Summary
우리는 3 차원 구조물이 인간의 운동 조절 혈청으로 처리되고 콜라겐 함량, 기능 및 세포 생화학을 분석 한 인대 조직 모델을 제시합니다.
Abstract
생체 외 실험은 생물학적 기작을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 단층 조직 배양과 인간 생리학 사이의 격차가 크며 결과의 번역은 종종 빈약합니다. 따라서 대체 실험 접근법을위한 충분한 기회가있다. 여기에서는 우리 인간 세포가 인간의 전방 십자 인대 조직 잔존물로부터 분리되고, 배양이 확장되며, 인조 인간 인대를 형성하는 데 사용되는 접근법을 제시합니다. 운동은 많은 조직, 기관 및 신체 프로세스의 기능이 향상되도록 혈액의 생화학 적 환경을 변경합니다. 이 실험에서 인대 구성 배양 배지에는 운동으로 '조건이 갖추어 진'실험용 인간 혈청이 보충되었다. 따라서 개입은 실험 조직이 전체 내인성 생화학 환경에 노출되기 때문에 생물학적으로보다 관련이있다. 결합 단백질과 결합 화합물은 세포 내 활성의 활성과 함께 변화 될 수있다.알려지지 않은 관심있는 에이전트. 치료 후 인조 인간 인대는 기계적 기능, 콜라겐 함량, 형태학 및 세포 생화학 분석이 가능합니다. 전반적으로 여기에 제시된 인대 조직의 생리 모델에 대한 전통적인 단층 배양 및 동물 모델 대 네 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 인대 구조물은 3 차원이며, 최대 인장 응력, 최대 인장 하중 및 모듈러스와 같은 기계적 특성 ( 즉 , 기능)을 정량화 할 수 있습니다. 둘째로, 보니 (boney)와 근원 (sinew) 요소 사이의 인터페이스 인 엔테 시스 (enthesis)가 상세하고 기능적 맥락에서 조사 될 수있다. 셋째, 운동 후 혈청을 함유 한 배지를 준비하는 것은 운동의 다양한 건강상의 이익을 담당하는 운동 유발 생화학 적 환경의 영향을 편향적 방식으로 조사 할 수있게한다. 마지막으로,이 실험 모델은 과학적 연구를 인간적이고 윤리적 인 방법으로 발전시킨다.동물, 국립 보건원 (National Institutes of Health), 질병 통제 센터 (Center for Disease Control) 및 식품 의약품 안전청 (FDA)의 핵심 임무를 맡고 있습니다.
Introduction
텐돈과 인대 부상은 흔하며 정상적인 이동성과 삶의 질에 쇠약을 줄 수 있습니다. 외과 개입은 종종 필요하지만 제한적이고 다양한 성공을 거둘 수 있습니다 4 , 5 . 힘줄과 인대가 어떻게 발달하고, 성숙하고, 부상에 반응하는지에 대한 현재의 이해는 불완전하기 때문에 효과적인 치료법 개발에 대한 통찰력을 제공하기 위해서는 효과적인 연구 모델이 필요합니다. 이러한 지식 격차를 해소하기 위해 동물 모델을 사용할 수 있지만 생체 내 연구는 본질적으로 환경을 제어하기 어려우며 의도 된 조직에 대한 개입을 직접 목표로 삼는다. 대조적으로, 실험 환경 은 전통적인 monolayer 세포 배양과 함께 체외에서 쉽게 통제되고 모니터링 될 수 있습니다. 그러나이 기술은 화학적 및 기계적 환경을 지나치게 단순화 할 수 있으므로 다시 작성하지 못할 수도 있습니다늦은 세포의 생체 내 행동. 조직 공학은 시험 관내 환경의 제어와 동물 모델의 복잡한 생체 내 환경과 결합 할 수 있으며 생리학을 연구하기위한 추가 도구를 제공합니다. 또한 인대 발달에 대한 더 나은 이해로 무장 한 조직 공학은 수술 재건이 필요할 때 이식 조직의 원천을 제공 할 수 있습니다 6 . 따라서, 여기에 기술 된 방법은 인대 기능 및 형태를 연구하는데 사용될 수있는 시험 관내 3D 공학 조직을 유효하게한다.
섬유소 기반의 건 또는 인대 구조물은 체외 모델로 사용되어 콜라겐 섬유 형성 및 건 개발 8 뿐만 아니라 전립선 조직의 유용성이 전두엽의 양 모델에서 평가 된 병리학 적 응용을 포함하는 생리 학적 과정을 연구했습니다ciate ligament (ACL) 재건 9 . 우리 연구실은 이전에 두개의 브러시 라이트, 인산 칼슘 뼈 대체 물질, 시멘트 앵커에 이르는 3D 엔지니어링 인대 모델을 확립했습니다. 이 모델은 배양 배지에 생물학적 인자를 보충하거나 기계적 자극을가함으로써 간단하게 다른 실험 조건을 적용 할 수 있습니다 11 . 중요하게도이 뼈대 간 인대 모델은 부상을 입기 쉬운 보니와 근육 요소 사이의 인터페이스 인 엔테 시스에 대한 심층 분석을 가능하게합니다.
이 방법론을 제시하기 위해 여기에 강조된 연구에서 우리는 인대 기능에 생화학 적 환경에서 운동에 의해 유발 된 변화의 효과에 관심이있었습니다. 운동은 몸 전체의 다양한 조직에서 세포 기능과 장기 기능을 향상시킵니다 2 , 3 , 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 , exosomes 16 , 17 ) 및 전신 순환계로 방출 된 기타 알려지지 않은 생화학 적 인자의 방출에 기인 한 효과 인 p> 12 . 또한, 운동 후 생화학 환경은 운동 반응 호르몬이 풍부하며,이 호르몬의 분비는 분비 동맥의 교감 신경계 자극 ( 예 : 부신 18 번 코티솔과 카테콜라민, 뇌하수체 19 번 성장 호르몬)에 의해 자극됩니다. ). 그러나 생체 내 에서 운동의 기계적 자극의 효과를 운동 유발 생화학 적 변화와 구별하는 것은 불가능합니다. 일부 연구에서는 운동에 대한 반응으로 특정 순환 호르몬과 사이토 카인의 예상되는 상승이 특징 이었지만위에서 언급 한 바와 같이, 시험관 내에서 충실히 재구성하기에는 너무 많이 알려진 요소와 알려지지 않은 요소가 너무 많습니다 . 즉, 시험 관내 연구를위한 몇 가지 요인을 분리하면 생화학 반응의 복잡성을 부적절하게 해결할 수 있습니다. 본 연구에서는 운동으로 인한 혈청 생화학 적 환경의 변화가 공학적 인대 기능에 어떤 영향을 미치는지 조사했다. 생화학 적 변화의 영향을 분리하기 위해, 우리는 저항 운동 전후의 인간 참가자로부터 혈청을 얻었고 인간 전방 십자 인대 (ACL) 섬유 아세포를 사용하여 형성된 3D 공학적 인대를 치료하는데 사용했다. 이 모델을 사용하여 기계적 특성 및 콜라겐 함량에 대한 영향을 비롯하여 분자 신호에 대한 영향을 정량화하는 등 기능적 데이터를 얻을 수 있습니다.
Protocol
다음 절차는 University of California, Davis의 Institutional Review Board에서 승인 한 프로토콜을 준수합니다. 조사를 시작하기 전에 지역 윤리위원회와상의하십시오.
1. 인간 ACL 잔여 물에서 일차 섬유 아세포 분리
참고 : 무균 상태를 유지하고 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)의 모든 단계를 수행하십시오.
- 아래 설명 된대로 적절한 윤리 검토위원회로부터 인간 조직의 수집 및 사용에 대한 승인을 얻습니다.
- 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100x 항생제 / 항균제 용액을 희석하여 5x 항생제 / 항균제 (ABAM)
- 소화 단계 때까지 4 ML ° C 50 ML 원추형 튜브에 5X ABAM 솔루션에서 ACL 조직 조각을 수집합니다. 필요한 경우 1x1x1cm3의 최대 크기로 면도날로 조직을 작은 조각으로 자릅니다.
주의 : 지역의 생물학적 위해 규정을 준수하십시오.생물학적 유해 물질의 적절한 사용 및 생물학적 유해 폐기물의 오염 제거 및 처리. - 조직 조각을 잠수시키기 위해 충분한 양의 콜라게나 제 용액을 준비하십시오. 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 20 % 태아 소 혈청 (FBS)과 0.22 μm의 필터를 포함하는 높은 포도당 Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)에 콜라게나 제 제 II 형 (1 MG / ML)을 용해.
- ACL 조직을 PBS로 3 회 헹굽니다.
- 조직을 분해하십시오. ACL 조직을 새로운 50 ML 원추형 튜브로 옮기고 조직을 잠수시키기 위해 충분한 양의 콜라게나 제 용액을 첨가합니다. 37 ° C에서 밤새 품는다 (~ 17 시간).
- 소화 기간이 완료되기 전에 10 % FBS와 100 U / mL 페니실린으로 DMEM 고 포도당 배지를 보충하여 성장 배지 (GM)를 준비하십시오.
- 소화 시간이 완료되기 15 분 전에, 5 분 간격으로 3 회 조직 함유 50 mL 튜브를 간단하게 와동시킨다.
- 25 ML 혈청 피펫을 사용하여 적극적으로 티를 깰 소화 조직을 씹다더 이상 세포를 떼어 놓는다.
- 5 분 동안 1,500 xg에서 원심 분리하십시오. 10 ML GM에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 대기음.
- 1.8-1.9 단계를 세 번 더 반복하십시오.
- 마지막 원심 분리 후, 5-10 mL GM에서 펠렛을 재현 탁하십시오. 세포 현탁액의 작은 샘플을 사용하여 hemocytometer로 세포 수를 계산하고 Trypan Blue를 사용하여 세포 생존 능력을 평가하십시오.
- 플레이트 당 3-4 X 10 5 세포의 밀도에서 15cm 조직 배양 플레이트에 세포 현탁액을 플레이트.
- 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 유지되는 멸균 배양기에서 70 %의 합류까지 배양하여 3 일마다 GM을 변화시킵니다. 5 구절 이내에 세포를 사용하거나 저장하십시오 (아래 참조).
- 나중에 사용할 수 있도록 세포를 고정하십시오.
- 다음과 같이 70 % 합류에서 세포를 Trypsinize. 매체를 대기음과 PBS로 세포를 씻으십시오. 조직 배양 플레이트의 바닥을 막기 위해 미리 데워진 (37 ℃) 0.05 % 트립신을 충분히 첨가하십시오. 배양 배양기에 플레이트를 놓습니다.세포가 분리 될 때까지 ~ 5 분 동안 ator (세포가 광학 현미경을 사용하여 떠 다니는 지 확인). 피펫을 사용하여 세포를 수집하고 팔콘 튜브에 분배하십시오.
- 원심 분리기로 세포를 펠레 트하고, 20 % FBS 및 10 % 디메틸 술폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 DMEM 고 포도당 배지에서 세포를 재순환시켰다. cryovials에 나누어지는 세포 현탁액과 적어도 24 시간 -1 ° C / 분에서 시원한. 액체 질소로 냉동 냉동 보관하십시오.
2. 실리콘 코팅 플레이트 준비
- 35mm 조직 배양 플레이트를 준비하십시오 : 뚜껑을 제거하고 평평한 표면에 열린 플레이트를 배치하십시오.
- 제조 업체의 지침에 따라 실리콘 엘라스토머 키트를 혼합하십시오.
- 35mm 플레이트 당 약 2mL를 분배하기 위해 10mL 주사기를 사용하십시오.
- 실리콘이 2-3 일 동안 상온에서 경화되도록하십시오.
3. Brushite 시멘트 앵커 준비
- 원통형 실리콘을 함유 한 실리콘 역 성형 틀을 미리 준비하십시오.앵커 형성을위한 것입니다. 역 금형은 원하는 앵커 모양과 크기의 사양으로 만들 수 있습니다.
- 최종 앵커의 원하는 높이와 직경을 결정합니다. 이 프로토콜은 직경 약 3.25mm의 플라스틱 실린더가 놓여진 35mm 조직 배양 접시에서 공예 실리콘으로 형성된 맞춤형 금형을 사용하여 약 6.5mm의 최종 금형 높이를 허용합니다. 최종 앵커 치수는 높이가 약 3-3.5 mm이고 직경이 약 3.4 mm이고 앵커의 바닥에서 1.5 mm 핀이 돌출되어 있습니다.
- 금형을 만들 35mm 접시에 미 경화 실리콘을 추가하십시오. 플라스틱 실린더를 적절하게 배치하십시오.
참고 : 플라스틱 실린더의 크기에 따라 최종 앵커의 직경이 결정됩니다. 플라스틱 실린더의 위치와 사용 된 실리콘의 양은 다른 높이의 앵커를 만들기 위해 수정할 수 있습니다. 금형 내의 우물 바닥과 금형 자체의 바닥 사이의 두께는 d얼마나 많은 핀이 앵커 바닥에서 튀어 나와서 나중에 앵커가 실리콘 코팅 된 접시에 단단히 고정 될 수 있는지 결정하십시오. - 실리콘을 경화시킨 후, 플라스틱 실린더를 제거하고 35mm 접시에서 금형을 제거하십시오.
- 3.5 M orthophosphoric / 100 mM 구연산 용액을 준비한다. 0.961 g의 구연산을 11.5 mL의 orthophosphoric acid에 녹인다. MilliQ 물로 용액의 부피를 최대 50 mL로 가져옵니다. 실온에서 용액을 저장하고 빛으로부터 보호하십시오.
- 금형을 준비하십시오 : 금형의 원통형 구멍의 중앙에 하나의 미세 관 핀을 놓으십시오.
- 얼음에 플라스틱 무게 보트에 1g / ML 농도에서 β - tricalcium 인산염과 orthophosphoric / 구연산 솔루션을 결합하십시오.
- 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 시멘트를 격렬하게 섞는다.
- 시멘트를 분쇄하여 혼합을 계속하고 피펫 혼합물을 몰드에 넣습니다.
- 채워진 곰팡이를 2,250 x g에서 1 분간 원심 분리하십시오.
- 브러시 사이트 시멘트 앵커를 상온에서 밤새 설정할 수 있습니다.
- 몰드에서 앵커를 제거하고 각 실리콘 코팅 플레이트에서 두 개의 앵커를 12 mm 간격으로 고정하십시오.
- 70 % 에탄올을 분무하여 고정 된 플레이트를 소독하고 플레이트와 뚜껑을 모두 채우고 BSC에 넣습니다. 최소 30 분이 경과 한 후, 플레이트를 대기음으로 뚜껑을 교체하고 필요할 때까지 BSC에 보관하십시오.
4. 인간 혈청 확보
- 해당 윤리 검토위원회의 승인이이 의정서에 대해 획득되었는지 확인하십시오.
- 혈청에서 원하는 변화를 일으킬 수있는 주어진 개입 ( 예 : 운동, 음식 또는 약물 중재)에 참여할 수 있도록 서면 동의를 얻었 음을 확인하십시오. 여기에서는 휴식 시간과 저항 운동 후 15 분 간의 수집에 대해 설명합니다.
- 훈련 된 phlebotomist를 사용하여 적절한 피난 용기에 venipuncture하여 참가자의 휴식 혈액 샘플을 얻으십시오. 참가자가 원하는 운동 프로토콜에 참여하게 한 후 운동 후 혈액 샘플을 수집하십시오. 이전에 설명한대로 1 , 내생 생화학 반응을 자극하기 위해이 실험에서 저항 운동 프로토콜을 사용합니다.
- 참가자들에게 세트 사이에 1 분 휴식으로 5 세트의 레그 프레스를 수행하게합니다. 다음으로, 참가자들이 일련의 무릎 확장기와 햄스트링 컬 세트를 휴식없이 연속적으로 수행 한 다음 세트 사이에서 1 분 휴식으로 3 회 연속 연습을 반복하십시오.
- 혈액이 응고되기 전에 1,500 xg에서 10 분간 원심 분리하십시오. 무균 상태에서 미래의 배지 보충 (혈청 4 ℃에서 저장) 및 생화학 분석 (-20 ℃에서 저장된 혈청의 작은 분액)을 위해 멸균 튜브에 혈청을 옮깁니다.
5. 형태 조작 된 인대
참고 : 사전에 기본 fi 확장Broblasts 및 고정 된 brushite 앵커와 실리콘 코팅 플레이트를 준비합니다.
- 시약 준비 :
- 트롬빈을 준비하십시오. DMEM 고 포도당 배지에 200 U / mL의 소 트롬빈을 용해시킨다. 0.22 μm로 여과하고 분주하고 -20 ° C에 보관하십시오.
- 피브리노겐을 준비하십시오. DMEM 고 포도당 매체에 소의 피브리노겐을 20 mg / mL로 용해시킨다. 용해를 돕기 위해 30 분마다 소용돌이 치는 37 ° C 수조에서 3 ~ 4 시간 동안 품어 낸다. 0.22 μm에서 필터 (여러 개의 필터가 필요할 수 있음), 분액 및 -20 ° C에서 보관하십시오.
- aprotinin을 준비하십시오. aprotinin을 물에 10mg / mL로 용해시킨다. 0.22 μm로 여과하고 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 아미노 헥산 산을 준비하십시오. 물에 0.1g / mL의 아미노 헥산 산을 용해시킨다. 0.22 μm로 여과하고 분주하고 4 ° C에서 보관하십시오.
- 아스 코르 빈산을 준비하십시오. 50 mM 농도의 DMEM 고 포도당 배지에 아스코르브 산을 용해시킨다. 0.22 μm에서 여과하고 4 ° C에서 보관하십시오. <L- 프롤린을 준비하십시오. 50 MM의 농도에서 PBS에 L - 프롤린을 해산. 0.22 μm에서 여과하고 4 ° C에서 보관하십시오.
- 형질 전환 성장 인자 -β1 (TGF-β1)을 준비하십시오. 10 μg / ML의 농도에서 제조 업체의 지시에 따라 TGF - β1을 Reconstitute. 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
참고 : BSC의 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오.
6. 인장 시험용 인장
참고 : 인장 시험은 PBS 조에서 맞춤형 인장 시험기를 사용하여 수행되었습니다. 힘 트랜스 듀서에 결합 된 리버스 몰딩 된 그립은 시험 중 제 위치에서 브러시 라이트 시멘트 앵커를 고정시킵니다.
- 디지털 캘리퍼스를 사용하여 인대 구조물의 길이와 너비를 결정합니다. 조직의 단면적을 계산하십시오.
- 판에서 인대 구조물을 고정 해제하고 앵커를역 성형 그립을 사용하여 구조물을 PBS에 담근다.
- 그립 사이의 거리를 조절하여 구조의 길이를 초기 길이로 설정합니다.
- 시험을 시작합니다 : 0.4 mm / s (또는 ~ 3 % / s)의 변형률 속도로 구조물을 파손에 대해 변형시킵니다.
- 검사가 끝나면 조직 잔여 물을 콜라겐 함량에 맞게 처리하십시오 (7 절 참조).
- 결과로드 변형 데이터로부터 응력 - 변형률 데이터를 계산하고 관심있는 기계적 특성을 정량화하십시오. 예를 들어, 최대 인장 하중, 최대 인장 강도 및 탄성 계수 ( 즉 , 응력 - 변형률 곡선의 선형 영역에 대한 탄성 특성).
7. 조작 된 인대의 콜라겐 함량 정량
- 브러시 라이트 시멘트 앵커에서 인조 된 인대를 제거하고 120 ° C에서 25 분 동안 건조하십시오.
- 구조물의 건조 질량을 결정하고 개별 1.5 mL 튜브에 넣으십시오. 건식 구조물은 실온에서 보관 될 수있다.추가 처리까지.
- 각각의 구조에 200 μL 6 M HCl을 첨가한다. 흄 후드에서 2 시간 동안 가열 블록에서 120 ° C로 끓이십시오.
주의 : HCl은 부식성이 높고 산성이기 때문에 끓임 방지 / 안전 잠금 튜브 또는 기타 튜브 고정 방법을 사용하는 것이 좋습니다. - 튜브를 간단히 원심 분리하여 액체를 모으고 뚜껑 후드에서 1.5 시간 동안 가열 블록에서 120 ° C로 증발하도록 캡을 씌운다.
- 200 μL hydroxyproline 버퍼에 결과 펠렛을 Resuspend. 필요할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 히드 록시 프롤린 완충액을 준비하십시오. 300 mL의 물에 16.6 g의 시트르산, 4 mL의 아세트산, 11.4 g의 NaOH를 넣고 용해 될 때까지 저어 준다. pH를 6-6.5로 맞추고 부피를 500 mL로 가져온다. 보존제로 250 μL의 톨루엔을 첨가하고 4 ° C에서 보관하십시오.
- 시약 준비.
- 트랜스 -4- 하이드 록시 -L- 프롤린을 준비하십시오. 물에 녹여 4 mg / mL 용액을 만든다. <> chloramine-T를 준비하십시오. 물에 녹여 14.1 mg / mL 용액을 만든다.
- 알데히드 - 과염소산 염을 준비하십시오. 1.5 g 4- 디메틸 아미노 벤즈알데히드를 6 mL 1- 프로판올, 2.6 mL 과염소산 (주의 : 부식성, 강한 산화제, 적절한 예방 조치를 취함) 및 0.5 mL의 물에 녹인다.
참고 : 희석은 시료의 예상 콜라겐 함량에 따라 1 : 4 ~ 1 : 50의 시료 : 완충액 범위 일 수 있습니다. 따라서 주어진 샘플 세트에 적합한 희석 인자를 결정하기 위해 (즉, 표준 곡선의 중간에 샘플을 놓는) 시행 착오 테스트가 필요할 수 있습니다.
- 히드 록시 프롤린 표준 곡선을 사용하여 각 시료의 흡광도 값을 히드 록시 프롤린의 마이크로 그램으로 변환하십시오.
- 각 웰에 2.5를 곱하여 히드 록시 프롤린의 양을 계산하십시오.희석 된 샘플. 500 μL 총 혼합물 중 200 개 (200 μL 희석 시료 + 150 μL chloramine T + 150 μL AP 용액)만이 각 시료 웰에 첨가되었음을 상기하십시오.
- 희석 배수 (7.7 절)를 곱하여 원래 표본의 히드 록시 프롤린 양을 계산합니다.
- 콜라겐의 양을 계산하기 위해 0.137로 나누십시오 (콜라겐이 13.7 %의 하이드 록시 프롤린 20을 함유한다고 가정 함).
참고 : 콜라겐에서 포유류의 하이드 록시 프롤린은 조직과 포유류 종에 따라 약간 다릅니다. 예를 들어, 돼지와 양 아킬레스 건은 각각 13.5와 13.7 % (하이드 록시 프롤린 질량 / 건조 조직 질량)를 포함합니다 21 . 여기에서 13.7 %를 사용하여 콜라겐의 히드 록시 프롤린 (hydroxyproline)의 비율을 측정합니다.이 값은 다음 식을 사용하여 조직 샘플의 콜라겐 함량을 계산하는 데 사용됩니다.
- 건조 질량으로 나누어 콜라겐 함량을 계산하십시오비율로 변환하십시오.
8. 분자 종말점의 정량화
참고 : 인장 시험 및 콜라겐 함량의 주요 결과 외에도 2D 또는 3D 조직에서 분자 종말점을 측정하여 역학적 통찰력을 추가 할 수 있습니다. Bioassays는 분자 종말점을 결정하는데 사용될 수 있습니다 ( in vitro 인대 기능에 대한 운동 후 혈청 환경의 영향에 대한 아래의 절 참조).
- 3D 조직의 경우 :
- 위의 5 단계에 따라 구조물을 준비하십시오.
- 치료 / 개입을 만든 후에, 액체 질소에서 구조물을 스냅 프리즈 (quick-freeze)한다.
- 드라이 아이스로 식힌 박격포와 유봉을 사용하여 파우더로 분쇄합니다. 8.4 / 5 단계 계속).
- 2D 조직의 경우 :
- 문화 인간 ACL 섬유 아세포는 월에 합류DMEM이 포함 된 6- 웰 플레이트에서 배양 하였다.
- DMEM을 대기음으로하고 실험 전략 ( 예 : 시간 경과 또는 용량 반응 실험)에 따라 치료 매체를 적용하십시오.
- 치료 매체를 대기음과 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 적절한 추출 버퍼 / 시약을 사용하여 수집 할 세포를 긁으십시오 (다음 참조).
- 단백질 발현 분석 : 단백질 용 해물을 얻기 위해 시토 졸 추출 버퍼 ( 예 : 250 mM sucrose, 50 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl2 및 protease / phosphatase inhibitor cocktail)를 사용하십시오. 단백질 농도 분석을 수행하고 표준 서양 얼룩 절차에 따라 분석을 계속하십시오.
- 유전자 발현 분석 : 고품질 RNA를 얻기 위해 제조업체의 지침에 따라 500 μL RNA 분리 시약을 사용하여 총 RNA를 분리합니다. 표준 절차에 따라 역전사 및 실시간 정량 PCR 분석을 수행하십시오.
- DNA 단리 : g을 분리하고 정량화하십시오.DNA 추출 시약을 사용하여 제조자의 지침에 따라 enomic DNA를 추출한다. 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 시료 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 정량하십시오.
Representative Results
공학적 인대 형성 및 실험적 개입의 개요
그림 1 은 인조 인대의 형성 개요를 보여줍니다. 브루 사이트 시멘트 인 골 대체 물질 (22) 은 오르토 인산 / 시트르산 용액을 원통형 웰에 β- 인산 삼 칼슘과 혼합하여 제조한다. 또는 조직의 기계적 기능을 직접 측정하지 않으면 3-0 실크 봉합사를 조직 형성의 앵커로 사용할 수 있습니다. 이들은 실리콘으로 코팅 된 35mm 접시에 12mm 간격으로 고정시키고 70 % 에탄올에 담궈 멸균합니다. 섬유 아세포는 전방 십자 인대 재건 수술 중에 얻어진 전방 십자 인대 잔재물로부터 분리됩니다. 팽창 후, 2.5 x 105 개의 세포가 흑연 시멘트 앵커 - 고정 된 접시에 형성된 피브린 겔에 캡슐화된다. 형성 후, 인대 constr세포 특성, 세포 증식, 유전자 발현, 단백질 수준, 조직 형태 등의 변화를 검사 할 수 있습니다.
문화 전반에 걸쳐 세포는 피브린 젤을 수축시켜 두 앵커 사이에 선형 조직을 형성합니다 ( 그림 2A ). 배양 1 ~ 2 일 후, 세포는 피브린 겔에 부착되고 세포 과정이 연장되며 견인력을 발휘하기 시작합니다 ( 그림 2B ). 피브린 젤이 견인력에 의해 수축되고 세포 효소에 의해 분해됨에 따라 두 개의 앵커 포인트 사이에 장력이 생성되고 우리의 세포는이 축과 평행하게 정렬되어 콜라겐을 침전하기 시작합니다 ( 그림 2B ). 4-5 일 후, 구조물은 선형 원통형 조직을 형성하는 앵커 주위에서 수축하였으며 ( 그림 2A ;이 시점에서 외부 자극이 시스템에 적용될 수 있음 (interv이 시점에서 선형 조직 형성 과정을 방해하지 않습니다. 중재는 주어진 개입, 외인성 사이토 카인 및 성장 인자, 기계적 자극을 사용하거나 산소 장력과 같은 다른 환경 요인을 변화시킨 후 인간 또는 동물의 혈청으로 배지를 보충하는 것으로 구성 될 수 있습니다. 200 μM 아스코르브 산, 50 μM L- 프롤린 및 5 ng / mL TGF-β1을 첨가 한 성장 배지 (10 % FBS 및 100 U / mL 페니실린을 함유하는 DMEM)를 사용하여, 세포 증식이 2 주 배양을 통해 지속됨을 확인 하였다 기간 ( 그림 2C )과 실제로, 광학 현미경은 배양 14 일 ( 그림 2B )에서 고도로 정렬 세포를 포함하는 밀도 조직을 보여줍니다.
엔지니어링 인대의 평가
배양 기간이 끝날 때, 조작 된 인대는 한 품종으로 평가할 수 있습니다방법의 y. 이 시스템의 가장 큰 장점은 기계적 테스트를 통해 조직의 기능적 변화를 결정할 수 있다는 것입니다. 일축 인장 시험은 하중 대 실패, 극한 인장 강도 및 영률을 포함한 기계적 특성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 점탄성 특성은 응력 완화 및 크리프 시험으로도 측정 할 수 있습니다. 도 3a 는 커스텀 - 빌드 (custom-built) 단축 인장 시험기에서 역 성형 그립에 유지되는 인조 된 인대를 도시한다. 오른쪽 그립은 조직이 파손될 때 인대에 걸리는 하중을 측정하기 위해 힘 센서에 부착됩니다. 그림 3B 는 실패한 테스트에 대한 대표적인 응력 - 변형률 플롯을 보여줍니다. 기계적 시험을 거친 후 동일한 구조를 건조시키고 히드 록시 프롤린 분석을 위해 처리하여 총 콜라겐 함량과 다른 생체를 평가할 수 있습니다mical assays. 조건 당 충분한 수의 추가 샘플을 사용하여 세포 증식, 유전자 및 단백질 발현 및 조직 학적 형태에 대한 영향을 포함하여 실험적 개입에 대한 철저한 검사를 수행 할 수 있습니다. 우리 연구의 전형적 엔드 포인트는 14 일이지만 인조 인간 인대는 그림 3C 와 같이 28 일간의 배양을 통해 기계적 특성과 콜라겐 함량이 지속적으로 향상되며 24 시간 이상 생존 할 수 있습니다.
기증자 변동성은 실험 반복성에 대한 중요한 고려 사항입니다. 그림 4 는 Lee 등이 보고 한 대표 실험을 보여줍니다 . 이전에 기술 된 2 주 배양 후 전형적인 장력 특성 및 콜라겐 함량을 나타내는 7 명의 상이한 ACL 공여자 (n = 3, n = 4)를 비교 하였다 보충 성장 미디어. 유사한 ACL 수집, 기증자의 나이, 손상 후 시간, 성별 등의 세포를 사용하여 조작 된 인대는 콜라겐 분획의 차이를 제외하고는 기증자와 유사한 특성을 보이지 않는다. 앞서 언급 한 연구에서 공학용 인대를 여성이 ACL 손상 위험이 남성보다 훨씬 높은 이유를 조사하기 위해 시험 관절 모델로 사용했으며 여성 기증자로부터 격리 된 ACL 섬유 아세포가 근원적으로 약하고 덜 교원 성 인대를 형성하지 않는다는 것을 입증했습니다 25 .
운동 후 혈청 환경 이 생체 외 인대 기능에 미치는 영향
우리는 이전에 생리 학적 과정을 탐색하는 데 사용되는 공학용 인대의 능력을 입증했습니다 1 ,ss = "xref"> 25. West 등이보고 한 다음과 같은 대표 실험에서. 1 , 우리는 인대 기능에 운동의 생화학 적 영향을 결정하고 여기 방법론과 결과를 강조 표시합니다. 우리는 인간 ACL 세포를 사용하여 공학적으로 만들어진 인대를 형성하고, 운동 7 일 전후에 수집 된 인간 혈청으로 조건화 된 배양 배지로 구성된 개입을 적용했다. 간단히 말해, 우리는 건강한 젊은 남성 참가자를 모집하여 순환 성장 호르몬과 인간 성장 호르몬 (GH)을 비롯한 순환계 호르몬을 증가시키는 저항 운동의 급성 시합 전후에 혈액 샘플을 수집했습니다. 인간의 혈청을 운동 전후 혈액 샘플에서 분리하고 공학용 인대 배양의 두 번째 주 동안 배양 배지에서 태아 소 혈청 대신 사용했다 ( 그림 5A ). 운동 전 및 운동 후 혈청 샘플을 GH 및 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)의 변화에 대해 ELISA를 사용하여 분석하고,농도는 운동으로 바꿀 수있다 ( 그림 5B ). 이 정보는 운동에 반응하여 혈청의 변화와 함께 조작 된 인대에 대한 혈청 효과를 상관시키는 데 사용되었습니다. 14 일간의 배양 기간 후 인대 구조물을 기계적 시험 및 콜라겐 함량의 히드 록시 프롤린 결정을 사용하여 평가하고 운동 후 혈청에 대한 반응으로 최대 인장 하중 및 콜라겐 함량을 유의하게 증가시켰다. 이 효과가 GH 또는 IGF-1의 운동 유발 방출과 관련이 있는지를 평가하기 위해, 조작 된 인대를 별도의 실험에서 형성하고 인간 재조합 GH 또는 IGF-1의 용량 반응으로 치료 하였다. 흥미롭게 도 혈액에서 혈청 GH가 증가하는 반면 ( 그림 5B- i) 배양 배지에서 재조합 GH 농도가 점차 증가하면 콜라겐 함량이 증가하지 않았고 ( 그림 5D- i) 또는 기계적특성화 된 인대의 속성 (데이터는 표시되지 않음). 대조적으로, 혈청 IGF-1 수치는 운동 후에 증가하지 않았지만, 용량 반응 실험은 배양 배지에서 증가하는 수준이 인대 구조물의 콜라겐 함량을 향상 시킨다는 것을 나타냈다 ( 도 4D- ⅰ). 따라서 운동이 운동 후 GH의 튼튼한 증가를 가져 오는 반면, rhGH를 사용한 용량 - 반응 실험은 GH가 조작 된 인대의 표현형 향상에 직접적으로 원인이되는지 의심 스럽다 (적어도 22 kDa의 isoform은 책임있는 것으로 보인다). 반대로 혈장 IGF-1은 운동 후 15 분에 변화하지 않았지만 광범위한 농도에서 rhIGF-1을 테스트하면 IGF-1이 콜라겐 함량을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나 생리 학적 수준을 예측하는 범위를 통해 rhIGF-1 농도를 증가 시키면 콜라겐 함량이 유의하게 증가하지 않았다는 점에 유의해야합니다. 따라서 독특한 운동 후 혈청 환경nment는 조작 된 인대의 역학 및 콜라겐을 개선하는 데 중요했습니다.
1 에서 강조한 연구에서, 실험적 혈청의 양은 윤리적 고려 때문에 제한적이었다. 따라서 혈청 요구량이 낮은 단기 2D 생물 검정법을 사용하여 관찰 된 콜라겐 증가에 기여하는 분자 메커니즘을 추가로 조사했습니다. ACL 섬유 아세포를 6- 웰 플레이트에서 합류 배양하고, 휴식 또는 운동 후 혈청으로 1 시간 동안 처리하고 재조합 GH, IGF-1, TGF-β1의 투여 량 및 PI3K / mTORC1에서의 표적 활성화와 비교 하였다 , ERK1 / 2 및 Smad 신호 전달 경로가 결정되었다. 운동 후 혈청 존재 하에서, PI3K / mTORC1 및 ERK1 / 2 경로는 각각 S6K ( 도 5D- i) 및 ERK1 / 2 ( 도 5D- ii)의 인산화에 의해 평가 된 바와 같이 더 큰 활성화를 나타냈다.호르몬 및 사이토 카인 투여 량 반응과 비교하여 GH가 mTOR 신호 전달에 작은 양성 효과 ( 그림 5D -i)를 보였고 IGF-1이 가장 낮은 용량에서 긍정적 인 효과를 보였으 나 GH, IGF-1 및 TGF의 세 가지 치료 β1은 PI3K / mTORC1 및 ERK1 / 2 신호 전달의 증가를 설명하지 못했다. 3D 인대 모델과 2D 생물 분석 데이터를 종합 해 보면, 운동 후 혈청 환경이 PI3K / mTORC1과 ERK1 / 2 경로의 활성화를 통해 인대 기능과 콜라겐 함량을 향상시킬 수 있음을 알 수 있습니다.
요약하면 운동화 된 혈청과 결합 된 공학용 인대 모델을 사용하여 i) 인조 인간 인대 기능 및 콜라겐에 대한 운동 후 혈청 환경의 영향을 조사 할 수 있었으며, ii) 인대 표현형의 변화와 혈청 호르몬 농도의 변화, 혈청에서 어떤 변화가 일어 났는지를 결정하기위한 목적으로iii) 인대 기능 향상으로 이어지는 운동 후 혈청에 의해 활성화되는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 혈청 생화학 적 환경의 분자 표적을 조사하기 위해 2D 생물 검정을 사용하여 작업의 범위를 더욱 넓히십시오.
그림 1 : 인조 인대의 형성 및 사용 개요. Brushite cement anchor가 제조되어 실리콘 코팅 판에 고정됩니다. 일차 섬유 아세포는 ACL 잔여 물로부터 격리되고 확장됩니다. 조작 된 인대는 섬유소 겔을 2 개의 브러시 라이트 시멘트 앵커 주위에 섬유 아세포를 캡슐화함으로써 형성된다. 조작 된 인대는 배양되고 원하는 특정 화학적 또는 기계적 ( 예 : 생물 반응기를 통해) 자극으로 처리됩니다. 원하는 엔드 포인트에서 인조 인간 인대를 수집하여 mechanica에 대해 평가할 수 있습니다특성, 유전자 발현, 콜라겐 함량, 단백질 발현 및 조직학을 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 1 차 인대 섬유 아세포는 2 개의 브러시 라이트 시멘트 앵커에 걸친 섬유소 기반 뼈 대뼈 공학 인대를 형성합니다. ( A ) 시간이 지남에 따라, 섬유 아세포는 선형 조직을 형성하는 브러시 사이트 시멘트 앵커 주위의 섬유소 젤을 수축시킵니다. ( B ) 처음 3 일 동안 세포는 피브린 젤에 붙어 견인력을 발휘하여 세포를 구조물의 장축과 정렬시킨다. 14 일에 걸쳐, 세포는 고도로 정렬 된 조직을 형성한다. 스케일 바 = 160 μm. ( C ) 조작 된 인대의 DNA 함량은 계속 증가한다.ver 14 일 동안 세포가 증식합니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타내 었으며 그룹당 n = 3-4의 구조를 보였다. 여러 떼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 엔지니어링 인대의 기계적 특성과 콜라겐 함량은 시간이 지남에 따라 향상됩니다. ( A ) 인대 구조는 일차적으로 인장 시험을하여 주어진 개입이 인대 기능에 미치는 영향을 결정합니다. 그림에서 보듯이 두 개의 리버스 몰딩 된 3D 인쇄 그립은 가공 된 힘으로 연결되는 상호 모양의 앵커를 유지합니다. 앵커는 스텝퍼 모터와 힘 트랜스 듀서에 연결되어 테스트 조직의 응력 / 변형률 곡선을 생성하여 기계적 특성을 결정할 수 있습니다. ( B </ strong>) 실패한 긴장된 인대에서 대표적인 응력 - 변형률 곡선. 28 일 동안 ( C ) 극한 인장 강도 (UTS), ( D ) 최대 인장 하중 (MTL), ( E ) 영률 및 ( F ) 콜라겐 분율이 계속해서 향상됩니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로서 n = 5 구조로 나타냈다. *는 다른 모든 그룹과 유의 한 차이가 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 조작 된 인대는 낮은 기증자 변동성을 나타내는 기능 및 생화학 적 성분에 대해 평가할 수 있습니다. 조작 된 인대는 7 명의 다른 기증자 (n = 3 남자, n = 4 여자)를 형성했다. 2 주 후에( A ) 최대 인장 하중, ( B ) 극한 인장 강도 (UTS), ( C ) 영률, ( D ) 단면적 (CSA), ( E ) 총 콜라겐 함량 구조, 및 ( F ) 건조 질량의 일부로서의 콜라겐. 자료는 평균 ± 표준 편차로 나타내었고 통계적으로 유의 한 것은 Student 's t-test였다. *는 다른 그룹과 유의 한 차이가 있음을 나타냅니다 (p <0.05). Lee et al. 25 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 엔지니어링 인대는 생체에 대한 반응으로 기계적 및 생화학 적 변화를 나타냅니다.진지한 개입. ( A ) 혈청은 피험자 (RestTx)와 운동 후 (ExTx)에서 채혈 한 혈액으로부터 분리하고 배양 2 주째에 조작 된 인대를 치료하는데 사용 하였다. ( B ) (i) 나머지 및 운동 혈청의 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) -1 수준을 ELISA를 통해 정량화 하였다. ( C ) ExTx로 처리 한 인공 관절 인대는 (i) 콜라겐 함량이 증가하고 (ii) 최대 인장 하중이 향상됨을 보여주었습니다. 쌍 비교 (RestTx 및 ExTx)의 통계적 유의성을 유의 수준을 p <0.05로 설정 한 t- 검정으로 분석 하였다. ( D ) (i) GH 및 (ii) IGF-1의 용량 - 반응은 ExTx로 인한 콜라겐 함량의 변화에 대한 이들 요인의 가능한 공헌을 결정하는데 사용되었다. E) 2 차 생물학적 검정은 GH, RestTx 및 ExTx의 증가하는 투여 량이 (ⅰ) S6K Thr389 및 (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . ANOVA와 Tukey 's HSD를 사용하여 2 개 이상의 실험 그룹의 통계적 비교를 수행했습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. *는 대조군과 유의 한 차이가 있었고 (p <0.05), §는 150 ng / mL 및 300 ng / mL IGF-1과 유의 한 차이가 있음을 나타냅니다. West et al. 1 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
현재의 원고는 조직 개발에서부터 번역 / 임상 질문에 이르기까지 광범위한 연구 주제를 가진 조사자에게 유용한 실험용 플랫폼 인 인대 조직 모델을 설명합니다. 여기에 설명 된 인대 모델은 워크 플로의 다양한 지점에서 적용 할 수있는 다용도 프로토콜을 기반으로합니다 ( 그림 1 및 토론 섹션 ). 또한, 시험 관내 환경의 본질적으로 환원 주의적 특성은 컨디셔닝 된 인간 또는 동물 혈청으로 사료 배지를 보충함으로써 생리 학적 영역에 더 가깝게 될 수있다.
구조물은 다양한 출처의 섬유 아세포를 사용하여 형성 될 수 있습니다.
여기에 제시된 방법과 대표 결과가 기본 ACL 섬유 아세포의 사용을 기반으로하지만, 세포 분리 프로토콜은 다른 유형의 기본 섬유 아세포를 수집하기 위해 조정할 수 있습니다. 설명한대로도 4 에서, 젊은 인간 공여자로부터 분리 된 1 차 세포로 형성된 인조 된 인대는 낮은 공여자 가변성을 나타낸다. 1 차 세포는 초기 분리 및 통과 제한에 의해 제한됩니다. 세포주의 사용은 실험의 재현성을 향상시킬 수있다. 다른 세포 유형의 사용은 세포 배양 배지 및 섬유소 겔 배합의 변형을 요구할 수있다. 예를 들어 우리는 인간 간엽 줄기 세포 (MSCs)가 2 주 동안 브러시 사이트 시멘트 앵커 사이에 선형 조직을 형성 할 수 없다는 것을 관찰했다. 한편, 말의 우수 굴곡근 섬유 아세포, 말 골수 간질 세포, 병아리 배아 힘줄 섬유 아세포 , 그리고 쥐 C3H10T1 / 2 MSC는 섬유소 겔을 빠르게 수축시키고 소화시켜 선형 조직을 형성한다 (미공개 관측). 이러한 대조는 세포 수축성, 증식 및 섬유소 용해 효소 생산의 차이의 결과 일 수 있습니다.
화학 물질의 적용및 기계적 자극
본원에 기재된 방법에서, 피브린 계 조직은 브러시 라이트 시멘트 앵커 주위에 형성되어 종단점 인장 시험뿐만 아니라 신장 바이오 리액터 (11) 를 통한 기계적 자극의 적용을 허용한다. 적색의 시멘트 - 연조직 계면 (enthesis)의 존재는 추가적인 연구와 개선을위한 기회를 제공한다. 이 시험관 환경에서 화학적 및 기계적 요인의 기여도를보다 쉽게 확인할 수 있습니다. 운동 후 혈청 환경의 효과가 운동의 기계적 자극과 분리되는 그림 5 에 그 예가 나와 있습니다. 실험적 개입, 치료 구성 및 관찰 가능한 변화를 예상 할 수있는 적절한 종말점을 결정하기 위해 파일럿 연구가 필요할 수 있습니다. 포예를 들어, 운동 후 혈청 연구 1 에서, 실험 처리의 길이는 매 2 일마다 구조물을 먹이는 배지를 보충하기 위해 사용 된 혈청 공급에 의해 제한되었다. 또한, 배양 2 주째에는 TGF-β1을 제거한 상태에서 아스코르브 산 및 L- 프롤린을 유지 한 채로 휴식 또는 운동 후 혈청을 배양 배지에 보충 하였다. TGF-β1은 운동 후 혈청에서 증가하는 것으로 알려져있는 프로 섬유 성 성장 인자이다. 따라서, 운동 후 혈청의 TGF-β1- 관련 효과를 모호하게하는 것을 피하기 위해,이 사이토 카인은 배양 배지에서 유지되지 않았다.
이 공학적 인대 모델은 또한 기계적 스트레치의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. 브러시 라이트 시멘트 앵커 끝 ( 그림 1 에 나와 있는 일축 인장 시험기와 유사)을 잡기 위해 역 모델링 된 그립을 엔지니어링함으로써 스트레치 바이오 리액터를 eng ineered ligaments. 우리 연구실은 이전에이 모델을 사용하여 인위적 스트레치 패러다임의 합리적인 설계 또는 심지어 잠재적으로 생체 내 에서 의 합리적인 설계에 대한 더 나은 이해를 제공 할 맞춤 제작 된 생물 반응기 11 에서 일축 인장 스트레치에 대한 인조 인장의 분자 신호 응답을 조사하기 위해이 모델을 사용했습니다 스트레치 / 활동 / 치료 응용 분야.
엔지니어링 인대의 평가
전통적인 단층 배양과 마찬가지로 3D 구조물은 유전자 / 단백질 발현을 분석 할 수 있습니다. 또한 3D 형태학은 기능적 및 형태 학적 변화를 평가할 수있는 기회를 제공하며 장기 연구를 위해 문화가 유지 될 수 있습니다 ( 그림 3 ). 인조 인간 인대는 자연적이고 성숙한 인대와 동등하지는 않지만 힘줄 / 인대를 개발하는 것과 유사하며 영양소에 대한 반응으로 원주 조직과 유사하게 행동합니다26, 성장 인자 10 , 호르몬 25 , 운동 11 , 28. 따라서 어떤 인 비트로 모델로부터 일반화되기 전에주의를 기울여야하지만, 인대 구조 검사의 결과는 다른 생리 학적 메커니즘을 드러내거나 알릴 수있다. 생체 내에서 조사하는 것은 불가능 합니다.
광범위한 적용 범위를 지닌 유연하고 역동적 인 모델을위한 조건부 혈청 보충 사료 공급
인간 혈청 대사 물질은 당 단백질, 지단백질, 지질 유도체, 에너지 기질, 대사 산물, 비타민, 효소, 호르몬, 신경 전달 물질, 빌딩 블록 / 중간체 등과 같은 4,500 가지 화합물의 환경입니다. 29 화합물 분류 29 에 따른 사람의 혈청 대사 물질의 추가 검사는 additi실험용 혈청을 생체 외 실험에 통합하는 데 따른 이점이 있습니다. 즉, 혈청에서 ~ 4500 가지 화합물의 대부분은 소수성 또는 지질에서 유래되어 수송 / 가용화를위한 단백질 결합의 중요성을 강조합니다. 실험적으로 내인성 화합물 수송 동력학을 반복하여 생체 이용률과 화합물 - 표적 상호 작용을 거의 불가능하게 만든다. 따라서, 실험용 혈청은 가용화, 수송, 표적 결합 및 작용 메카니즘에 대한 액세서리 분자에 의존하는 것으로 알려진 화합물의 연구에 특히 효과적이다.
우리 연구소는 운동의 건강 혜택에 오랫동안 관심을 가지고 있습니다. 운동은 다양한 요인들 (예, IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 , IL-exosomes 16 , 17 )이있다. 운동 후 생화학 적 환경은 골격근 운동에 반응하는 호르몬뿐만 아니라 분비 동맥의 교감 신경계 자극 ( 예 : 부신에서 나온 코티솔 및 카테콜라민 18 )과 성장 뇌하수체 앞쪽에있는 호르몬 19 ). 우리는 최근 운동 전후 혈청의 모델을 사용하여 운동에 의해 유도 된 생화학 적 환경이 조작 된 조직에 미치는 영향을 조사했습니다. 많은 중요한 운동 관련 연구 문제가 남아 있지만이 모델은 결코 이런 식으로 제한되지 않습니다. 예를 들어, 혈청은 동물 또는 사람의 출처,식이 또는 약리학 적 개입, 또는 다른 연령층 또는 임상 인구에 따라 얻을 수 있습니다s 30 . 이런 방식으로, 관심의 대상이되는 외인성 또는 내인성 화합물은 생체 이용 량으로 혈청 및 처리 배지에 존재할 것이며, 내인성 환경 ( 즉 ,보다 생리적 인 맥락에서)과 협력하여 표적 조직과 상호 작용할 것이다. 이 접근법은 주어진 중재가 다기능 (및 복합 화합물) 효과를 발휘할 가능성이 높고 생리적 환경이 공동 수정 될 가능성이 높기 때문에 역동적입니다. 이 접근법은 여러 가지 도전 과제를 제시하지만 여러 개의 전 생화학 적 변수가 동시에 변경되므로 순수 환원 주의적 실험 방법론의 결점을 극복하는 데 도움이 될 수있는 접근 방법입니다 31 , 32 . 종합 해보면, 조직 공학 ( 생체 외 생체 모방 ) 조직과 함께 조건부 혈청을 구현하면 생리학, 영양 및 임상 연구 질문을위한 도구로 사용할 수 있습니다.
우리 연구실에서는 최근이 조직 공학 모델을 사용했습니다 <결합 조직 손상에 대한 위험이있는 여성 운동 선수 인 다른 인구를 모델링하기 위해 : ACL 손상의 발생률은 남성 대조군의 약 5 배입니다 35 . 생식기 질환의 여성 성 호르몬, 에스트로겐의 생리 학적 농도를 가진 인대 구조물을 생리주기의 단계를 모방 한 농도로 치료함으로써이 성별에 따른 손상의 근거가되는 잠재적 인 메커니즘을 조사했습니다. 흥미롭게도, 높은 농도의 에스트로겐은 인대와 힘줄의 콜라겐 매트릭스에서 라이신 - 라이신 교차 결합을 만드는 주요 효소 인 lysl oxidase의 유전자 발현과 활성을 억제했다. 중요한 것은, 48 시간의 높은 에스트로겐 (follicular phase를 모방하기 위해)은 구조물의 콜라겐 밀도를 변화시키지 않고 인대 구조의 강성을 감소시키는 것입니다. 생리 학적 관점에서 볼 때, 이것은 여성의 인대 이완의 증가가 적어도 부분적으로는 감소로 인한 것일 수 있음을 시사한다가교 형성. 실험적 관점에서,이 연구 결과는 기능적 가교 결합 활성을 조사 할 수있는 3D 구축 모델의 유용성을 강조한다. 임상 적 관점에서,이 모델은 이제 인대 기능의 에스트로겐에 대한 부정적인 영향을 예방할 수있는 중재를 신속하게 스크리닝하는데 사용될 수 있습니다.
맺음말
여기에서 우리는 공학적으로 만들어진 인대의 형성과 3D in vitro 조직 모델로서의 유용성에 대한 자세한 방법론을 제시했습니다. 이 모델은 다양한 유형의 목표에 매우 잘 적용 할 수있어 세포 유형, 중재 및 결과 측정에 유연성을 제공합니다. 컨디셔닝 된 혈청으로 사료 배지를 보충하면 생체 내 생리학 모델링을 개선하여 기존 의 시험 관내 환경에서는 얻을 수없는 생리적 컨텍스트가 추가됩니다. 요컨대, 우리는 이것이 광범위하게 적용 가능한 모드라고 생각합니다.생리학 및 조직 공학 분야를 발전시키는 데 흥미로운 영향을줍니다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NSERC 박사후 연구원 (DWDW), ARCS 재단 장학금 (AL) 및 UC Davis College of Biological Sciences (KB) 보조금 (KB)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors |
| β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors |
| o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
| Falcon 35 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
| 1x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
| 100x antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
| Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
| 100x penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
| Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
| DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
| Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
| Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 - 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
| CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
| Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
| BD Vacutainer Red Plastic 10 mL | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
| Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
| Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| 6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C. |
| Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6 M |
| 4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
| Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
| trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
| Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
| Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
| Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |
References
- West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
- Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
- Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
- Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
- Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
- Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
- Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
- Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
- Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
- Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
- Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
- Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
- Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
- Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).
- Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
- Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
- Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
- Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
- Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
- Woessner, J. F. Jr The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
- Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
- Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
- Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
- Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
- Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
- Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
- Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
- Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
- Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists? J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
- Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
- Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
- Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).
