Summary
De nombreuses structures biologiques manquent des repères facilement définissables, ce qui rend difficile l'application de méthodes morphométriques modernes. Ici, nous illustrons les méthodes pour étudier la baculum de la souris (un os dans le pénis), y compris la dissection et le balayage microCT, suivie par des méthodes de calcul pour définir les demi-points de repère qui sont utilisées pour quantifier la taille et la forme de la variation.
Abstract
morphométriques modernes fournit de puissantes méthodes pour quantifier la taille et la forme variation. Une exigence de base est une liste de coordonnées qui définissent des repères; cependant ces coordonnées doivent représenter des structures homologues à travers des spécimens. Alors que de nombreux objets biologiques consistent en des repères facilement identifiables pour satisfaire l'hypothèse d'homologie, beaucoup manquent de telles structures. Une solution potentielle est mathématiquement place des demi-points de repère sur un objet qui représente la même région morphologique à travers des spécimens. Ici, nous illustrons un pipeline récemment mis au point pour définir mathématiquement semi-repères de la baculum de la souris (l'os du pénis). Nos méthodes devraient être applicables à un large éventail d'objets.
Introduction
Le domaine de la morphométrie comprend une diversité de méthodes pour quantifier la taille et la forme de la forme biologique, une étape fondamentale dans la recherche scientifique 1, 2, 3, 4, 5, 6. Traditionnellement, l'analyse statistique de la taille et la forme commence par l'identification des repères sur une structure biologique, puis en mesurant les distances linéaires, les angles et les rapports qui pourraient être analysés dans un cadre multivarié. Géométrique Morphométrie basée Landmark est une approche qui conserve la position spatiale des points de repère, préservation de l' information géométrique de la collecte de données par l' analyse et la visualisation 5. Généralisée Analyse Procuste (GPA) peut être appliqué pour éliminer la variation de l'emplacement, l'échelle et la rotation des points de repère pour produire un alignement entre les spécimens qui minimizes leurs différences au carré - ce qui reste est la forme dissemblance 7.
Un concept important de toute analyse morphométrique est homologie, ou l'idée que l'on peut identifier de manière fiable des repères représentant des caractéristiques biologiquement significatives et discrètes qui correspondent entre les spécimens ou structures. Par exemple, des crânes humains ont des processus homologues, foramen, sutures, et des conduits qui peuvent permettre des analyses morphométriques. Malheureusement, l'identification de repères correspondants est difficile à travers de nombreuses structures biologiques, en particulier celles avec des surfaces lisses ou des courbes 8, 9, 10.
Nous abordons ce problème ci-dessous en utilisant la géométrie algorithmique. Le flux de travail général est de générer un balayage en trois dimensions de l'objet qui peut être représenté comme un nuage de points, puis faire pivoter et transformer ce nuage de points de telle sorte que tout specimens sont orientés sur un système de coordonnées commun. Ensuite, nous définissons mathématiquement semi-repères des régions spécifiques de l'objet. Semi-repères discrets placés sur ces régions sont biologiquement arbitraire 11. Mener GPA et les analyses statistiques ultérieures peut produire des artefacts indésirables 8, 12 parce que des repères arbitrairement placés peuvent ne pas être biologiquement homologue. Par conséquent, nous permettons à ces demi-points de repère pour mathématique "slide". Cette procédure minimise la différence de potentiel entre les structures. Comme dit ailleurs l'algorithme de glissement utilisé ici est appropriée pour quantifier les régions anatomiques similaires manquant facilement identifié des repères 3, 6, 8, 10, 11, 12 correspondant. Ces méthodes ont leur limitations 13, mais devrait être adaptable à des objets de taille et de forme différentes.
Ici, nous illustrons comment cette méthode a été appliquée dans une étude récente de la baculum de la souris 14, un os dans le pénis qui a été gagné et perdu plusieurs fois indépendants lors de l' évolution des mammifères 15. Nous discutons de la dissection et la préparation d'un os spécifique, le baculum (Protocole 1), la génération d'images microCT (protocole n ° 2), et la conversion de ces images à un format qui permet à tous la géométrie algorithmique aval (Protocoles 3 et 4). Après ces étapes, chaque échantillon est représenté par les coordonnées ~ 100K xyz. Nous marchons ensuite à travers une série de transformations qui alignent efficacement tous les spécimens dans une orientation commune (protocole 5), puis de définir les demi-points de repère à partir d'échantillons alignés (Protocole 6). Protocoles 1-4 devraient être similaires quel que soit l'objet en cours d'analyse. Protocole 5 et protocole n ° 6 sont spefiquement conçu pour un baculum, mais nous espérons que, en détaillant ces étapes, les enquêteurs peuvent imaginer des modifications qui seraient pertinentes pour leur objet d'intérêt. Par exemple, des modifications de ces méthodes ont été appliquées pour étudier les baleines os du bassin et os des côtes 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures et le personnel ont été approuvés par l'Institut universitaire de Californie du Sud pour les soins aux animaux et l'utilisation Commission (IACUC), protocole # 11394.
1. Baculum Dissection et préparation
- Euthanasier une souris mâle sexuellement matures par le dioxyde de carbone sur-exposition, selon les protocoles établis par la commission compétente institutionnelle animale soin et l'utilisation (IACUC).
- Couchez l'animal en position couchée, et prolonger le pénis en appliquant une pression avec le pouce latéral à l'ouverture du prépuce.
- Une fois que le pénis se prolonge, étendre le tissu à travers le prépuce, autant que possible.
- Avec des ciseaux, couper le corps proximal du pénis pour le gland où le baculum réside.
- Transférez le pénis disséqués à un tube de 1,7 ml et ajouter de l'eau du robinet de 200 pi. Assurez-vous que le pénis est complètement immergée dans le liquide.
- Laisser incuber le tissu dans l'eau à environ 50 ° C pendant 3-5 jours.
- Placez le baculum disséquée dans un nouveau tube avec le bouchon ouvert. Laissez plafonner ouvert O / N pour sécher l'os.
2. microCT Numérisation
- Appuyez sur un support de balayage cylindrique microCT dans une brique de mousse fleuriste pour créer un cylindre de mousse fleuriste.
- Extraire le cylindre de mousse fleuriste et couper des tranches ~ 2-5 cm d'épaisseur.
- Poussez bacula séché dans la mousse de fleuriste, autour de la périphérie d'une tranche individuelle pour minimiser les interférences lors de la numérisation. L'orientation précise des os faut remarquer permettant l'identification correcte des échantillons individuels dans le protocole 4.
- Placez délicatement la tranche avec les os incorporés dans le porte-microCT.
- Acquérir scans microCT. Dans le cas de bacula de souris 14
3. Traitement de microCT: Conversion d'une pile .dcm dans un fichier unique .xyz
NOTE: Chaque scan microCT produit une pile de .dcm, ou «DICOM», les fichiers qui représentent des tranches d'image prises à travers l'objet. Toute la géométrie computationnelle aval nécessite des fichiers .xyz plats, qui est tout simplement un fichier texte qui contient quatre colonnes - les x, y et z les coordonnées de chaque pixel, et l'intensité du pixel, allant de -5000 (noir) à 5,000 (blanc). Un seuil de pixel au-dessus de 3000 fonctionne généralement bien comme un seuil pour définir les os.
- Installez Python (www.python.org) et les modules de PYTHON COMMANDEMENTS, DICOM, PYLAB, SYS et numpy.
- Ouvrir 01_pr "ocess_dicom.py "{Figshare} avec un éditeur de texte. Dans la section Variables, changement chemin, les seuils de pixels, et les noms de répertoire si nécessaire.
- Exécuter "01_process_dicom.py python". Progress sera imprimé à l'écran. Au sein de chaque répertoire nommé à l'étape 3.2, un nouveau fichier est nommé; par exemple, directory_name.PT3000.xyz, où PT3000 indique le seuil de pixel indiqué à l'étape 3.2.
4. Traitement de microCT: Segmentation-out individuel Specimen .xyz Fichiers
- Installez R (https://www.r-project.org/) avec la bibliothèque RGL.
- Ouvrez le fichier '02_segment_dicoms.r' {Figshare} avec un éditeur de texte. Dans la section Variables, changer le nom de chemin pour pointer vers le fichier .xyz créé dans le protocole 3 ci-dessus.
- De l'intérieur R, exécutez la «source ( '02_segment_dicoms.r')" de commande (sans les guillemets).
- Une fois l'image en trois dimensions du fichier .xyz créé dans le protocole 3 apparaît, entrez le number de spécimens dans le fichier global de .xyz. Ensuite, étiqueter et sélectionner les points de chaque échantillon en utilisant les fonctions de défilement et de zoom.
NOTE: Dans le fond, les fichiers .xyz distincts seront effectués pour chaque échantillon. Ceux-ci apparaissent dans un répertoire nommé, par exemple, XYZ_FILES_PT3000, où PT3000 indique le seuil de pixel utilisé.
5. "Alignement" Specimen .xyz Files to Coordonnées commune.
- Ouvrez le script Python "03_transform.py" {Figshare}, ce qui nécessite le module supplémentaire mattdean_modules.py {Figshare}, ainsi que deux applications autoportants: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) et "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) qui sont utilisés par ce script.
- Dans la section Variables, identifier les noms de chemin complet à mattdean_modules.py, rotate_path et qconvex_dir. En outre, identifier le chemin complet vers le répertoire contenant le .xy individuelz les fichiers créés à l'étape 4.
- 03_transform.py Run, ce qui crée un nouveau fichier par spécimen avec le suffixe .TRANSFORMED.xyz.
6. "Slicing" Specimen alignés .xyz Fichiers pour identifier Demi-repères.
- Ouvrez et exécutez le script Python "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. Dans la section Variables, identifier les noms de chemin complet vers le répertoire contenant les fichiers .TRANSFORMED.xyz. Ce script identifie 802 demi-points de repère qui peuvent être utilisés pour quantifier la taille et la forme de la structure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les coordonnées xyz des demi-repères produites dans le protocole 6 peuvent être importés directement dans une base historique-morphométrie géométrique analyse 17. Le pipeline de calcul ci - dessus a été appliquée à l' étude de la souris bacula 14, ainsi que du bassin de baleine et os des côtes 16. Plus de détails sur la définition de calcul des semi-repères sont présentés ici, dans une tentative pour aider les chercheurs à visualiser les mesures qui pourraient être modifiés pour tenir compte de leur objet particulier d'intérêt. Le baculum contient plusieurs caractéristiques uniques qui ont été exploitées pour automatiser certaines transformations. Par exemple, après la coupe de l'os informatiquement en deux moitiés le long d'un axe proximal-distal, nous avons identifié la moitié proximale simplement en comparant le nombre total de points (le plus proximale a). Tant qu'il existe des caractéristiques uniques telles que cela, nos méthodes devraient être adaptable à toutobjet. En outre, il convient de souligner que nous empiriquement déterminé certains seuils, tels que "10% proximal» qui a effectué bien dans nos études de Baculum, mais très certainement besoin d'être réévalué pour d'autres objets.
Dès le protocole 5, la première étape de calcul consiste à calculer l'enveloppe convexe (le plus petit ensemble de points qui contient tous les autres points dans un échantillon) pour identifier les deux points les plus éloignés les uns des autres. Ces deux points (sphères rouges, la figure 1C) commencent à définir un nouvel axe z (ligne rouge, la figure 1C) qui exécute proximal-distal à travers l'os. Dans le cas de la baculum, la moitié du nuage de points qui contient plus de points est définie comme l'extrémité proximale.
Deuxièmement, le point nuage entier est transformé de sorte que le point proximal prend le x, y, z de 0,0,0 et le point distal tacs sur x, y, z de 0,0, + z, où + z est une valeur positive dépend de la taille de l'os. A la fin de cette étape, un axe z passe à travers la longueur de l'os. Pour les procédures ci-dessous, la longueur du minimum au maximum de coordonnées z sera appelé Zlength.
Troisièmement, pour corriger la variance associée à l'emplacement exact des points proximale et distale identifiés ci - dessus, les 10% les plus proximal et 10% des points les plus distales sont échantillonnées séparément (figure 1D), leurs centroïdes respectifs identifié (sphères rouges, figure 1E) et le nuage de points transformé de telle sorte que le barycentre proximal est 0,0,0, et le barycentre distal est 0,0, + z, avec un nouveau axe z qui passe par le centre de l'échantillon (ligne rouge, figure 1E) .
Quatrièmement, le nuage de points est mis en rotation autour de l'axe z en prenant un slice des points dans la partie proximale 15 à 15,25% Zlength de la structure (points bleus, la figure 1E). Cette tranche de points est aplatie dans la dimension z (ie coordonnées z sont tout simplement ignorés), la coque convexe prise, et le rectangle de délimitation minimum (le plus petit rectangle qui contient tous les autres points) calculée. Imaginer une ligne reliant les points médians des deux petits côtés de ce rectangle de délimitation minimum. Nous tournons le nuage de points jusqu'à ce que ces deux milieux deviennent -x, 0, + z et + x, 0, + z, respectivement, donc cette ligne devient un nouvel axe-x. Après transformation, la distance entre les valeurs maximales et minimales x sont appelés Xlength. Un nouveau fichier est créé à partir de specimen.xyz à specimen.TRANSFORMED.xyz.
Cinquièmement, des points à moins de 1% Xlength de l'axe z sont tranchés sur (points bleus, figure 1F), et le seul point le plus proximal et seule la plus distale identifiées de cette sl centraleglace et étiquetés distales et proximales, respectivement. Ce sont les deux premières demi-repères identifiés.
Sixièmement, 50 tranches régulièrement espacées de points sont échantillonnés le long de l'axe z (points rouges, Figure 1G). Chaque tranche est une épaisseur de 1% Zlength. Chaque tranche est ensuite aplatie dans la dimension z, et divisée à parts égales par 7 lignes verticales (lignes rouges, Figure 1 H). Points dans 2% Xlength de chaque ligne sont conservés (points rouges, Figure 1 H), alors les points avec le maximum et le minimum de coordonnées y sont conservés, projetée sur chaque ligne respective, et étiquetés ventraux et dorsaux, respectivement. En outre, les étiquettes contiennent le numéro de tranche et le numéro de ligne, par exemple P15_VENTRAL4 est le point ventral échantillonné à partir de la 4 e ligne verticale de la 15 ème tranche. Il est important, chaque point marqué, par exemple, P15_VENTRAL4, se produit une fois et une seule fois dans tous les spécimens, préservant correscorres-. En plus des points ventrale et dorsale de chacune des 7 lignes (14 demi-points de repère au total), les points avec le maximum et x-valeur minimale sont échantillonnés et étiquetés gauche et droite, respectivement. Les coordonnées y et z de gauche et droite sont lissées en utilisant la fonction LOWESS dans R. Pour le baculum, un total de 16 demi-repères sont définis par tranche (sphères rouges, Figure 1 H); avec 50 tranches , plus proximal et semi-repères DISTAUX définies ci - dessus, 802 demi-points de repère sont échantillonnés par échantillon (sphères vertes, Figure 1I). Tous les autres points de l'analyse de microCT d'origine sont ignorées.
Il convient de noter que, bien que ventrale / dorsale et proximale / distale polarité a été déterminée mathématiquement, tous les alignements échantillons ont été confirmés visuellement et ajustés manuellement selon les besoins. Dans notre échantillon de 369 bacula, environ 10 ont dû être ajustés manuellement.
Figure 1: Représentation visuelle de l'informatique Workflow (protocole 4-6). (A) Une capture d' écran à partir du script 02_segment_dicoms.r (protocole n ° 4), montrant l'affectation des nuages de points distincts à des spécimens individuels. (B) Vue agrandie d'un baculum, représenté par un nuage de points xyz ~ 100K. (C) Identification des deux points les plus éloignés les uns des autres (sphères rouges), utilisé pour définir un nouvel axe z qui fonctionne proximal-distal à travers l'os (ligne rouge). (D) L' échantillonnage de la plus proximale 10% et plus distale 10% de points (points rouges) fournit un moyen pour ajuster une légère variation dans la position exacte de l'axe z. (E) Les centroïdes des (sphères rouges) proximales-plus de 10% et plus distale 10% sont utilisés pour définir un nouvel axe z (ligne rouge). Ensuite, une tranche de points compris entre 15,00 à 15,25% de ce nouvel axe z (points bleus) est prise pour calculer le rectangle de délimitation minimum. Le nuage de points est mis en rotation jusqu'à ce que le côté long du rectangle de délimitation minimum est parallèle à un nouvel axe-x. F) une tranche de points qui courent le long de la ligne médiane (points bleus) est échantillonné et la plus proximale et distale le point le plus défini comme un semi-repère. G) 50 tranches régulièrement espacées de points sont échantillonnés (points rouges), avec H) montrant une telle tranche. 16 points (cercles rouges) sont définis pour capturer le contour de chaque tranche. I) Lorsque répétée dans toutes les tranches, un total de 802 sites d' intérêt semi-(sphères vertes) définissent la structure et sont utilisés dans toutes les applications morphométriques en aval. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les étapes critiques dans le protocole ci-dessus sont 1) disséquant le bacula, 2) regroupant les images microCT, 3) convertir la sortie de microCT à un fichier plat de coordonnées XYZ, 4) segmentant sur le point nuage de chaque échantillon, 5) la transformation de chaque échantillon à un système de coordonnées normalisé, et 6) définissant semi-repères. Ces étapes sont facilement modifiés pour accueillir des objets différents.
Ces méthodes peuvent probablement être appliquées à tout objet qui est essentiellement «en forme de tige", ou du moins pas trop incurvée. Les objets que la courbe de retour sur eux - mêmes pour devenir " en forme de U" ne peut pas être en cours d' analyse, parce que le tranchage (figure 1G) renverrait des points de différentes parties de l'objet. De tels objets pourraient être logés dans le futur en redressant informatiquement l'objet avant le tranchage.
Nous avons présenté une méthode générale pour les semi-repères mathématiquement définissant à partir de formes qui manquent smonuments Olid. Ces méthodes générales ont été modifiées pour étudier l'évolution des os du bassin et des côtes de baleine 16, qui ont des formes très différentes. Nos méthodes de calcul pour points de repère définissant devraient être applicables à une série de coordonnées xyz. Nous avons utilisé le balayage microCT ici, compte tenu de la petite taille de bacula de la souris 14. Pour les plus grands os, tels que les os du bassin et des côtes de baleines, nous avons utilisé un scanner laser qui reconstruit la surface des os 16. Il est important d'inspecter visuellement tous les ensembles de demi-points de repère pour vérifier la qualité de la méthode. Le principal avantage de nos méthodes de calcul est qu'ils quantifient précisément la taille et la forme de variation, et de préserver la correspondance entre des régions distinctes de l'objet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Tim Daley et Andrew Smith fourni de nombreuses discussions de calcul utiles pendant les premiers jours; Tim Daley a écrit le rotate_translate_cylindrical nécessaire du programme pour le protocole 5. Les moyens informatiques ont été fournis par le cluster de calcul haute performance à l'Université de Californie du Sud. Ce travail a été soutenu par le NIH subvention # GM098536 (MDD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissors | VWR | 470106-338 | Most sizes should work |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved | VWR | 82027-406 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | To be diluted to 70% for dissections |
| Floral Foam | Wholesale Floral | 6002-48-07 | |
| uCT50 scanner | Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland |
References
- Slice, D. E. Geometrics morphometrics. Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).
- Slice, D. E. Modern morphometrics in physical anthropology. 6, Springer. (2005).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , 2nd, Elsevier. (2012).
- Bookstein, F. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. , Cambridge University Press. (1991).
- Rohlf, F. J., Marcus, L. F. A Revolution in Morphometrics. Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , Elsevier. (2004).
- Rohlf, F. J., Slice, D. E. Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).
- Gunz, P., Mitteroecker, P. Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces. Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).
- Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach. J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).
- Mitteroecker, P., Gunz, P. Advances in geometric morphometrics. Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).
- Bookstein, F. J. Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape. Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).
- Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. Modern morphometrics in physical anthropology. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).
- Oxnard, C., O'Higgins, P. Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology? Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).
- Schultz, N. G., et al. The genetic basis of baculum size and shape variation in mice. G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).
- Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution. Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).
- Dines, J. P., et al. Sexual selection targets cetacean pelvic bones. Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).
- Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data. Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).
