Summary
العديد من الهياكل البيولوجية تفتقر المعالم التي يمكن تحديدها بسهولة، مما يجعل من الصعب تطبيق أساليب المورفولوجية الحديثة. نحن هنا توضيح أساليب لدراسة جذيل الماوس (عظمة في القضيب)، بما في ذلك تشريح والمسح الضوئي microCT، تليها طرق حسابية لتحديد نصف المعالم التي يتم استخدامها لتحديد حجم وشكل الاختلاف.
Abstract
تقدم morphometrics الحديثة طرق قوية لقياس حجم وشكل الاختلاف. الشرط الأساسي هو قائمة الإحداثيات التي تحدد معالم. ولكن مثل هذه الإحداثيات يجب أن تمثل الهياكل المتجانسة عبر العينات. في حين تتكون العديد من الكائنات البيولوجية من معالم التعرف عليها بسهولة لتلبية افتراض التماثل، الكثير منها يفتقر مثل هذه الهياكل. حل واحد محتمل هو رياضيا مكان شبه المعالم على كائن التي تمثل المنطقة المورفولوجية نفسها عبر العينات. هنا، نحن لتوضيح خط أنابيب وضعت مؤخرا لتحديد رياضيا شبه معالم-من الماوس جذيل (القضيب العظام). وينبغي أن تكون وسائلنا ينطبق على مجموعة واسعة من الكائنات.
Introduction
ويشمل مجال morphometrics مجموعة متنوعة من الطرق لقياس حجم وشكل وشكل البيولوجي، خطوة أساسية في البحث العلمي 1، 2، 3، 4، 5، 6. تقليديا، والتحليل الإحصائي للحجم والشكل يبدأ من خلال تحديد معالم على هيكل البيولوجي، ومن ثم قياس المسافات الخطية والزوايا والنسب، والتي يمكن تحليلها في إطار متعدد المتغيرات. لاندمارك على أساس هندسي Morphometrics هو النهج الذي يحتفظ موقف المكاني للمعالم، والحفاظ على المعلومات الهندسية من جمع البيانات من خلال التحليل والتصور 5. معمم تحليل بروكرست (GPA) يمكن تطبيقها على إزالة التباين في الموقع، والحجم، والتناوب من معالم لإنتاج المواءمة بين العينات التي مinimizes خلافاتهم المربعة - ما تبقى هو شكل الاختلاف 7.
مفهوم هام من أي تحليل المورفومترية هو التماثل، أو فكرة يمكن للمرء أن تحديد موثوق المعالم تمثل ميزات ذات مغزى من الناحية البيولوجية والمنفصلة التي تتوافق بين العينات أو الهياكل. على سبيل المثال، والجماجم البشرية لديها عمليات مثلي، الثقب، الغرز، والقنوات التي يمكن أن تتيح التحليلات المورفولوجية. للأسف، وتحديد معالم المقابل من الصعب في العديد من الهياكل البيولوجية، ولا سيما مع الأسطح الملساء أو منحنيات 8 و 9 و 10.
نحن نقترب هذه المشكلة أدناه باستخدام الهندسة الحسابية. سير العمل العام هو توليد مسح ثلاثي الأبعاد للكائن الذي يمكن أن تكون ممثلة مثل سحابة من النقاط، ومن ثم تدوير وتحويل تلك السحابة نقطة بحيث كل شيءموجهة pecimens على تنسيق النظام الموحد. ثم نحدد رياضيا شبه المعالم، من مناطق معينة من الجسم. منفصلة شبه المعالم، وضعت على هذه المناطق هي إجراءات تعسفية بيولوجيا 11. يمكن إجراء GPA والتحليلات الإحصائية اللاحقة إنتاج الأعمال الفنية غير المرغوب فيها 8 و 12 لمعالم وضعها بشكل تعسفي قد لا تكون بيولوجيا مثلي. ولذلك، فإننا نسمح لهذه الدور المعالم لحسابيا "الانزلاق". هذا الإجراء يقلل من فرق الجهد بين الهياكل. كما يقول في مكان آخر خوارزمية انزلاق المستخدمة هنا هي مناسبة لتحديد المناطق التشريحية مماثلة تفتقر التعرف عليها بسهولة معالم 3، 6، 8، 10، 11، 12 المقابلة. هذه الطرق لها لى الخاصةmitations 13، ولكن يجب أن تكون قابلة للتكيف مع كائنات مختلفة الحجم والشكل.
هنا، نحن لتوضيح كيفية تطبيق هذه الطريقة في دراسة حديثة من جذيل الماوس 14، شوكة في القضيب الذي تم المكتسبة وخسر مرة مستقلة متعددة أثناء تطور الثدييات 15. نناقش تشريح وإعداد العظام محددة، وجذيل (بروتوكول 1)، وتوليد الصور microCT (بروتوكول 2)، وتحويل هذه الصور إلى تنسيق تمكن جميع الهندسة الحسابية المصب (بروتوكولات 3 و 4). بعد هذه الخطوات، يتم تمثيل كل عينة عن طريق الإحداثيات ~ 100K س ع ص. نحن ثم المشي من خلال سلسلة من التحولات التي تتماشى على نحو فعال جميع العينات الى التوجه المشترك (بروتوكول 5)، ثم تحديد الدور المعالم، من العينات الانحياز (بروتوكول 6). يجب بروتوكولات 1-4 تكون مشابهة بغض النظر عن وجوه يجري تحليلها. بروتوكول 5 و 6 بروتوكول لجمعية مهندسي البترولتصميم cifically لجذيل، ولكن يحدونا الأمل في أنه من خلال تفاصيل هذه الخطوات، محققين أن تتخيل التعديلات التي من شأنها أن تكون ذات صلة لكائن اهتمامهم. على سبيل المثال، تم تطبيق التعديلات من هذه الأساليب لدراسة الحيتان عظام الحوض وعظام الأضلاع 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات والموظفين من قبل معهد جامعة جنوب كاليفورنيا لرعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، بروتوكول # 11394.
1. جذيل تشريح والتحضير
- الموت ببطء الماوس الذكور الناضجة جنسيا عبر ثاني أكسيد الكربون أكثر من التعرض، وفقا لبروتوكولات التي وضعتها اللجنة المعنية المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).
- وضع الحيوان في موقف ضعيف، وأطال القضيب عن طريق الضغط مع الإبهام الوحشي على فتح القلفة.
- بمجرد مطولة القضيب، توسيع الأنسجة من خلال القلفة إلى أقصى حد ممكن.
- مع مقص، وقطع الداني الجسم القضيب لحشفة القضيب حيث يتواجد جذيل.
- نقل القضيب تشريح لأنبوب مل 1.7 وإضافة 200 ميكرولتر ماء الصنبور. تأكد من أن القضيب مغمورة تماما في السائل.
- احتضان النسيج في الماء في ~ 50 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام.
- وضع جذيل تشريح في أنبوب microcentrifuge جديد مع سقف مفتوح. ترك سقف يا فتح / N لتجف العظام.
2. MicroCT الضوئي
- اضغط على microCT حامل المسح أسطواني إلى لبنة من رغوة بائع الزهور لإنشاء اسطوانة من رغوة بائع الزهور.
- استخراج الاسطوانة من رغوة بائع الزهور وقطع شرائح ~ 2-5 سم سميكة.
- دفع bacula المجففة في رغوة بائع الزهور، وحول محيط شريحة الفردية للحد من التدخل أثناء المسح الضوئي. يجب أن يكون لاحظ التوجه الدقيق للعظام السماح لتحديد الصحيح من العينات الفردية في بروتوكول 4.
- وضع بلطف شريحة من عظام جزءا لا يتجزأ في حامل microCT.
- الحصول على المسح microCT. في حالة الماوس bacula 14
3. تجهيز MicroCT: تحويل .DCM المكدس إلى ملف .xyz واحد
ملاحظة: كل مسح microCT تنتج كومة من .DCM، أو "ديكوم"، والملفات التي تمثل شرائح الصورة التي اتخذت خلال الكائن. يتطلب من جميع الهندسة الحسابية المصب ملفات .xyz مسطحة، الذي هو مجرد ملف نصي يحتوي على أربعة أعمدة - س، ص، ض والإحداثيات لكل بكسل، وكثافة بكسل، بدءا من -5000 (أسود) إلى 5000 (أبيض). عتبة بكسل فوق 3000 يعمل بشكل جيد عموما باعتباره عتبة لتحديد العظام.
- تثبيت بيثون (www.python.org) وحدات PYTHON الأوامر، DICOM، PYLAB، SYS، وNUMPY.
- فتح "01_process_dicom.py "{Figshare} مع أي محرر نصوص. وبموجب القسم المتغيرات، مسار التغيير، عتبات بكسل، وأسماء الدليل حسب الضرورة.
- تشغيل "01_process_dicom.py الثعبان". سيتم طباعة التقدم إلى الشاشة. داخل كل دليل اسمه في الخطوة 3.2، وجعلت اسمه ملف جديد. على سبيل المثال، directory_name.PT3000.xyz، حيث يشير PT3000 عتبة بكسل الإشارة إليها في الخطوة 3.2.
4. معالجة MicroCT: بتجزئة التدريجي الفردية عينة .xyz الملفات
- تثبيت R (https://www.r-project.org/) مع RGL المكتبة.
- فتح الملف '02_segment_dicoms.r' {Figshare} مع أي محرر نصوص. تحت هذا الباب المتغيرات، وتغيير اسم المسار للإشارة إلى ملف .xyz إنشاؤها في بروتوكول 3 أعلاه.
- من داخل R، قم بتشغيل "مصدر ( '02_segment_dicoms.r')" القيادة (بدون علامات التنصيص).
- بعد صورة ثلاثية الأبعاد لملف .xyz إنشاؤها في بروتوكول 3 يظهر، أدخل العدد. dص العينات في ملف .xyz العام. ثم تسمية وتحديد نقاط من كل عينة باستخدام وظائف التمرير والتكبير.
ملاحظة: في الخلفية، وستبذل ملفات .xyz منفصلة لكل عينة. هذه تظهر في دليل المسمى، على سبيل المثال، XYZ_FILES_PT3000، حيث يشير PT3000 عتبة بكسل المستخدمة.
5. "محاذاة" عينة .xyz الملفات لالاحداثيات المشتركة.
- فتح بيثون النصي "03_transform.py" {Figshare}، الأمر الذي يتطلب mattdean_modules.py إضافي وحدة {Figshare}، فضلا عن اثنين من تطبيقات قائمة بذاتها: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) و"qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) التي يتم استخدامها بواسطة هذا البرنامج النصي.
- تحت هذا الباب المتغيرات، وتحديد أسماء المسار الكامل إلى mattdean_modules.py، rotate_path وqconvex_dir. وبالإضافة إلى ذلك، تحديد المسار الكامل إلى الدليل الذي يحتوي على .xy فردملفات ض بإنشائه في الخطوة 4.
- 03_transform.py تشغيل، مما يخلق ملف جديد في العينة مع لاحقة .TRANSFORMED.xyz.
6. "التقطيع" عينة الانحياز .xyz الملفات إلى التعرف، معالم نصف.
- فتح وتشغيل البرنامج النصي بيثون "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. في القسم المتغيرات، وتحديد أسماء المسار الكامل إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات .TRANSFORMED.xyz. ويحدد هذا البرنامج النصي 802 شبه المعالم التي يمكن استخدامها لتحديد حجم وشكل هيكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إحداثيات XYZ من الدور نصف المعالم المنتجة في بروتوكول 6 يمكن استيرادها مباشرة إلى أي تحليل morphometrics هندسية على أساس تاريخي 17. خط أنابيب الحسابية أعلاه قد تم تطبيقها على دراسة bacula الماوس 14، وكذلك الحوض الحوت وعظام الأضلاع 16. ترد مزيد من التفاصيل حول تعريف الحسابية من شبه معالم هنا، في محاولة لمساعدة الباحثين تصور الخطوات التي يمكن تعديلها لاستيعاب كائن معين اهتمامهم. وجذيل يحتوي على العديد من المزايا الفريدة التي تم استغلالها لأتمتة بعض التحولات. على سبيل المثال، بعد قطع حسابيا العظام إلى نصفين على طول المحور الداني القاصي، حددنا النصف الداني ببساطة من خلال مقارنة عدد من النقاط (الأقرب له أكثر). طالما هناك وجود ميزات فريدة من نوعها مثل هذا، يجب أن تكون وسائلنا للتكيف مع أيموضوع. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي التأكيد على أننا مصممون تجريبيا عتبات معينة، مثل "10٪ الداني" التي كان أداؤها جيدا في الدراسات جذيل لدينا، ولكن تحتاج بالتأكيد إلى إعادة تقييم للكائنات الأخرى.
ابتداء من بروتوكول 5، فإن الخطوة الأولى هي الحسابية لحساب بدن محدب (أصغر مجموعة من النقاط التي تحتوي على جميع النقاط الأخرى في عينة) من التعرف على اثنين من النقاط التي هي أبعد بعيدا عن بعضها البعض. هاتين النقطتين (مجالات الحمراء، الشكل 1C) تبدأ في تحديد ض محور جديد (خط أحمر، الشكل 1C) الذي يمتد الداني القاصي-من خلال العظام. في حالة جذيل، يتم تعريف النصف من سحابة نقطة التي تحتوي على المزيد من النقاط كما في نهاية الداني.
ثانيا، تتحول السحابة نقطة كاملة بحيث يأخذ نقطة الداني على س، ص، ض الإحداثيات من 0،0،0 ونقطة ر القاصياكيس على س، ص، ض الإحداثيات 0،0، + ض، حيث + z غير قيمة إيجابية تعتمد على حجم العظام. في نهاية هذه الخطوة، على محور ض يمر عبر طول العظام. للحصول على إجراءات أدناه، وطول من الحد الأدنى لإحداثيات ض القصوى سيتم يشار إلى Zlength.
ثالثا، لتصحيح التباين المرتبطة مع وضع الدقيق لنقاط القريبة والبعيدة المحددة أعلاه، فإن 10٪ أكثر الداني و 10٪ يتم أخذ عينات معظم النقاط البعيدة على حدة (1D الشكل)، وحددت centroids كل منها (المجالات الحمراء، الشكل 1E) وسحابة نقطة تحول تلك التي النقطه الوسطى القريبة هي 0،0،0، والنقطه الوسطى البعيدة هو 0،0، + ض، مع ض المحور الجديد الذي يمر عبر وسط العينة (خط أحمر، الشكل 1E) .
رابعا، استدارة السحابة نقطة حول محور ض بأخذ أول SLIC(ه) من نقطة في الدانية 15-15،25٪ Zlength للهيكل (نقطة زرقاء، الشكل 1E). وسوت هذه الشريحة من النقاط في البعد ض (أي يتم تجاهل الإحداثيات ض ببساطة)، وبدن محدب اتخاذها، والحد الأدنى للإحاطة المستطيل (أصغر المستطيل الذي يحتوي على كافة نقاط أخرى) المحسوبة. تخيل خط يربط بين نقاط المنتصف من الجانبين قصيرة من الحد الأدنى هذا المستطيل المحيط. نحن تدوير سحابة نقطة حتى تصبح هذه نقاط المنتصف اثنين -x، 0، + Z و+ س، 0، + ض، على التوالي، وبالتالي يصبح هذا الخط على المحور x جديد. بعد التحول، ويشار إلى المسافة بين قيم س القصوى، والحد الأدنى لكما Xlength. يتم إنشاء ملف جديد من specimen.xyz إلى specimen.TRANSFORMED.xyz.
خامسا، يشير حدود 1٪ Xlength للمحور ض وشرائح من (نقطة زرقاء، الشكل 1F)، ونقطة واحدة أكثر الداني والقاصي واحدة أكثر تحديدها من هذا SL المركزيالجليد وصفت القاصي والداني، على التوالي. وهذه هي أول اثنين شبه المعالم التي تم تحديدها.
سادسا، يتم أخذ عينات من 50 شرائح متباعدة بشكل متساو من النقاط على طول ض محور (النقاط الحمراء، الشكل 1G). كل شريحة سمك 1٪ Zlength. ثم يتم تسطيح كل شريحة في البعد ض، وتساوت بنسبة 7 خطوط عمودية (الخطوط الحمراء، الشكل 1H). يتم الاحتفاظ نقطة خلال 2٪ Xlength كل سطر (النقاط الحمراء، الشكل 1H)، ثم نقطة مع الحد الأقصى والحد الأدنى وتحفظ، المتوقعة على كل سطر منها، والمسمى بطني وظهري على التوالي الإحداثي ص. وبالإضافة إلى ذلك، بطاقات تحتوي على عدد شريحة ورقم السطر، على سبيل المثال P15_VENTRAL4 هو نقطة بطني عينات من خط ال 4 العمودي للشريحة ال 15. الأهم من ذلك، كل نقطة المسمى، على سبيل المثال، P15_VENTRAL4، ويحدث مرة واحدة فقط في جميع العينات، والحفاظ على corres pondence. بالإضافة إلى نقاط البطنية والظهرية من كل من الأسطر 7 (مجموع 14 شبه المعالم)، يتم أخذ عينات النقاط مع الحد الأقصى والحد الأدنى س القيمة وصفت اليسار واليمين، على التوالي. وممهدة وصاد وعين إحداثيات اليسار واليمين باستخدام وظيفة lowess في ر لجذيل، وتعرف ما مجموعه 16 شبه المعالم لكل شريحة (مجالات الحمراء، الشكل 1H)؛ مع 50 شرائح بالإضافة إلى الداني والقاصي شبه المعالم المحددة أعلاه، يتم أخذ عينات 802 شبه المعالم لكل عينة (المجالات الخضراء، الشكل 1I). يتم تجاهل كل النقاط الأخرى من الفحص microCT الأصلي.
وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من بطني / الظهرية والداني / القطبية البعيدة تم تحديد رياضيا، وقد أكد جميع التحالفات عينة بصريا وتعديلها يدويا كما هو مطلوب. وفي عينة من 369 bacula، ما يقرب من 10 كان لابد من ضبطها يدويا.
er.within الصفحات = "1"> 
الشكل 1: تمثيل مرئي للالحاسوبية سير العمل (بروتوكول 4-6). (A) لقطة من البرنامج النصي 02_segment_dicoms.r (بروتوكول 4)، والتي تبين احالة الغيوم نقطة متميزة لعينات فردية. (ب) عرض الموسع من جذيل واحد، ممثلة سحابة من النقاط XYZ ~ 100K. (ج) تحديد نقطتين أبعد بعيدا عن بعضها البعض (مجالات الحمراء)، وتستخدم لتحديد جديد ض محور يمتد الداني القاصي-من خلال العظام (خط أحمر). (د) أخذ العينات والداني الأكثر 10٪ والبعيدة الأكثر 10٪ من النقاط (نقطة حمراء) يوفر وسيلة لضبط تباين طفيف في وضع دقيق للمحور ض. (E) وcentroids للالداني أكثر من 10٪ والبعيدة الأكثر 10٪ (دوائر حمراء) وتستخدم لتحديد ض محور جديد (خط أحمر). ثم، شريحة من نقطة تقع بين 1يؤخذ 5،00 حتي 15،25٪ من هذا ض محور جديد (نقطة زرقاء) لحساب الحد الأدنى للإحاطة المستطيل. يتم تدوير سحابة نقطة حتى الجانب طويلة من الحد الأدنى للمستطيل إحاطة موازية لمحور س جديد. F) شريحة من نقاط تشغيل على طول خط الوسط (نقطة زرقاء) وأخذ عينات والداني، معظم والبعيدة في أقصى نقطة تعريفها بأنها شبه تاريخي. G) يتم أخذ عينات من 50 شرائح متباعدة بشكل متساو من النقاط (نقطة حمراء)، مع H) تظهر واحدة من هذه الشريحة. وتعرف 16 نقطة (الدوائر الحمراء) للقبض على الخطوط العريضة لكل شريحة. I) عندما تتكرر في جميع شرائح، أي ما مجموعه 802 شبه المعالم (المجالات الخضراء) تحديد هيكل وتستخدم في جميع التطبيقات المورفولوجية المصب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول أعلاه هي 1) تشريح bacula، 2) جمع الصور microCT، 3) تحويل الانتاج microCT إلى ملف مسطح من XYZ إحداثيات، 4) بتجزئة من سحابة نقطة لكل عينة، و5) تحويل كل عينة ل وموحدة نظام الإحداثيات، و6) تحديد الدور المعالم. يتم تعديل هذه الخطوات بسهولة لاستيعاب كائنات مختلفة.
يمكن على الأرجح أن تطبق هذه الأساليب إلى أي الكائن الذي هو في الأساس "قضيب على شكل"، أو على الأقل ليس المنحني للغاية. الكائنات التي منحني الظهر على أنفسهم لتصبح لا يمكن تحليل "على شكل حرف U" في الوقت الراهن، لأن تشريح (الشكل 1G) سيعود نقاط من أجزاء مختلفة من الجسم. يمكن استيعاب هذه الكائنات في المستقبل عن طريق استقامة حسابيا الكائن قبل التقطيع.
لقد قدمنا طريقة عامة لتحديد رياضيا شبه معالم-من الأشكال التي تفتقر إلى الصورةمعالم olid. تم تعديل هذه الأساليب العامة لدراسة تطور الحيتان الحوض والأضلاع العظام 16، والتي لها أشكال مختلفة جدا. وينبغي أن يكون لدينا طرق حسابية لتحديد معالم ينطبق على أي سلسلة من إحداثيات س ع ص. نحن العاملين microCT المسح هنا، نظرا لصغر حجم الماوس bacula 14. للعظام الكبيرة، مثل الحيتان عظام الحوض والأضلاع، نحن العاملين ماسح ليزر التي أعيد بناؤها على سطح العظام 16. ومن المهم أن تفقد البصر عن مجموعات من شبه المعالم للتحقق من جودة الأسلوب. والميزة الرئيسية لطرق حسابية لدينا هي أنها كميا دقيقا حجم وشكل الاختلاف، والحفاظ على المراسلات بين مناطق مختلفة من الجسم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
قدم تيم دالي وأندرو سميث العديد من المناقشات الحسابية مفيدة خلال الأيام الأولى. كتب تيم دالي في rotate_translate_cylindrical برنامج ضروري لبروتوكول 5. تم توفير الموارد الحسابية التي الكتلة الحوسبة عالية الأداء في جامعة جنوب كاليفورنيا. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة # GM098536 (MDD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissors | VWR | 470106-338 | Most sizes should work |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved | VWR | 82027-406 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | To be diluted to 70% for dissections |
| Floral Foam | Wholesale Floral | 6002-48-07 | |
| uCT50 scanner | Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland |
References
- Slice, D. E. Geometrics morphometrics. Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).
- Slice, D. E. Modern morphometrics in physical anthropology. 6, Springer. (2005).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , 2nd, Elsevier. (2012).
- Bookstein, F. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. , Cambridge University Press. (1991).
- Rohlf, F. J., Marcus, L. F. A Revolution in Morphometrics. Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , Elsevier. (2004).
- Rohlf, F. J., Slice, D. E. Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).
- Gunz, P., Mitteroecker, P. Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces. Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).
- Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach. J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).
- Mitteroecker, P., Gunz, P. Advances in geometric morphometrics. Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).
- Bookstein, F. J. Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape. Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).
- Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. Modern morphometrics in physical anthropology. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).
- Oxnard, C., O'Higgins, P. Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology? Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).
- Schultz, N. G., et al. The genetic basis of baculum size and shape variation in mice. G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).
- Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution. Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).
- Dines, J. P., et al. Sexual selection targets cetacean pelvic bones. Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).
- Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data. Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).
