Summary
本発明者らは、三次元構築物をヒトの運動調節血清で処理し、コラーゲン含有量、機能および細胞生化学について分析した靭帯組織のモデルを提示する。
Abstract
インビトロ実験は、生物学的メカニズムを理解するために不可欠である。しかし、単層組織培養とヒトの生理との間のギャップは大きく、所見の翻訳はしばしば貧弱である。したがって、代替の実験的アプローチのための十分な機会がある。ここでは、ヒトの前十字靭帯組織の残骸からヒト細胞を単離し、培養を拡大し、人工靭帯を形成するために使用するアプローチを提示する。運動は、多くの組織、器官および身体過程の機能が改善されるように、血液中の生化学的環境を変化させる。この実験では、靱帯構築培地に、運動によって「調整された」実験的ヒト血清が補充された。このように、介入は、実験的組織が完全な内因性生化学的環境に曝露されるため、より生物学的に関連している。結合タンパク質および補助化合物には、関心のない未知のエージェント。治療後、操作された靱帯は、機械的機能、コラーゲン含有量、形態、および細胞生化学について分析することができる。全体として、伝統的な単層培養および動物モデル、ここで提示される靭帯組織の生理学的モデルに対する4つの大きな利点がある。第1に、靭帯構築物は三次元であり、極限引張応力、最大引張り荷重および弾性率などの機械的特性（ すなわち機能）を定量化することを可能にする。第2に、ボーンと腱要素との間の境界であるエンテシスを、詳細かつ機能的な状況で検査することができる。第3に、運動後の血清を含む培地を調製することにより、運動の広範な健康上の利益を担う運動誘発生化学的環境の影響を偏りのない方法で調べることが可能になる。最後に、この実験モデルは、科学的研究を人道的かつ倫理的な方法で進歩させ、動物、国立衛生研究所の中心的任務、疾病管理センター、食品医薬品局（FDA）などが含まれます。
Introduction
腱と靭帯の傷害は一般的であり、正常な運動性と生活の質に悪影響を与える可能性があります。外科的介入はしばしば必要であるが、限定された様々な成功をもたらすことができる4,5 。腱や靭帯がどのように発達し、成熟し、怪我に反応するかについての現在の理解は不完全であり、より効果的な治療法の開発についての洞察を提供するためには効果的な研究モデルが必要である5 。この知識のギャップに対処するために、動物モデルを使用することができるが、in vivo研究は本質的に複雑であり、環境を制御することおよび意図された組織への介入を直接標的とすることが困難である。対照的に、実験環境は、伝統的な単層細胞培養を用いてインビトロで容易に制御および監視することができる。しかしながら、この技術は化学的および機械的環境を単純化し過ぎる可能性があり、従って再現することはできない細胞のインビボ挙動の遅れを遅らせる。組織工学は、in vitro環境の制御と動物モデルにおける複雑なインビボ環境の利点と結びつくことができ、生理学を研究するための追加のツールを提供する。さらに、靭帯の発達の理解を武器に、組織工学は外科的再建が必要な場合に移植組織の源を提供する可能性があります。したがって、本明細書に記載される方法は、靭帯の機能および形態を研究するために使用され得るin vitroで操作される 3D組織を検証する。
フィブリンベースの腱または靱帯構築物は、コラーゲン原線維形成7および腱発生8ならびに移植組織としての有用性を前胸のヒツジモデルで評価した翻訳適用を含む生理学的過程を研究するためのインビトロモデルとして使用されているciate ligament（ACL）再建9 。私たちの研究室では、以前は、2つのブラシ石、リン酸カルシウム骨代替材料、セメントアンカーにまたがる3Dエンジニアリング靭帯モデルを確立しました。このモデルは、培養培地に生物学的因子10を補充するか、または機械的刺激11を適用するだけで、容易に異なる実験条件に供することができる。重要なことに、この骨 - 靭帯モデルは、怪我の影響を受けやすいボーンと腱の境界面である、エンセプションの詳細な分析を可能にします。
この方法論を提示するためにここで強調した1件の研究では、我々は靭帯機能に関する生化学的環境における運動誘発性変化の効果に興味があった。運動は、身体全体の様々な組織における細胞機能および器官機能を改善する2,3 、 13 、IL-15 14 、Meteorin様15 、エキソソーム16,17 ）、および全身循環に放出される他の未知の生化学的因子の放出に起因し得る効果であるp> 。さらに、運動後の生化学的環境は、分泌腺（ 例えば 、副腎18からのコルチゾールおよびカテコールアミン、および下垂体前葉19からの成長ホルモン）の交感神経系刺激によって放出される運動反応性ホルモンによって富化される）。しかし、 インビボでは、運動の機械的刺激の効果を運動誘発生化学的変化と区別することは不可能である。いくつかの研究では、エクササイズに応答する特定の循環ホルモンおよびサイトカインの予想される上昇を特徴付けているが前述のように、 インビトロで忠実に再現するには 、既知または未知の因子が多すぎます。すなわち、インビトロ研究のいくつかの因子を単離することは、生化学的応答の複雑さに十分に対応していない。本研究では、運動によって引き起こされた血清生化学的環境の変化が人工靭帯機能にどのように影響するかを調べた。生化学的変化の影響を分離するために、抵抗運動の前後前後でヒト参加者から血清を取得し、ヒト前十字靭帯（ACL）線維芽細胞を用いて形成された3D人工靭帯を治療するために使用した。このモデルを使用して、機械的特性およびコラーゲン含量への影響を含む機能的データを得ることができ、分子シグナル伝達への影響を定量化することができる。
Protocol
次の手順は、カリフォルニア大学デイビス校の制度審査委員会によって承認されたプロトコルに準拠しています。研究を始める前に地方倫理委員会に相談してください。
1.ヒトACLレムナントから一次線維芽細胞を単離する
注：無菌性を維持し、生物学的安全キャビネット（BSC）のすべてのステップを実行します。
- 以下に説明するように、適切な倫理審査委員会からヒト組織の採取と使用に関する承認を得る。
- 100倍の抗生物質/抗真菌溶液を1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈して5x抗生物質/抗真菌（ABAM）溶液を調製する。
- 消化ステップまで4℃で保存し、50mLコニカルチューブで5倍ABAM溶液でACL組織断片を収集します。必要に応じて、1 x 1 x 1 cm 3の最大サイズまで、かみそり刃で組織をより小さな断片に切断します。
注意：地域のバイオハザード規則を遵守してください。バイオハザード物質の適切な使用とバイオハザード廃棄物の除染と処分。 - 組織断片を水に浸すのに十分な量のコラゲナーゼ溶液を調製する。 1×ペニシリン/ストレプトマイシンおよび20％ウシ胎仔血清（FBS）を含有する高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）にコラゲナーゼII型（1mg / mL）を溶解し、0.22μmでフィルターする。
- ACL組織をPBSで3回すすぐ。
- 組織を消化する。 ACL組織を新しい50mLコニカルチューブに移し、十分な量のコラゲナーゼ溶液を加えて組織を沈めます。 37℃で一晩（〜17時間）インキュベートする。
- 消化期間が完了する前に、10％FBSおよび100U / mLペニシリンを含むDMEM高グルコース培地を補充することによって増殖培地（GM）を調製する。
- 消化時間が完了する15分前に、組織含有50mLチューブを5分間に3回短時間ボルテックスする。
- 25 mLの血清学的ピペットを使用して、消化した組織を激しく粉砕してtiを破壊する細胞をさらに押し上げる。
- 1,500 xgで5分間遠心する。上清を吸引し、10mLのGMでペレットを再懸濁する。
- 手順1.8-1.9をさらに3回繰り返します。
- 最後の遠心分離の後、ペレットを5-10mLのGMに再懸濁する。細胞懸濁液の小さなサンプルを使用して、血球計数器で細胞数を測定し、トリパンブルーを用いて細胞生存率を評価する。
- 細胞懸濁液を15cm組織培養プレート上に3〜4x10 5細胞/プレートの密度でプレートする。
- 37℃および5％CO 2で維持された滅菌インキュベーター中で70％コンフルエンスまで培養し、GMを3日ごとに交換する。 5継代以内に細胞を使用または保存する（以下を参照）。
- 将来の使用のために細胞を凍らせる。
- 次のように70％コンフルエンスで細胞をトリプシン処理する。培地を吸引し、PBSで細胞を洗浄する。組織培養プレートの底を覆うだけの十分な予熱（37℃）の0.05％トリプシンを加える。プレートを培養インキュベーションに置く細胞が剥がれるまで（細胞が光学顕微鏡を使用して浮遊していることを確認する）~5分間アトルアする。ピペットを用いて細胞を集め、ファルコンチューブに分注する。
- 遠心分離して細胞をペレット化し、20％FBSおよび10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むDMEM高グルコース培地に細胞を再懸濁する。細胞懸濁液をクライオバイアルに分注し、少なくとも24時間-1℃/分で冷却する。冷凍冷凍液を液体窒素中で保存する。
2.シリコーンでコーティングされたプレートの準備
- 35 mm組織培養プレートを準備する：蓋を取り外し、平らな面に開いたプレートを配置する。
- 製造元の指示に従ってシリコーンエラストマーキットを混合する。
- 35 mLプレートあたり約2 mLを分注するために10 mLシリンジを使用します。
- 室温で2〜3日間シリコーンを硬化させます。
3.ブラッシュセメントアンカーの準備
- 予め、円筒状のものを含むシリコーン逆型を準備するアンカー形成のためのlls。逆型は、所望のアンカーの形状およびサイズの仕様にすることができる。
- 最終的なアンカーの所望の高さと直径を決定する。このプロトコールは、直径約3.25mmのプラスチックシリンダーが置かれた35mmの組織培養皿に工作用シリコーンから形成されたカスタムメイドのモールドを使用し、約6.5mmの最終モールド高さを可能にする。最終的なアンカーの寸法は、高さが約3~3.5mmで、直径が約3.4mmであり、アンカーの底部から1.5mmのピンが突出している。
- モールドが作られる35mmの皿に未硬化のシリコーンを加える。それに応じてプラスチックシリンダーを置きます。
注：プラスチック製のシリンダーのサイズは、最終アンカーの直径を決定します。プラスチックシリンダーの配置および使用されるシリコーンの量は、異なる高さのアンカーを生成するように変更することができる。型内のウェルの底部と型自体の底部との間の厚さは、dどのくらいのピンがアンカーの底から突き出て、アンカーが後でシリコーンコーティングされた皿にしっかりと固定されることができるかを決定する。 - シリコーンを硬化させた後、プラスチックシリンダーを取り出し、金型を35mmディッシュから取り出します。
- 3.5Mオルトリン酸/ 100mMクエン酸溶液を調製する。 0.961gのクエン酸を11.5mLのオルトリン酸に溶解する。 MilliQ水で溶液の容量を50 mLにする。室温で溶液を保存し、光から保護する。
- 金型を準備する：金型内の各円柱の中心に1つの金型ピンを置きます。
- 氷上でプラスチック製の秤量ボートにβ-リン酸三カルシウムとオルトリン酸/クエン酸溶液を1g / mLの濃度で混合する。
- プラスチックセルスクレーパーを用いてセメントを激しく混合する。
- セメントを粉砕して混合を継続し、混合物を型内にピペットで入れる。
- 充填した型を2,250 x gで1分間遠心分離する。
- ブルサライトセメントアンカーを室温で一晩放置する。
- 金型からアンカーを取り外し、各シリコーンコーティングされたプレートで2つのアンカーを12 mm離して固定します。
- 70％エタノールを噴霧して固定プレートを滅菌し、プレートと蓋の両方を満たし、BSCに入れる。少なくとも30分後、プレートを吸引し、蓋を交換し、必要になるまでBSCに保存する。
4.ヒト血清を取得する
- 適切な倫理審査委員会の承認がこのプロトコルについて得られたことを確認する。
- ヒトの被験者から、血清中の所望の変化をもたらす所与の介入（ 例えば 、運動、食物または薬物介入）に参加する書面によるインフォームドコンセントが得られていることを確認する。ここでは、安静時と抵抗運動後15分のコレクションについて説明します。
- 訓練された静脈瘤師を用いて、静脈穿刺によって適切な退院した容器に、被験者からの安静時血液サンプルを得る。 参加者が所望の運動計画に従事した15分後に運動後の血液サンプルを採取する。先に記載したように、この実験における抵抗運動プロトコールを使用して、内因性生化学応答を刺激する。
- 参加者にセット間で1分間の休憩を取って5組のレッグプレスを実行させる。次に、参加者に休息なしで連続して膝伸展セットとハムストリングカールセットを行い、セット間で1分間の休憩で3回連続してエクササイズを繰り返します。
- 血液を凝固させてから1,500 xgで10分間遠心する。滅菌条件下で、将来の培地補充（4℃で保存した血清）および生化学的分析（-20℃で保存した少量の血清）で滅菌試験管に血清を移す。
5.フォーム加工された靭帯
注：事前に、一次ファイルを展開するピンブラシントアンカーを用いてシリコーン被覆プレートを調製する。
- 試薬を準備する：
- トロンビンを調製する。ウシトロンビンを200U / mLでDMEM高グルコース培地に溶解する。 0.22μmでろ過し、-20℃で保存します。
- フィブリノーゲンを調製する。ウシフィブリノーゲンをDMEM高グルコース培地に20mg / mLで溶解する。 37℃の水浴中で3〜4時間インキュベートし、溶解を助けるために30分ごとに旋回させる。 0.22μmでろ過し（複数のフィルターが必要な場合があります）、分注し、-20℃で保存します。
- アプロチニンを調製する。アプロチニンを水中に10mg / mLで溶解する。 0.22μmでろ過し、-20℃で保存します。
- アミノヘキサン酸を調製する。アミノヘキサン酸を水に0.1g / mLで溶解する。 0.22μmでろ過し、4℃で保存します。
- アスコルビン酸を調製する。アスコルビン酸をDMEM高グルコース培地に50mMの濃度で溶解する。 0.22μmでろ過し、4℃で保存する。 <L-プロリンを調製する。 L-プロリンを50mMの濃度でPBSに溶解する。 0.22μmでろ過し、4℃で保存する。
- 形質転換成長因子-β1（TGF-β1）を調製する。 TGF-β1を10μg/ mLの濃度で製造元の指示に従って再構成する。等分し、-20℃で保存する。
注：BSCの無菌条件下で以下の手順を実行します。
6.引張試験による人工靭帯
注：引張り試験は、PBS浴中のカスタムビルドテンションテスターを使用して実施した。力変換器に連結された逆成形グリップは、試験中にブルサイトセメントアンカーを適所に保持する。
- デジタルキャリパーを使用して靭帯構成物の長さおよび幅を決定する;組織の断面積を計算する。
- プレートから靭帯構成物を解き放し、アンカーを構造体がPBSに沈められていることを確認してください。
- グリップ間の距離を調整し、構造の長さを初期長さに設定します。
- 試験を開始する：0.4 mm / s（または〜3％/ s）の歪み速度で構造物を破損までひずませる。
- 試験が完了したら、コラーゲン含有量のために組織残留物を処理する（セクション7参照）。
- 得られた荷重 - 変形データから、応力 - 歪みデータを計算し、関心のある機械的特性を定量化する。 （ すなわち 、応力 - 歪み曲線の線形領域にわたる弾性特性）のような、最大の引張り荷重、最大引張り強さおよび弾性率を有する。
7.操作された靭帯のコラーゲン含量の定量
- ブルータイトセメントアンカーから人工靭帯を取り外し、120℃で25分間乾燥させる。
- コンストラクトの乾燥質量を決定し、個々の1.5mLチューブに入れる。乾燥構築物は、室温さらなる処理まで。
- 各構築物に、200μLの6M HClを添加する。ヒュームフードで2時間加熱ブロック内で120℃で煮沸する。
注意：HClは非常に腐食性があり酸性ですので、沸騰防止/安全ロックチューブの使用やその他のチューブの固定方法を推奨します。 - チューブを短時間遠心して液体を集め、ヒュームフード内で1.5時間加熱ブロック内で120℃で蒸発させるためにキャップを外したままにします。
- 得られたペレットを200μLのヒドロキシプロリン緩衝液に再懸濁する。必要になるまで-20℃で保管してください。
- ヒドロキシプロリン緩衝液を調製する。 300mLの水に、16.6gのクエン酸、4mLの酢酸、11.4gのNaOHを加え、溶解するまで撹拌する。 pHを6-6.5に調整し、容量を500mLにする。 250μLのトルエンを防腐剤として添加し、光から保護された4℃で保存する。
- 試薬を準備する。
- トランス-4-ヒドロキシ-L-プロリンを調製する。水に溶解して4 mg / mL溶液にする。 <クロラミン-Tを調製する。水に溶解して14.1 mg / mLの溶液にする。
- アルデヒド - 過塩素酸塩を調製する。 1.5 mLの4-ジメチルアミノベンズアルデヒドを6 mLの1-プロパノール、2.6 mLの過塩素酸（注意：腐食性の強い酸化剤、適切な注意を払う）および0.5 mLの水に溶解する。
注：希釈液は、試料の予想されるコラーゲン含量に応じて、試料：緩衝液の1：4〜1：50の範囲であり得る;したがって、所与のサンプルセットに適切な希釈係数を決定するために（すなわち、サンプルを標準曲線の中央に向けて）配置するために、いくつかの試行錯誤試験が必要とされ得る。
- ヒドロキシプロリン標準曲線を使用して、各サンプルの吸光度値をマイクロプログラムのヒドロキシプロリンに変換する。
- 各ウェルに2.5を乗じて、ヒドロキシプロリンの量を計算する。希釈サンプル。各サンプルウェルに500μLの全混合物200μL（200μL希釈サンプル+150μLクロラミンT +150μLAP溶液）を添加することを思い出してください。
- 元のサンプル中のヒドロキシプロリンの量を計算するために希釈係数（第7.7節）を掛けます。
- コラーゲンの量を計算するために0.137で割る（コラーゲンが13.7％のヒドロキシプロリン20を含むと仮定する）。
注：哺乳動物のヒドロキシプロリンのコラーゲン存在量は、組織や哺乳類の種によって若干異なります。例えば、ブタおよびヒツジアキレス腱は、それぞれ13.5および13.7％（ヒドロキシプロリン質量/乾燥組織質量）を含有する21 。ここでは、コラーゲン中のヒドロキシプロリンのパーセントを推定するために13.7％を使用し、これを用いて次の式を用いて組織サンプルのコラーゲン含量を計算する：
- 乾燥質量で割ってコラーゲンフラを計算するパーセンテージに変換します。
8.分子エンドポイントの定量
注：引っ張り試験とコラーゲン含量の主要結果に加えて、分子エンドポイントを2Dまたは3D組織で測定し、機械的な洞察を加えることができます。バイオアッセイを用いて、分子エンドポイントを決定することができる（ インビトロでの靭帯機能に対する運動後の血清環境の影響に関する文脈については、以下のセクションを参照のこと）。
- 3D組織の場合：
- 上記の手順5に従って構築物を準備する。
- 処置/介入を構築した後、液体窒素中で構築物をスナップフリーズする。
- ドライアイスで冷却した乳鉢と乳棒を使用して、コンストラクトを粉末に粉砕する。ステップ8.4 / 5に続きます）。
- 2D組織の場合：
- 培養ヒトACL線維芽細胞を集密するDMEMを含有する6ウェルプレート中で培養した。
- DMEMを吸引し、あなたの実験戦略（ 例えば 、時間経過または用量応答実験）に従って処置培地を適用する。
- 処理培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄する。
- 適切な抽出バッファー/試薬（次を参照）を使用して収集する細胞をこすります。
- タンパク質発現解析：タンパク質溶解物を得るために、細胞質ゾル抽出バッファー（ 例えば 、250mMスクロース、50mM Tris pH7.4,5mM MgCl 2、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル）を用いる。タンパク質濃度アッセイを実施し、標準的なウェスタンブロット法に従って分析を続ける。
- 遺伝子発現解析：高品質のRNAを得るためにメーカーの指示に従って500μLのRNA単離試薬を用いて全RNAを単離します。標準的な手順に従って、逆転写およびリアルタイム定量PCR分析を行います。
- DNA単離：gを単離して定量するDNA単離試薬を用いてエノムDNAを製造元の説明書に従って使用して精製した。分光光度計を使用してDNA濃度を定量し、260 nmでのサンプル吸光度を測定する。
Representative Results
人工靱帯形成および実験的介入の概要
図1は、設計された靭帯の形成の概要を示す。ブルシャイトセメントでは、オルトリン酸/クエン酸溶液をβ-リン酸三カルシウムと円筒形のウェルに組み合わせることによって、骨代用材料22を調製する。あるいは、組織の機械的機能を直接的に測定しない場合、3-0の絹縫合糸を組織の形成におけるアンカーとして使用することができる。これらをシリコーンでコーティングした35mm皿で12mm離して固定し、70％エタノールに浸して滅菌する。線維芽細胞は、ACL再構築手術中に得られた前十字靭帯残渣から単離される。増殖後、2.5×10 5個の細胞が、ブラシサイトセメントアンカーピンディッシュに形成されたフィブリンゲルに封入される。形成後、靭帯constr機械的性質、コラーゲン含量、細胞増殖、遺伝子発現、タンパク質レベル、および組織形態の変化について調べることができる。
培養中、細胞はフィブリンゲルを収縮させ、2つのアンカーの間に線状組織を形成する（ 図2A ）。培養1〜2日後、細胞はフィブリンゲルに付着し、細胞プロセスが拡張し、牽引力を発揮し始めた（ 図2B ）。フィブリンゲルは牽引力によって収縮し、細胞酵素によって分解されるので、2つのアンカーポイント間に張力が生じ、細胞はこの軸に平行に整列し（ 図2B ）、コラーゲンの沈着を開始する。 4-5日後、構築物は、アンカーの周りで収縮して直線状の円筒形組織を形成した（ 図2A ;この時点で、外部刺激がシステムに適用され得るこの時点で、線状組織形成プロセスの混乱を回避する）。介入は、与えられた介入後のヒトまたは動物の血清、外因性サイトカインおよび成長因子、機械的刺激を用いるか、または酸素張力などの他の環境因子を変化させることによって培地を補うことからなる。 200μMのアスコルビン酸、50μMのL-プロリン、および5ng / mLのTGF-β1を補充した増殖培地（10％FBSおよび100U / mLペニシリンを含むDMEM）を使用して、我々は細胞増殖が2週間培養（ 図2C ）、実際に、光学顕微鏡法は培養14日目に高度に整列した細胞を含む高密度組織を明らかにする（ 図2B ）。
設計された靭帯の評価
培養期間の終わりに、操作された靭帯は、多様体で評価することができるyの方法。このシステムの主な利点は、機械的試験（天然の靭帯の機械的役割を考慮した重要な評価）によって組織の機能的変化を決定する能力である。一軸引張試験を利用して、破壊荷重、極限引張強さ、およびヤング率を含む機械的特性を測定することができる。粘弾性特性は、応力緩和およびクリープ試験によっても測定することができる。 図3Aは、特注の一軸引張り試験機の逆成形グリップに保持された加工靱帯を示す。右のグリップは、組織が破損するまで靭帯の荷重を測定するために力トランスデューサに取り付けられています。 図3Bは、試験の失敗に対する代表的な応力 - 歪みプロットを示す。機械的試験を受けた後、同じ構築物を乾燥させ、ヒドロキシプロリンアッセイ23のために処理して、総コラーゲン含量ならびに他のバイオシェースを評価することができるmicalアッセイ。 1条件につき十分な数の追加サンプルを用いて、細胞増殖、遺伝子およびタンパク質発現、および組織学的形態に対するその効果を含む実験的介入の徹底的な試験を行うことができる。我々の研究の代表的なエンドポイントは14日間ですが、人工靭帯は、 図3Cに示すように培養28日を通して機械的特性およびコラーゲン含量を改善し続け、培養で少なくとも3ヶ月間生存することができます24 。
ドナーの変動性は、実験的な再現性にとって重要な考慮事項です。 図4は、Lee らによって報告された代表的な実験を示す。以前に記載された2週間の培養後に典型的な引張特性およびコラーゲン含量を示す7つの異なるACLドナー（n = 3の雄およびn = 4の雌）を比較した補充された増殖培地。同様のACLコレクションの細胞、ドナーの年齢、損傷後の時間、性別などを用いて、操作された靭帯は、ドナー間の変動性が低く、オスとメスのドナー間の類似の特性がコラーゲン画分の違いを除いて低いことが示される。前述の研究では、人工靭帯をインビトロモデルとして使用して、なぜ女性がACL傷害の危険性が男性よりも高いのかを調べ、雌ドナーから単離されたACL線維芽細胞は本質的に弱く、
運動後の血清環境がインビトロ靭帯機能に及ぼす影響
我々は以前に、人工靭帯が生理学的プロセスを探査するために使用される能力を実証した1 。ss = "xref"> 25。 Westらが報告した以下の代表的な実験において、 1 、我々は靭帯機能に及ぼす運動の生化学的影響を決定し、ここで方法論と所見を強調した。我々は、ヒトACL細胞を用いて人工靭帯を形成し、培養7日目に、運動前または運動後に収集したヒト血清で調整した培養培地からなる介入を適用した。簡潔に述べると、我々は健康な若い男性参加者を募集し、循環ホルモンおよびヒト成長ホルモン（GH）を含むサイトカインを増加させる急性抵抗運動の前後に血液サンプルを採取した。ヒト血清を運動前および運動後の血液サンプルから単離し、エンジニアリングされた靱帯培養の2週間目の培養培地中でウシ胎仔血清の代わりに使用した（ 図5A ）。運動前および運動後の血清サンプルを、GHおよびインスリン様増殖因子1（IGF-1）の変化についてELISAを用いて分析し、その濃度は運動によって変化させることができる（ 図5B ）。この情報は、運動に応答して血清中の変化を伴う人工靭帯に対する血清効果を相関させるために使用された。 14日間の培養期間後、機械的試験およびコラーゲン含有量のヒドロキシプロリン測定を用いて靱帯構築物を評価し、運動後血清に応答して最大引張荷重およびコラーゲン含量の有意な増加を実証した。この効果がGHまたはIGF-1の運動誘発性放出に関連しているかどうかを評価することを目的として、操作された靭帯を別の実験で形成し、ヒト組換えGHまたはIGF-1の用量応答で処置した。興味深いことに、血清GHは血液中で増加したが（ 図5B -i）、培地中の組換えGH濃度の増加はコラーゲン含量を増加させなかった（ 図5D -i）か、または機械的設計された靭帯の特性（データは示されていない）。対照的に、血清IGF-1レベルは運動後には増加しなかったが、用量応答実験は培養培地中のレベルが増加すると靱帯構築物のコラーゲン含量を改善することを明らかにした（ 図4D- ⅰ）。したがって、運動は運動後のGHの堅牢な増加をもたらすが、rhGHを用いた用量応答実験は、GHが人工靭帯の表現型増強に直接関与するか否かについて疑問を提起する（少なくとも22kDaのアイソフォーム単独では責任あると思われる）。逆に、運動後15分で血清IGF-1は変化しなかったが、広範囲の濃度にわたってrhIGF-1を試験することにより、IGF-1はコラーゲン含量を改善することができた。しかし、生理学的レベルを推定した範囲でrhIGF-1濃度を増加させても、コラーゲン含有量は有意に増加しなかったことに留意すべきである。したがって、ユニークな運動後血清エンバイロエンジニアリングされた靭帯の力学およびコラーゲンの改善に重要であった。
ここで強調された研究では、実験的血清の量は倫理的考慮のため制限されていた。したがって、観察されたコラーゲンの増加に関与する分子機構をさらに調べるために、より低い血清要求を有する短期2Dバイオアッセイを使用した。 ACL線維芽細胞を6ウェルプレートでコンフルエントに培養し、休息または運動後血清で1時間処理し、組換えGH、IGF-1、TGF-β1の用量反応およびPI3K / mTORC1における標的の活性化と比較した、ERK1 / 2、およびSmadシグナル伝達経路を決定した。運動後血清の存在下で、PI3K / mTORC1およびERK1 / 2経路は、それぞれS6K（ 図5D -i）およびERK1 / 2（ 図5D -i）のリン酸化によって評価されるように、より大きな活性化を示した。ホルモンおよびサイトカインの用量応答と比較して、GHはmTORシグナル伝達に対してわずかな陽性効果を示し（ 図5D -i）、IGF-1は最低用量で陽性効果を示したが、GH、IGF-1およびTGFの3つの処置-β1は、PI3K / mTORC1およびERK1 / 2シグナル伝達の増加を説明しなかった。私たちの3Dエンジニアリング靭帯モデルと2Dバイオアッセイデータは、運動後の血清環境がPI3K / mTORC1とERK1 / 2経路の活性化を通じて人工靱帯機能とコラーゲン含量を改善できることを示唆しています。
要約すると、私たちは、運動後の血清と組み合わせた人工靭帯モデルを用いて、i）人工靭帯機能およびコラーゲンに対する運動後の血清環境の効果を調べること、ii）靭帯表現型の変化を血清ホルモン濃度の変化、血清中のどの変化が変化するかを決定することを目的としているiii）靭帯機能の改善につながる運動後の血清によって活性化される分子機構を決定するために、血清生化学的環境の分子標的を調べるため2Dバイオアッセイを使用することにより、この研究の範囲をさらに広げる。
図1：人工靭帯の形成と使用の概要。ブルシャイトセメントアンカーが製造され、シリコーンでコーティングされたプレートに固定される。初代線維芽細胞は、ACLの残骸から分離され、拡張される。エンジニアリングされた靭帯は、フィブリンゲル中の繊維芽細胞を2つのブラシサイトセメントアンカーの周りに封入することによって形成される。操作された靭帯を培養し、所望の特定の化学的または機械的（ 例えば 、バイオリアクターを介して）の刺激で処理する。所望のエンドポイントにおいて、操作された靱帯を収集し、mechanicaについて評価することができる特性、遺伝子発現、コラーゲン含量、タンパク質発現、および組織学を含む。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2.一次靭帯線維芽細胞は、フィブリンを基盤とした骨 - 骨接合の人工靱帯を形成し、2つのブラシ石セメントアンカーにまたがる。 （ A ）時間とともに、繊維芽細胞は線状組織を形成するブラシ石セメントアンカーの周りのフィブリンゲルを収縮させる。 （ B ）最初の3日間で、細胞はフィブリンゲルに付着し、細胞を構築物の長軸に整列させて牽引力を加える。 14日間にわたって、細胞は高度に整列した組織を形成する。スケールバー=160μm。 （ C ）操作された靭帯のDNA含有量は、培養14日目に細胞が増殖する。データは、群当たりn = 3-4構築物で平均±SDとして提示される。グループ。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：人工靱帯の機械的特性およびコラーゲン含有量は、経時的に改善する。 （ A ）靱帯構築物は、靭帯機能に対する所定の介入の効果を決定するために一軸引張試験を受ける。示されているように、2つの逆成形された3D印刷グリップは、設計された腱によって架橋された、相互に整形されたアンカーを保持する。アンカーは、ステッパーモーターおよび力変換器に結合され、試験された組織の応力/歪み曲線を生成し、機械的特性を決定することを可能にする。 （ B </ strong>）破損した人工靱帯の代表的な応力 - 歪み曲線。 28日間にわたって、（ C ）極限引張強度（UTS）、（ D ）最大引張荷重（MTL）、（ E ）ヤング率および（ F ）コラーゲン画分が改善し続ける。データは、群当たりn = 5構築物で平均±SDとして提示される。 *は、他のすべてのグループと有意差があることを示しています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：設計された靭帯は、低いドナー変動性を示す機能性および生化学的な内容について評価することができる。操作された靭帯は、7人の異なるドナー（n = 3雄、n = 4雌）を形成した。 2週間後（ C ）ヤング率、（ D ）断面積（CSA）、（ E ）総コラーゲン含量（％）、コンストラクト、および（ F ）乾燥質量の一部としてのコラーゲン。データは平均±SDとして示され、統計的有意性はスチューデントのt検定で得られた。 *は他の群と有意差があることを示す（p <0.05）。 Lee et al。 25 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5.エンジニアリングされた靭帯は、バイオロに応答して機械的および生化学的変化を示す穏やかな介入。 （ A ）血清は、前（RestTx）および運動後（ExTx）の被験者から採取した採血から単離し、培養の2週間目に人工靭帯を処置するために使用した。 （ B ）（i）残りの血清および運動血清中のヒト成長ホルモン（GH）および（ii）インスリン様成長因子（IGF）-1レベルをELISAによって定量した。 （ C ）ExTxで処理した操作された靭帯は、（i）コラーゲン含量および（ii）最大引張荷重の改善を実証した。対比較（RestTxおよびExTx）の統計的有意性は、有意水準をp <0.05に設定したt検定によって分析した。 （ D ）（i）GHおよび（ii）IGF-1の用量応答を用いて、ExTxに起因するコラーゲン含量の変化に対するこれらの因子の可能な寄与を決定した。 E）2Dバイオアッセイを使用して、GH、RestTx、およびExTxの漸増用量の分子シグナリング標的（例えば、S6K Thr38のリン酸化 ）に対する効果を比較した9および（ii）ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 。 2つ以上の実験群の統計的比較は、ANOVAおよびTukeyのHSDを用いて行った。データは、平均±SDとして提示される。 *は対照との有意差（p <0.05）を示し、§は150 ng / mLおよび300 ng / mL IGF-1との有意差を示す。ウェストら（ West et al。 1 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
Discussion
本稿は、組織発達から翻訳/臨床的質問まで、幅広い研究テーマを持つ研究者にとって有用な実験プラットフォームである靭帯組織のモデルを記述している。ここで説明するエンジニアリングされた靭帯モデルは、ワークフローのさまざまな時点で適用可能な汎用プロトコルに基づいています（ 図1およびディスカッションセクション ）。さらに、 インビトロ環境の本質的に還元的な性質は、飼育培地にコンディショニングされたヒトまたは動物の血清を補充することによって、生理学的領域に近づけることができる。
構築物は、様々な供給源からの線維芽細胞を用いて形成することができる
ここに示された方法論および代表的な結果は、一次ACL線維芽細胞の使用に基づいているが、細胞単離プロトコルは、他のタイプの一次線維芽細胞を収集するために調整することができる。説明したように図4において、若いヒトドナーから単離された一次細胞で形成された人工靭帯は、低いドナー変動性を示す。一次細胞は、初期分離および通過制限によって制限される。細胞株の使用は実験の再現性を改善することができる。他の細胞タイプの使用は、細胞培養培地およびフィブリンゲル製剤の改変を必要とすることがある。例えば、我々は、ヒト間葉系幹細胞（MSC）が2週間にわたってブラシサイトセメントアンカー間に線状組織を形成することができないことを観察したが、ウマ上位デジタル屈筋腱線維芽細胞、ウマ骨髄間質細胞、ニワトリ胚腱線維芽細胞マウスC3H10T1 / 2 MSCは、フィブリンゲルを急速に収縮させて線状組織を形成する（未発表の観察）。このコントラストは、細胞収縮性、増殖および線維素溶解酵素産生の違いの結果であり得る。
化学薬品の適用および機械的刺激
本明細書に記載される方法では、フィブリンベースの組織がブルシャイトセメントアンカーの周りに形成され、ストレッチバイオリアクター11を介する機械的刺激の適用、並びにエンドポイント引張試験が可能になる。ブルサイトセメント - 軟組織界面（エントリー）の存在は、さらなる調査および改善の機会を提供する22,26（下記の臨床応用のセクションを参照）。このインビトロ環境では、化学的および機械的因子の寄与がより容易に同定され得る。これの一例が図5に示されており、それによって運動後の血清環境の効果が運動の機械的な刺激から分離された。実験的介入の時間枠、治療の組成、および観察可能な変化を期待するための適切なエンドポイントを決定するためにパイロット研究が必要な場合があります。フォ例えば、運動後の血清試験1では、実験的処置の長さは、培地を補うために使用される血清の供給によって制限され、そこから構築物は2日毎に栄養補給された。さらに、培養の2週間目に、培養培地にアスコルビン酸およびL-プロリンを維持したまま休止または運動後の血清を補充し、TGF-β1を除去した。 TGF-β1は、運動後に血清中に増加する既知の前線維増殖因子である27 。したがって、運動後血清のTGF-β1関連効果を不明瞭にするのを避けるために、このサイトカインは培地中に維持されなかった。
このエンジニアリングされた靭帯モデルは、機械的ストレッチの影響を試験するためにも使用することができる。ブルシャイトセメントアンカー端部（ 図1に示す一軸引張試験機と同様）を保持するようにリバースモデルグリップを設計することにより、ストレッチバイオリアクターをeng ineered ligaments。私たちの研究室では以前、このモデルを使用して、イン・ビトロストレッチ・パラダイムの合理的な設計、あるいは潜在的にはイン・ビボでのより合理的な設計を提供する、カスタムメイドのバイオリアクター11における一軸引っ張りストレッチに対する人工靭帯の分子シグナル伝達応答を調べたストレッチ/活性/治療用途。
設計された靭帯の評価
伝統的な単層培養と同様に、3D構築物は遺伝子/タンパク質発現についてアッセイすることができる。さらに、それらの3D形態は、機能的および形態学的変化を評価する機会を提供し、構築物を長期間の研究のために培養液中で維持することができる（ 図3 ）。エンジニアリングされた靭帯は、天然の成熟した靭帯と同等ではないが、腱/靱帯の発達と類似しており、栄養素に応答して天然の組織と同様に挙動する従って、 インビトロモデルからの広範な一般化を行う前に注意が必要であるが、靭帯構築検査の結果は、そうでなければそうであるかもしれない特定の生理学的メカニズムを明らかにするか、または通知することができる。 in vivoで調べることは不可能です。
幅広い用途のフレキシブルでダイナミックなモデルのための条件付き血清を補給するための培地
ヒト血清メタボロームは、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質誘導体、エネルギー基質、代謝産物、ビタミン、酵素、ホルモン、神経伝達物質、およびビルディングブロック/中間体の過多を含むが、これらに限定されない約4,500化合物の環境である。化合物クラス29によるヒト血清メタボロームのさらなる検査により、実験的血清をインビトロ実験に組み込むことの1つの利点がある。すなわち、血清中の〜4500の化合物の大部分は、疎水性または脂質由来であり、輸送/可溶化のための結合タンパク質の重要性を強調している。したがって、内因性化合物の輸送動態、したがってバイオアベイラビリティーおよび化合物 - 標的相互作用を実験的に要約することは、ほぼ不可能であろう。したがって、実験的血清は、可溶化、輸送、標的結合、および作用機序のためにアクセサリー分子に依存することが知られている化合物の研究に特に有効である。
私たちの研究室では、運動の健康上の利点に長い間関心があります。運動は、様々な要因（例えば、IL-6 13 、IL-15 14 、Meteorin-like 15など）に起因する可能性がある効果である、体12全体にわたる様々な組織における細胞機能および器官機能を改善する。エキソソーム16,17 ）が、全身循環に放出される。運動後の生化学的環境は、骨格筋運動に応答するホルモンの収縮および分泌腺の交感神経刺激（ 例えば 、副腎18由来のコルチゾールおよびカテコールアミン）の結果として放出される因子の両方から放出される因子を反映する下垂体前葉からのホルモン19 ）。我々は最近、運動前および後の血清のモデルを用いて、運動誘発された生化学的環境が人工組織に及ぼす影響を調べた。多くの重要な運動関連の研究課題が残っているが、このモデルは決してこのように限定されるものではない。例えば、食物または薬理学的介入後、または異なる年齢群または臨床集団からの動物またはヒトの供給源から血清を得ることができたs 30 。このようにして、目的の外因性または内在性の化合物は、生物学的利用可能な量で血清および処理媒体中に存在し、内因性環境と協調して（ すなわち 、より生理学的な状況において）標的組織と相互作用する。このアプローチは、与えられた介入が多臓器（および多化合物）効果を発揮する可能性が高く、したがって生理学的環境が共同修正される可能性が高いため、動的アプローチである。このアプローチはある種の課題を提示するが、複数の全身生化学的変数が同時に変更されるため、純粋に還元的な実験方法論31,32の欠点を克服するのに役立つアプローチである。まとめると、組織工学処理された（ 生体外生体模倣 ）組織と共に条件付き血清を実施することは、生理学、栄養および臨床研究の質問のためのツールとして使用することができる。
私たちの研究室では最近、この組織工学モデル25 <他の集団、女性の運動選手、結合組織損傷の危険性があるモデル：ACL傷害の発生率は、男性の約35倍です。生理的濃度の女性ホルモンであるエストロゲンを用いて靭帯構築物を月経周期の段階を模倣した濃度で処置することにより、この性別に基づく負傷の根底にある可能性のあるメカニズムを調べた。興味深いことに、高濃度のエストロゲンは、靭帯および腱のコラーゲンマトリックス中にリジン - リジン架橋を形成する一次酵素であるlys1オキシダーゼの遺伝子発現および活性を阻害した。重要なことに、48時間の高エストロゲン（卵胞期をシミュレートする）は、構築物のコラーゲン密度を変えずに靭帯構築物の剛性を減少させた。生理学的観点から、これは、女性における靭帯の弛緩の増加が、少なくとも部分的には、クロスリンク形成。実験的な観点から、これらの知見25は、機能的架橋結合活性を調べることができる3D構築物モデルの有用性を強調している。臨床的観点から、このモデルは、靭帯機能のエストロゲンの負の影響を防ぐことができる介入を迅速にスクリーニングするために使用できるようになりました。
閉会の言葉
ここでは、設計された靭帯の形成のための詳細な方法論と3D インビトロ組織モデルとしてのそれらの有用性を提示した。このモデルは幅広い目的に非常に適応し、細胞タイプ、介入、および目的の結果尺度の柔軟性を提供する。調整された血清を含む飼料培地を補充すると、伝統的なインビトロ環境では達成できない生理学的状況が加わり、 インビボ生理学のモデリングが改善される 。つまり、これは広く適用可能なモードであると考えています生理学と組織工学の両方の分野をさらに発展させるための刺激的な意味合いを持っています。
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、NSERCのポスドク研究員（DWDW）、ARCS財団奨学生（AL）、およびUC Davis College of Biological Sciences助成金（KB）によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors |
| β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors |
| o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
| Falcon 35 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
| 1x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
| 100x antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
| Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
| 100x penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
| Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
| DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
| Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
| Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 - 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
| CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
| Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
| BD Vacutainer Red Plastic 10 mL | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
| Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
| Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| 6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C. |
| Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6 M |
| 4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
| Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
| trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
| Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
| Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
| Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |
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