Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum

Summary

Viele biologische Strukturen fehlen leicht definierbaren Sehenswürdigkeiten, was es schwierig macht moderne morphometrische Methoden anzuwenden. Hier zeigen wir Methoden, um die Maus baculum (ein Knochen im Penis) zu studieren, einschließlich Dissektion und microCT Scannen, gefolgt von Rechenmethoden halb Sehenswürdigkeiten zu definieren, die verwendet werden, eine Größe zu quantifizieren und Variation zu gestalten.

Abstract

Moderne morphometrics bietet leistungsfähige Methoden Größe und Formvariation zu quantifizieren. Eine Grundvoraussetzung ist eine Liste von Koordinaten, die Sehenswürdigkeiten zu definieren; aber solche Koordinaten müssen homologe Strukturen in Proben repräsentieren. Während viele biologische Objekte leicht identifiziert Sehenswürdigkeiten bestehen die Annahme der Homologie zu erfüllen, fehlen viele solcher Strukturen. Eine mögliche Lösung ist mathematisch Platz halb Sehenswürdigkeiten auf ein Objekt, das den gleichen morphologischen Region über Proben repräsentieren. Hier zeigen wir eine kürzlich entwickelte Pipeline mathematisch halb Sehenswürdigkeiten aus der Maus baculum (Penisknochen) definieren. Unsere Methoden sollten auf eine breite Palette von Objekten anwendbar sein.

Introduction

Das Feld der morphometrics umfasst eine Vielfalt von Methoden , um die Größe und Form der biologischen Form, einen entscheidenden Schritt in der wissenschaftlichen Forschung ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} , zu quantifizieren. Herkömmlicherweise beginnt die statistische Analyse der Größe und Form von Landmarken auf einer biologischen Struktur, und dann Messen linearen Abstände, Winkel und Verhältnisse zu identifizieren, die in einer multivariaten Rahmen analysiert werden konnte. Landmark-basierte Geometrische Morphometrie ist ein Ansatz, der die räumliche Lage von Sehenswürdigkeiten behält, geometrische Informationen von der Datenerfassung durch die Analyse zu erhalten und Visualisierung ^5. Generalized Prokrustes-Analyse (GPA) kann Variation in Position, Skalierung und Drehung von Sehenswürdigkeiten entfernt werden angewendet, um eine Ausrichtung zwischen Proben zu erzeugen, die minimizes ihre quadrierten Differenzen - was bleibt Form Unähnlichkeit ^7.

Ein wichtiges Konzept jeder morphometrische Analyse ist Homologie, oder die Idee, dass man Ziele zuverlässig identifizieren können biologisch sinnvolle und diskrete Merkmale darstellt, die zwischen Proben oder Strukturen entsprechen. Zum Beispiel haben menschliche Schädel homologe Prozesse, Foramen, Nähte und Kanäle, die morphometrischen Analysen ermöglichen können. Leider ist die Identifizierung der entsprechenden Ziele schwierig in vielen biologischen Strukturen, insbesondere solche mit glatten Oberflächen oder Kurven ^{8, 9, 10.}

Wir nähern uns, dieses Problem unter Verwendung von algorithmischen Geometrie. Der allgemeine Arbeitsablauf ist eine dreidimensionale Abtastung des Objekts zu erzeugen, die als Punktwolke dargestellt werden kann, und dann drehen und dass die Punktwolke verwandeln, so dass alle specimens sind auf einem gemeinsamen Koordinatensystem orientiert. Dann definieren wir mathematisch semi-Grenzsteine ​​aus bestimmten Regionen des Objekts. Diskrete Halb Sehenswürdigkeiten auf solche Regionen platziert sind biologisch willkürlich ^11. Durchführung von GPA und die anschließende statistische Analysen können unerwünschte Artefakte ^{8, 12} produzieren , weil willkürlich platziert Sehenswürdigkeiten biologisch nicht homolog sein kann. Deshalb lassen wir diese Halb Sehenswürdigkeiten mathematisch "gleiten". Dieses Verfahren minimiert die Potentialdifferenz zwischen den Strukturen. Wie an anderer Stelle der Schiebe Algorithmus ist hier geeignet , verwendet argumentiert ähnliche anatomische Bereiche zu quantifizieren ohne Anhaltspunkte leicht identifiziert entsprechende ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Diese Verfahren haben ihre limitations ^13, sollte aber auf Gegenstände unterschiedlicher Größe und Form anpassungsfähig sein.

Hier veranschaulichen wir , wie diese Methode in einer neueren Studie der Maus baculum ¹⁴ angelegt wurde, ein Knochen in den Penis, der gewonnen wurde und verlor mehrere unabhängige Zeiten während Säuger evolution ^15. Wir diskutieren die Präparation und Herstellung einer bestimmten Knochen, die baculum (Protokoll 1), die Erzeugung von microCT Bilder (Protokoll 2), und die Umwandlung dieser Bilder in ein Format, das alle nachgelagerten algorithmischen Geometrie (Protokolle 3 und 4) ermöglicht. Nach diesen Schritten wird jede Probe dargestellt durch ~ 100K xyz-Koordinaten. Wir gehen dann durch eine Reihe von Transformationen, die alle Proben in eine gemeinsame Ausrichtung (Protokoll 5) effektiv ausrichten, dann definieren halb Sehenswürdigkeiten aus ausgerichteten Proben (Protokoll 6). Protokolle 1-4 sollte unabhängig davon, wobei das Objekt analysiert ähnlich sein. Protokoll 5 und das Protokoll 6 sind speziell für einen baculum entworfen, aber es ist unsere Hoffnung, dass diese Schritte durch Detaillierung, können die Ermittler Änderungen vorstellen, die für ihr Objekt von Interesse relevant wäre. So wurden beispielsweise Modifikationen dieser Methoden Beckenknochen und Rippenknochen ¹⁶ zu studieren Wal angewendet.

Protocol

Alle Verfahren und Personal wurden von der University of Southern California Institute for Animal Care und Use Committee (IACUC), Protokoll # 11394 zugelassen.

1. Baculum Dissection und Vorbereitung

1. Euthanize eine geschlechtsreife männliche Maus über Kohlendioxid Überbelichtung, nach Protokollen, die von der jeweiligen Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) dargelegt.
2. Legen Sie das Tier in Rückenlage, und verschleppen den Penis durch Druck mit den Daumen auf die Präputialöffnung lateral.
3. Sobald der Penis langwierig ist, das Gewebe durch die Vorhaut erstrecken so weit wie möglich.
4. Mit Schere, schneiden Sie den Penis Körper proximal zu der Eichel, wo die baculum befindet.
5. Übertragen Sie die seziert Penis zu einem 1,7 ml-Röhrchen und mit 200 & mgr; l Leitungswasser. Stellen Sie sicher, dass der Penis vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist.
6. Inkubieren des Gewebes in Wasser bei ~ 50 ° C für 3-5 Tage.
7. Platzieren Sie den sezierten baculum in ein neues Reaktionsgefäß mit der Kappe geöffnet. Lassen Kappe offen O / N Knochen austrocknen.

2. MicroCT Scanning

1. Drücken Sie eine microCT Scan zylindrischen Halter in einen Ziegel von Floristen Schaum einen Zylinder von Floristen Schaum zu erzeugen.
2. Extrahieren Sie den Zylinder von Floristen Schaum Scheiben schneiden und ~ 2-5 cm dick.
3. Push getrocknet bacula in den Floristen Schaum, um den Umfang eines einzelnen Slice Störungen zu minimieren während des Scannens. Die genaue Ausrichtung der Knochen sollte 4 in Protokoll für eine angemessene Identifizierung einzelner Proben bemerkt werden.
4. Sanft legen Sie die Scheibe mit den eingebetteten Knochen in den microCT Halter.
5. Erwerben Sie microCT Scans. Im Fall der Maus ¹⁴ bacula

3. MicroCT Verarbeitung: eine .dcm Stapel zu einem einheitlichen .xyz Datei konvertieren

HINWEIS: Jeder microCT Scan einen Stapel von .dcm erzeugt, oder "dicom", Dateien, die Bildscheiben durch das Objekt genommen repräsentieren. Alle nachgelagerten algorithmischen Geometrie erfordert flache .xyz Dateien, die einfach eine Textdatei, die vier Spalten enthält - die x-, y- und z-Koordinaten jedes Pixels und die Intensität des Pixels, von -5.000 (schwarz) bis 5000 (Weiß). Ein Pixelschwelle über 3000 funktioniert im Allgemeinen gut als Schwelle für die Definition von Knochen.

1. Installieren Sie Python (www.python.org) und die Python-Module BEFEHLE, DICOM, PYLAB, SYS und numpy.
2. Open "01_process_dicom.py "{Figshare} mit einem beliebigen Texteditor. Unter dem Abschnitt Variablen, ändern Weg, Pixelschwellen und Verzeichnisnamen wie nötig.
3. Run "Python 01_process_dicom.py". Der Fortschritt wird auf Bildschirm gedruckt werden. Innerhalb jedes Verzeichnis in Schritt namens 3.2, wird eine neue Datei gemacht benannt; zum Beispiel directory_name.PT3000.xyz, wo PT3000 die Pixelschwelle anzeigt, in Schritt 3.2 angegeben.

4. MicroCT Verarbeitung: Segmentieren-out Einzel Specimen .xyz Dateien

1. Installieren Sie R (https://www.r-project.org/) mit der Bibliothek RGL.
2. Öffnen Sie die Datei '02_segment_dicoms.r' {Figshare} mit einem beliebigen Texteditor. Unter dem Abschnitt Variablen, ändern Sie den Pfad zur Datei .xyz in Protokoll 3 oben erstellt zu zeigen.
3. Innerhalb R, führen Sie den Befehl "Quelle ( '02_segment_dicoms.r')" (ohne Anführungszeichen).
4. Nach dem dreidimensionalen Bild der .xyz Datei in Protokoll 3 erscheint erstellt, geben Sie das number von Proben in der Gesamt .xyz Datei. Dann beschriften und die Punkte aus jeder Probe wählen Sie die Scroll- und Zoom-Funktionen.
   HINWEIS: Im Hintergrund getrennt .xyz Dateien werden für jede Probe durchgeführt werden. Diese erscheinen in einem Verzeichnis mit dem Namen, zum Beispiel XYZ_FILES_PT3000, wo PT3000 gibt die Pixelschwelle verwendet.

5. "Ausrichten" Specimen .xyz Dateien auf gemeinsamen Koordinaten.

1. Öffnen Sie das Python-Skript "03_transform.py" {Figshare}, die das Zusatzmodul mattdean_modules.py {Figshare} erfordert, sowie zwei selbststehende Anwendungen: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) und "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm), die von diesem Skript verwendet werden.
2. Unter dem Abschnitt Variablen identifizieren die vollständigen Pfadnamen zu mattdean_modules.py, rotate_path und qconvex_dir. Darüber hinaus erkennen Sie den vollständigen Pfad zu dem Verzeichnis, das individuelle .xy enthältz-Dateien in Schritt 4 erstellt haben.
3. Führen Sie 03_transform.py, die pro Probe mit dem Suffix .TRANSFORMED.xyz eine neue Datei erstellt.

6. "Slicing" Aligned Specimen .xyz Dateien Halb Sehenswürdigkeiten zu identifizieren.

1. Öffnen Sie und führen Sie das Python-Skript "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. Im Abschnitt Variablen identifizieren vollständigen Pfadnamen in das Verzeichnis der .TRANSFORMED.xyz Dateien enthält. Dieses Skript identifiziert 802 semi-Wahrzeichen, die verwendet werden können, Größe und Form der Struktur zu quantifizieren.

Representative Results

Die XYZ - Koordinaten der Halb Sehenswürdigkeiten in Protokoll erzeugt 6 kann direkt in jeder Grenzstein-basierte Analyse geometrische Morphometrie ¹⁷ importiert werden. Die rechnerische Pipeline oben angewendet wurde ¹⁶ Maus bacula ¹⁴ sowie Wal Becken- und Rippenknochen zu studieren. Weitere Einzelheiten über die rechnerische Definition von Halb Sehenswürdigkeiten werden hier vorgestellt, in einem Versuch, die Forscher zu helfen, Schritte zu visualisieren, die geändert werden könnten, ihre besondere Objekt von Interesse gerecht zu werden. Die baculum enthält einige einzigartige Eigenschaften, die bestimmte Transformationen automatisieren ausgebeutet wurden. Beispielsweise nach rechnerisch den Knochen in zwei Hälften entlang einer proximal-distalen Achse schneiden, identifizierten wir die proximale Hälfte einfach durch die Gesamtzahl von Punkten zu vergleichen (der proximal hat mehr). Solange es einzigartige Features wie diese existieren, sollten unsere Methoden zu einem anpassungsfähig seinObjekt. Darüber hinaus sollte es, dass wir empirisch bestimmte Schwellenwerte, wie "10% proximal" bestimmt betont werden, dass auch in unserem baculum Studien durchgeführt, aber die meisten müssen sicherlich für andere Objekte neu bewertet werden.

Ab Protokoll 5 ist die erste Rechenschritt die konvexe Hülle (die kleinste Menge von Punkten, die alle anderen Punkte in einer Probe enthält) zu berechnen, die beiden Punkte zu identifizieren, die am weitesten voneinander entfernt sind. Diese beiden Punkte (rote Kugeln, 1C) beginnen , eine neue z-Achse (rote Linie, 1C) zu definieren , die ausgeführt wird proximal-distal durch den Knochen. In dem Fall der baculum die Hälfte der Punktwolke, die mehr Punkte enthält als das proximale Ende definiert.

Zweitens wird das gesamte Punktwolke transformiert, so daß der proximale Punkt nimmt die x, y, z-Koordinaten von 0,0,0 und der distale Punkt takes auf die x, y, z Koordinaten 0,0, + z, wobei z + einige positive Wert abhängig von der Größe des Knochens ist. Am Ende dieser Stufe wird eine z-Achse verläuft durch die Länge des Knochens. Für folgenden Verfahren wird die Länge von der minimalen bis zur maximalen z-Koordinaten bezeichnet als Zlength.

Drittens für Varianz mit der genauen Anordnung der proximalen und distalen Punkten oberhalb assoziiert zu korrigieren, die 10% am meisten proximal und 10% distalsten Punkte separat abgetastet werden (1D), ihre jeweiligen Flächenschwerpunkte identifiziert (rote Kugeln, 1E) und die Punktwolke transformiert , so dass der proximale Zentroid ist 0,0,0 und das distale Zentroid ist 0,0, + z, mit einer neuen z-Achse , die die Mitte der Probe durchläuft (rote Linie, 1E) .

Viertens ist die Punktwolke um die z-Achse gedreht wird, indem zuerst eine SLIC Einnahmee Punkte in dem proximalen 15-15,25% Zlength der Struktur (blaue Punkte, 1E). Diese Scheibe Punkte in der z - Dimension abgeflacht (dh z-Koordinaten werden einfach ignoriert), die konvexe Hülle genommen, und die minimale Begrenzungsrechteck (das kleinste Rechteck , das alle anderen Punkte enthält) berechnet. Stellen Sie sich eine Linie, die die Mittelpunkte der beiden kurzen Seiten dieser minimalen Begrenzungsrechteck zu verbinden. Wir drehen die Punktwolke, bis diese beiden Mittelpunkte -x geworden, 0, + z und + x, 0, + z jeweils damit diese Zeile wird eine neue x-Achse. Nach der Transformation werden die Distanz zwischen den maximalen und minimalen x-Werte bezeichnet als Xlength. Eine neue Datei wird von specimen.xyz zu specimen.TRANSFORMED.xyz erstellt.

Fünftens Punkte innerhalb von 1% Xlength der z-Achse in Scheiben geschnitten aus (blaue Punkte, 1F), und die einzelne proximale und einzige am weitesten distal von diesem zentralen sl identifizierten PunktEis und markierte distaler und proximaler sind. Diese sind die beiden ersten Halb Sehenswürdigkeiten identifiziert.

Sechstens 50 gleichmäßig beabstandeten Scheiben von Punkten entlang der z-Achse (rote Punkte, 1G) abgetastet. Jede Scheibe ist mit einer Dicke von 1% Zlength. Jede Scheibe wird dann in der z - Dimension abgeflacht, und zu gleichen Teilen von sieben vertikalen Linien (rote Linien, Abbildung 1H). Punkte innerhalb von 2% Xlength jeder Zeile vorhanden sind (rote Punkte, Figur 1H), dann werden die Punkte mit den maximalen und minimalen y-Koordinate gehalten werden, auf jede jeweilige Linie projiziert und ventralen und dorsalen gekennzeichnet, respectively. Darüber hinaus enthalten die Etiketten Slice - Nummer und die Zeilennummer, zum Beispiel P15_VENTRAL4 der ventrale Punkt aus der ^4. vertikalen Linie der ^15. Scheibe abgetastet wird. Wichtig ist, tritt auf einmal jeder Punkt markiert, zum Beispiel P15_VENTRAL4, und nur einmal in allen Proben, die Erhaltung entsprepondence. Zusätzlich zu den ventralen und dorsalen Punkte jeder der 7-Leitungen (14 semi-Grenzsteine ​​insgesamt), die Punkte mit den maximalen und minimalen x-Wert abgetastet und LEFT und RIGHT gekennzeichnet, respectively. Die y und z - Koordinaten von links und rechts mit der Lowess Funktion in R. geglättet Für die baculum, insgesamt 16 halbOrientierungsPunkte werden pro Scheibe (rote Kugeln, Abbildung 1H) definiert; mit 50 Scheiben plus proximaler und distaler halb Sehenswürdigkeiten oben definiert, 802 semi-Orientierungspunkte werden pro Probe (grüne Kugeln, 1I) abgetastet. Alle anderen Punkte aus dem ursprünglichen microCT Scan werden verworfen.

Es sollte angemerkt werden, dass, obwohl ventral / dorsal und proximal / distal Polarität mathematisch bestimmt wurde, wurden alle Proben Alignments wurden visuell bestätigt und manuell nach Bedarf eingestellt. In unserem Beispiel von 369 bacula etwa 10 hatte manuell eingestellt werden.

Abbildung 1: Visuelle Darstellung des Computational Workflow (Protokoll 4-6). (A) Ein Screenshot aus dem 02_segment_dicoms.r Skript (Protokoll 4), die Zuordnung von einzelnen Punktwolken zu einzelnen Proben zeigen. (B) vergrößerte Ansicht eines baculum, von einer Wolke aus ~ 100K xyz Punkte dargestellt. (C) Identifizierung der beiden Punkte am weitesten voneinander entfernt (rote Kugeln), verwendet , um eine neue z-Achse zu definieren , die ausgeführt wird proximal-distal durch den Knochen (rote Linie). (D) Abtasten der am weitesten proximal gelegenen 10% und am weitesten distal gelegenen 10% der Punkte (rote Punkte) stellt ein Mittel für geringe Varianz in der genauen Platzierung der z-Achse einzustellen. (E) die Schwerpunkte der am weitesten proximal gelegenen 10% und am weitesten distal gelegenen 10% (rote Kugeln) werden verwendet , um eine neue z-Achse (rote Linie) zu definieren. Dann fallen eine Scheibe Punkte zwischen 15,00-15,25% dieses neuen z-Achse (blaue Punkte) getroffen, um die minimale Begrenzungsrechteck zu berechnen. Die Punktwolke wird gedreht, bis die lange Seite des kleinsten begrenzenden Rechtecks ​​parallel zu einer neuen x-Achse. F) eine Scheibe Punkten entlang der Mittellinie (blaue Punkte ausgeführt wird ) abgetastet und die am meisten proximalen und distalen meisten Punkt als halbWahrZeichen definiert. G) 50 gleichmäßig verteilten Scheiben Punkte abgetastet (rote Punkte), mit H) eine solche Scheibe zeigt. 16 Punkte (rote Kreise) definiert den Umriss jeder Scheibe zu erfassen. I) Wenn in allen Scheiben wiederholt, insgesamt 802 halb Sehenswürdigkeiten (grüne Kugeln) definieren die Struktur und in allen nachfolgenden morphometrische Anwendungen eingesetzt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die kritischen Schritte in dem obigen Protokoll sind 1) sezieren die Bacula, 2) die microCT Bilder sammeln, 3) Umwandeln der microCT Ausgabe in eine flache Datei von XYZ-Koordinaten, 4) Segmentieren aus jeder Punkt Cloud Probe, 5) die Umwandlung jeder Probe zu ein standardisiertes System, und 6), die halb Sehenswürdigkeiten koordinieren. Diese Schritte werden leicht modifiziert, um verschiedene Objekte aufzunehmen.

Diese Verfahren können wahrscheinlich auf jedes Objekt angewendet werden, das im wesentlichen "stabförmig" ist, oder zumindest nicht zu gekrümmt. Objekte , die Kurve auf sich selbst zurück zu werden "u-förmigen" derzeit nicht analysiert werden, da das Schneiden (1G) würde Punkte aus verschiedenen Teilen des Objekts zurück. Solche Objekte durch rechen Begradigung des Objekts vor dem Schneiden in der Zukunft untergebracht könnte.

Wir haben ein allgemeines Verfahren zur mathematisch definieren, semi-Sehenswürdigkeiten von Formen präsentiert, s fehltolid Sehenswürdigkeiten. Diese allgemeinen Verfahren wurden modifiziert , um die Evolution der Wale Becken- und Rippenknochen ¹⁶ zu studieren, die sehr unterschiedliche Formen haben. Unsere Berechnungsmethoden für die Definition der Sehenswürdigkeiten sollte für jede Serie von XYZ-Koordinaten anwendbar sein. Wir beschäftigten microCT Scannen hier, angesichts der geringen Größe der Maus bacula ^14. Für größere Knochen, wie die Wal Becken- und Rippenknochen beschäftigten wir einen Laserscanner, die die Oberfläche der Knochen ¹⁶ rekonstruiert. Es ist wichtig, visuell alle Sätze von halb Sehenswürdigkeiten prüfen die Qualität des Verfahrens zu überprüfen. Der Hauptvorteil unserer Berechnungsverfahren ist, dass sie genau die Größe quantifizieren und Variation der Form und die Übereinstimmung zwischen unterschiedlichen Regionen des Objekts zu erhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland