays 2D sono stati utilizzati per confrontare gli effetti di dosi crescenti di GH, RestTx e ExTx su obiettivi di segnalazione molecolare come la fosforilazione di (i) S6K Thr389 e (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Il confronto statistico di più di due gruppi sperimentali è stato eseguito utilizzando l'AND e l'HSD di Tukey. I dati sono presentati come presentati come media ± SD. * Indica una differenza significativa dal controllo (p <0,05) e § indica differenza significativa da 150 ng / mL e 300 ng / mL IGF-1. Figura adattata da West et al. 1 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il presente manoscritto descrive un modello di tessuto del legamento che è una utile piattaforma sperimentale per gli investigatori con un ampio spettro di argomenti di ricerca, dal sviluppo del tessuto alle questioni di traduzione / clinica. Il modello di legamento progettato qui descritto si basa su un protocollo versatile che può essere adattato in vari punti durante il flusso di lavoro ( figura 1 e sezione discussione ). Inoltre, la natura intrinsecamente riduzionistica dell'ambiente in vitro può essere avvicinata al reame fisiologico integrando i supporti di alimentazione con siero umano o animale condizionato.

I costrutti possono essere formati utilizzando fibroblasti provenienti da una varietà di fonti
Mentre la metodologia ei risultati rappresentativi mostrati qui si basano sull'utilizzo di fibroblasti ACL primari, il protocollo di isolamento cellulare può essere regolato per la raccolta di altri tipi di fibroblasti primari. Come descrittoNella figura 4 , i legamenti progettati con cellule primarie isolati da giovani donatori umani mostrano una scarsa variabilità dei donatori. Le cellule primarie sono limitate dall'isolamento iniziale e dalla limitazione del passaggio; L'uso di linee cellulari può migliorare la riproducibilità degli esperimenti. L'utilizzo di altri tipi di cellule può richiedere modifiche nei supporti di coltura cellulare e nella formulazione del fibrino. Ad esempio, abbiamo osservato che le cellule staminali mesenchimali umane (MSCs) non sono in grado di formare tessuti lineari tra gli ancoraggi di cemento brushite durante il corso di 2 settimane mentre i fibroblasti di tendine flessori digitali superiore del cavallo, le cellule stromali del midollo osseo equino, , E MSC murini C3H10T1 / 2 rapidamente contraggono e digeriscono il gel fibrinico per formare un tessuto lineare (osservazioni inedite). Questo contrasto può essere una conseguenza delle differenze nella contrattilità cellulare, nella proliferazione e nella produzione di enzimi fibrinolitici.

Applicazione chimicaE stimolazione meccanica
Nel metodo descritto qui, i tessuti a base di fibrina si formano intorno agli ancoraggi di cemento brushite, permettendo l'applicazione di stimolazione meccanica tramite un bioreattore di stretching 11 , nonché per il test di trazione a fine punto. La presenza di un'interfaccia del tessuto molle softite (enthesis) presenta inoltre un'opportunità per ulteriori approfondimenti e miglioramenti 22 , 26 (vedi sezione Applicazioni cliniche sotto). In questo ambiente in vitro , il contributo di fattori chimici e meccanici può essere facilmente identificato; Un esempio di questo è mostrato nella Figura 5 , in cui l'effetto dell'ambiente di siero dopo l'esercizio è stato separato dagli stimoli meccanici dell'esercizio fisico. Possono essere necessari studi pilota per determinare la durata degli interventi sperimentali, la composizione dei trattamenti e gli endpoint appropriati per aspettarsi un cambiamento osservabile. foAd esempio, nello studio di siero 1 dopo l'esercizio, la durata del trattamento sperimentale è stata limitata dalla fornitura di siero utilizzato per il completamento dei supporti, da cui i costrutti sono stati alimentati ogni secondo giorno. Inoltre, durante la seconda settimana di coltura, i mezzi di coltura sono stati completati con siero di riposo o post-esercizio con acido ascorbico e L-prolina mantenuta mentre TGF-β1 è stato rimosso. TGF-β1 è un fattore di crescita pro-fibrotico noto che aumenta nel siero dopo l'esercizio 27 . Pertanto, per evitare di oscurare gli effetti correlati al TGF-β1 del serum post-esercizio, questa citochina non è stata mantenuta nel mezzo di coltura.

Questo modello di legamento modificato può essere utilizzato anche per testare l'effetto del tratto meccanico. Grazie all'impiego di grip invertite modellate per tenere le estremità di ancoraggio del cemento brushite (simile al tester di trazione uniaxico rappresentato in Figura 1 ), i bioreattori di stretch possono essere progettati per ospitare Legamenti inerti. Il nostro laboratorio ha utilizzato in precedenza questo modello per indagare la risposta di segnalazione molecolare dei legamenti ingegnerizzati al tratto di trazione uniaxiale in un bioreattore 11 su misura che fornirà una migliore comprensione per il disegno razionale di un paradigma di stirata in vitro o anche, potenzialmente, in vivo Stretch / attività / applicazioni terapeutiche.

Valutazione dei legamenti ingegnerizzati
Come per la cultura monolayer tradizionale, i costrutti 3D possono essere analizzati per l'espressione genica / proteica; Inoltre, la loro morfologia 3D offre anche l'opportunità di valutare i cambiamenti funzionali e morfologici ei costrutti possono essere mantenuti nella cultura per studi a lungo termine ( Figura 3 ). Mentre i legamenti ingegneristici non sono equivalenti ai legamenti nativi e maturi, essi somigliano allo sviluppo di tendini / legamenti e si comportano in modo analogo al tessuto nativo in risposta alle sostanze nutritive"> 26, fattori di crescita 10 , ormoni 25 e esercizio 11 , 28. Quindi, sebbene sia garantita una cautela prima di fare ampie generalizzazioni da qualsiasi modello in vitro , i risultati dei test di costruzione del legamento possono rivelare o informare un particolare meccanismo fisiologico che altrimenti potrebbe essere Impossibile indagare in vivo.

Supplemento di supporti di alimentazione con serum condizionato per un modello flessibile e dinamico con ampie applicazioni
Il metabolome del siero umano è un milieu di ~ 4.500 composti compresi, ma non limitati a, glicoproteine, lipoproteine, derivati ​​lipidici, substrati energetici, metaboliti, vitamine, enzimi, ormoni, neurotrasmettitori e una pletora di elementi costitutivi / intermedi. L'ulteriore controllo del metabolome del siero umano in base alle classi composto 29 rivela additiBenefici dell'integrazione del siero sperimentale in esperimenti in vitro. Cioè la maggior parte dei ~ 4500 composti in siero sono idrofobi o derivati ​​da lipidi, sottolineando l'importanza delle proteine ​​leganti per il trasporto / solubilizzazione. Ne consegue che sarebbe quasi impossibile ricomprimere sperimentalmente la dinamica di trasporto composto endogeno, e quindi la biodisponibilità e le interazioni target-target. Pertanto, il siero sperimentale è particolarmente efficace per lo studio di composti notoriamente dipendenti da molecole accessorie per la solubilizzazione, il trasporto, il legame dell'obiettivo e il meccanismo d'azione.

Il nostro laboratorio ha un interesse a lungo termine per i benefici sanitari dell'esercizio fisico. L'esercizio migliora la funzione cellulare e l'organo in una varietà di tessuti in tutto il corpo 12 , un effetto che può essere attribuito ad una varietà di fattori (ad es. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorini 15 ,Esosomi 16 , 17 ) che vengono rilasciati nella circolazione sistemica. L'ambiente biochimico post-esercizio riflette i fattori liberati sia dall'ormone ormonale responsivo degli esercizi muscolari dello scheletro che dai fattori che vengono rilasciati come risultato della stimolazione simpatica del sistema nervoso delle ghiandole secretari ( ad esempio , cortisolo e catecolamine dalla ghiandola surrenale 18 e crescita Ormone dall'ipofisi anteriore 19 ). Recentemente abbiamo usato un modello di siero pre- e post-esercizio per indagare gli effetti dell'ambiente biochimico indotto da esercizi su tessuti ingegnerizzati. 1 Mentre rimangono molte importanti questioni di ricerca legate all'esercizio, il modello non è in alcun modo limitato in questo modo. Ad esempio, il siero potrebbe essere ottenuto, da fonti di origine animale o umana, a seguito di interventi dietetici o farmacologici o di diverse categorie di età o di popolazione clinicaS 30 . In questo modo, i composti esogeni o endogeni di interesse saranno presenti nel siero e nel mezzo di trattamento, in quantità biodisponibili e interagiscono con il tessuto bersaglio in concerto con l'ambiente endogeno ( cioè in un contesto più fisiologico). Questo approccio è dinamico poiché è altamente probabile che un determinato intervento eserciti un effetto multi-organo (e multi-composto) e quindi l'ambiente fisiologico sarà co-modificato. Mentre questo approccio presenta alcune sfide, dal momento che molteplici variabili biochimiche sistemiche sono alterate contemporaneamente, è un approccio che può aiutare a superare gli inconvenienti della metodologia sperimentale puramente riduzionista 31 , 32 . Assunti insieme, l'implementazione del siero condizionato con un tessuto in tessuto biomimetico ( in vitro ) può essere utilizzato come strumento per fisiologia, nutrizione e domande di ricerca clinica.

Il modello di ingegneria tissutale presentato qui può essere utilizzato per indagare le domande di ricerca anatomiche e cliniche che i tradizionali modelli in vitro non possono. Un legamento o un tendine in vivo contiene una regione di transizione tissutale soft-to-hard chiamata l'enthesis. L'entità, che è vulnerabile a lesioni meccaniche legate alla tensione 33 , può essere studiata in sezione trasversale mediante tecniche di microscopia istochemica e elettronica 22 , 26 . Questa interfaccia unica è doppiamente importante per coloro che hanno una mobilità ridotta o vincolata poiché l'inattività fisica compromette la capacità del tessuto connettivo di trasferire il carico a regioni di bassa o alta conformità 34 , portando in ultima analisi una diminuzione complessiva della conformità dei tessuti e un aumento del rischio di lesioni.

Il nostro laboratorio ha recentemente utilizzato questo modello di ingegneria tissutale 25 </ Sup> per modellare un'altra popolazione, atleti di sesso femminile, a rischio di lesioni del tessuto connettivo: l'incidenza di lesioni ACL è circa cinque volte superiore alle loro controparti maschili 35 . I meccanismi potenziali che sostengono questa disparità basata sul sesso nel ferimento sono stati studiati trattando costrutti di legamento con concentrazioni fisiologiche dell'ormone sessuale femminile, estrogeno, a concentrazioni che hanno simulato le fasi del ciclo mestruale. È interessante notare che elevate concentrazioni di estrogeni inibiscono l'espressione e l'attività genica di lysl ossidasi, l'enzima primario responsabile della creazione di cross-links lisina-lisina nella matrice di collagene di legamenti e tendini. Importante, 48 ore di estrogeno alto (per simulare la fase follicolare) diminuiscono la rigidità del costrutto del legamento senza alterare la densità di collagene dei costrutti. Da una prospettiva fisiologica, ciò suggerisce che gli aumenti della lassità del legamento nelle femmine possono essere dovuti, almeno in parte, a diminuireFormazione di crociate. Da una prospettiva sperimentale, questi risultati 25 evidenziano l'utilità del modello di costruzione 3D, che ha permesso l'attività di cross-linking funzionale da esaminare. Da una prospettiva clinica, questo modello può ora essere utilizzato per monitorare rapidamente gli interventi che possono impedire gli effetti negativi dell'estrogeno della funzione del legamento.

Commenti finali
Qui abbiamo presentato una metodologia dettagliata per la formazione di legamenti ingegnerizzati e la loro utilità come modello 3D in tessuto in vitro . Il modello è altamente adattabile ad una vasta gamma di obiettivi, fornendo flessibilità nel tipo di cellula, negli interventi e nelle misure di risultato di interesse. Supplementare i supporti di alimentazione con il siero condizionato aggiunge un contesto fisiologico che non può essere raggiunto in un ambiente tradizionale in vitro , migliorando la modellizzazione della fisiologia in vivo . In breve, riteniamo che questa sia una modalità di grande portataCon emozionanti implicazioni per l'avanzamento sia dei campi della fisiologia che dell'ingegneria tissutale.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa post-dottorale NSERC (DWDW), da una borsa di studio ARCS Foundation (AL) e da una UC Davis College of Biological Sciences (KB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 Entomoravia N/A For brushite cement anchors
β-tricalcium phosphate Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) N/A For brushite cement anchors
o-phosphoric acid, 85% (w/w) EMD Millipore PX0995 For brushite cement anchors
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500g For brushite cement anchors
Falcon 35 mm tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772A For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 4019862 For silicone-coated plates
1x Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific SH3002802 For cell isolation and expansion
100x antibiotic/antimycotic solution VWR 45000-616 For cell isolation
Type II collagenase Thermo Fisher Scientific 17101015 For cell isolation
100x penicillin/streptomycin solution Thermo Fisher Scientific 15140122 For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated EMD Millipore SCGP00525 For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine VWR 10-013-CV For cell and tissue culture
Fetal bovine serum BioSera FBS2000 Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt MP Biomedicals 0219453680 - 100 MU Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) VWR 82050-598 For cell culture
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282 For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 mL Fisher Scientific 367820 For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle Fisher Scientific 354221 For human serum collection
Thrombin, bovine origin Sigma-Aldrich T4648-1KU For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Fibrinogen, bovine origin Sigma-Aldrich F8630-5G For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A3428 For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
6-Aminohexanoic acid Sigma-Aldrich 07260-100g For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960-5G Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
L-proline Sigma-Aldrich P5607-25G Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
Transforming growth factor-β1 Peprotech 100-21 Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized EMD Millipore SCGPU02RE For reagent sterilization
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-212 Dilute in water to 6 M
4-Dimethylaminobenzaldehyde Sigma-Aldrich 39070-50g For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate Sigma-Aldrich 402869-100g For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline Sigma-Aldrich H54409-100g For hydroxyproline assay
1-propanol Sigma-Aldrich 279544-1L For hydroxyproline assay
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421-250ml For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial EMD Millipore AX0073-9 For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous Sigma-Aldrich 244511-1L For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-656 For hydroxyproline assay

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References

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Trattamento delle strutture ligamentali con serum esercitato-condizionato: un modello di ingegneria tessuto transazionale
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Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D. W. D. Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model. J. Vis. Exp. (124), e55339, doi:10.3791/55339 (2017).More

Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D. W. D. Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model. J. Vis. Exp. (124), e55339, doi:10.3791/55339 (2017).

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