Summary
많은 생물학적 구조 어려운 현대 형태 계측 학적 방법을 적용 할 수있어 쉽게 정의 최적 부족하다. 여기에서 우리는 크기를 정량화하고 변화를 형성하는 데 사용되는 세미 랜드 마크를 정의하는 계산 방법 다음 해부 및 microCT 스캔을 포함하여 마우스 음경 골 (음경의 뼈), 공부하는 방법을 설명한다.
Abstract
현대 morphometrics는 크기와 모양 변화를 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 기본 요구 사항은 랜드 마크를 정의하는 좌표의 목록입니다; 그러나 이러한 좌표는 표본에서 상동 구조를 표현해야합니다. 많은 생물학적 개체 동성의 가정을 만족시키기 쉽게 식별 최적 구성되어 있지만, 많은 그러한 구조물이 없다. 하나의 잠재적 인 솔루션은 표본에서 동일한 형태 학적 영역을 나타내는 개체에서 발생하는 세미 랜드 마크를 수학적으로하는 것입니다. 여기, 우리는 수학적으로 마우스 음경 골 (음경 뼈) 세미 랜드 마크를 정의하기 위해 최근에 개발 된 파이프 라인을 보여줍니다. 우리의 방법은 개체의 넓은 범위에 적용될 수 있어야한다.
Introduction
morphometrics의 필드 크기 및 생물 형태의 모양, 과학 탐구 1, 2, 3, 4, 5, 6에 기초하는 단계를 정량화하는 방법의 다양성을 포함한다. 전통적으로, 크기 및 형태의 통계적 분석은 생물학적 최적 구조를 식별하고 다변량 분석 워크 수 직선 거리, 각도 및 비율을 측정함으로써 시작된다. 랜드 마크 기반의 기하학적 Morphometrics 분석 및 시각화 (5)를 통해 데이터 수집에서 기하학적 정보를 보존, 랜드 마크의 공간 위치를 유지 접근 방식이다. 일반화 된 프로크루스테스 분석 (GPA)이 있어요 표본 사이의 정렬을 생산하기 위해 위치, 규모 및 랜드 마크의 회전에 변화를 제거하기 위해 적용 할 수 있습니다자신의 제곱의 차이를 inimizes - 무엇을 유지하는 형상 유사성 (7)이다.
어떤 형태 계측 학적 분석의 중요한 개념은 동성, 또는 하나가 안정적으로 표본 또는 구조 사이에 해당하는 생물학적 의미 및 이산 기능을 대표하는 랜드 마크를 식별 할 수있는 생각이다. 예를 들어, 인간의 두개골 형태 계측 학적 분석을 활성화 할 수 있습니다 상동 프로세스, foramina, 봉합 및 덕트가 있습니다. 불행히도, 대응하는 최적의 식별은 평활 표면 또는 곡선 8, 9, 10, 특히 많은 생물학적 구조 걸쳐 어렵다.
우리는 계산 기하학을 사용하여 아래이 문제를 접근. 일반적인 워크 플로는 모든이야 있도록 그 점 구름을 점 구름으로 표현 될 수있는 물체의 3 차원 스캔을 생성 한 다음 회전 변환하는 것입니다pecimens는 공통 좌표계의 방향. 그 다음 우리는 수학적 개체의 특정 지역에서 세미 랜드 마크를 정의합니다. 같은 지역에 배치 이산 세미 랜드 마크 (11) 생물학적으로 임의의 수 있습니다. 임의로 배치 랜드 마크가 생물학적으로 상동하지 않을 수 있기 때문에 GPA 이후의 통계 분석을 실시하는 것은 바람직하지 않은 유물 8, 12을 생성 할 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 반 랜드 마크가 수학적으로 "슬라이드"에 있습니다. 이 절차는 구조물과의 전위차를 최소화한다. 다른 곳에서 논의 된 바와 같이 여기에 사용되는 알고리즘 슬라이딩 부족 유사한 해부학 적 영역을 정량화하는 것이 적절하다 쉽게 최적 3, 6, 8, 10, 11, 12에 대응하는 식별. 이 방법은 리튬이mitations (13),하지만 서로 다른 크기와 모양의 객체에 적용 할 수 있어야합니다.
여기, 우리가이 방법은 마우스 음경 골 (14)의 최근 연구에 적용된 방법을 설명, 얻고 포유 동물의 진화 15시에 여러 개의 독립적 번 손실 된 음경의 뼈. 우리는 절개 특정 뼈의 제조 상기 음경 골 (프로토콜 1) microCT 이미지의 생성 (프로토콜 2) 모든 다운 스트림 계산 기하학을 가능하게하는 형식으로 이러한 이미지 변환 논의 (프로토콜 3, 4). ~ 100K의 XYZ 좌표에 의해 다음 단계 후, 각 시편 표시됩니다. 우리는 다음을 효과적으로 공통의 방향에 모든 검체 (프로토콜 5) 정렬 변환의 시리즈를 통해 도보로, 다음 정렬 표본 세미 랜드 마크 (프로토콜 6)를 정의합니다. 프로토콜 1-4에 관계없이 객체가 분석되는 유사해야합니다. 프로토콜 5 및 의정서 6 SPE 있습니다cifically 음경 골을 위해 설계,하지만이 단계를 자세히 설명하여 연구자가 관심을 자신의 객체에 대한 중요한 것 수정을 상상할 수있는 우리의 희망입니다. 예를 들면, 이러한 방법의 변형은 고래 골반 뼈와 뼈 리브 (16)를 연구하기 위해 적용 하였다.
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Protocol
모든 절차와 인원은 동물 관리 및 사용위원회 남부 캘리포니아 대학의 대학 (IACUC), 프로토콜 # 11394에 의해 승인되었다.
1. 음경 골 해부 및 준비
- 관련 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 프로토콜에 따라, 과다 노출 이산화탄소를 통해 성적으로 성숙한 수컷 마우스를 안락사.
- 앙와위에서 동물을 배치하고, 엄지 손가락은 포피 개방 측 방향으로 압력을 적용하여 음경을 뻗치다.
- 음경이 길어지면, 가능한 한 포피 통해 조직을 확장한다.
- 가위로, 음경 골이있는 귀두의 음경 몸 인접를 잘라.
- 1.7 ML의 튜브에 해부 성기를 전송하고 200 μL의 수돗물을 추가합니다. 음경이 완전히 액체에 잠긴 않았는지 확인합니다.
- 3~5일 위해 ~ 50 ° C의 물에서의 조직을 인큐베이션.
- 열린 모자와 새로운 microcentrifuge 관에 해부 음경 골을 넣습니다. 열린 O 캡 남기기 / N 뼈를 건조합니다.
2. MicroCT 스캐닝
- 꽃집 거품의 실린더를 만드는 꽃집 거품의 벽돌로 microCT 스캔 원통형 홀더를 누르십시오.
- 꽃집 거품의 실린더를 추출하고 2-5cm 두께 ~ 조각을 잘라.
- 스캔하는 동안 간섭을 최소화하기 위해 개별 조각의 주위에, 꽃집 폼에 건조 bacula을 누릅니다. 뼈의 정확한 방향은 프로토콜 4 각 시편의 적절한 식별을 가능하게 주목해야한다.
- 조심스럽게 microCT 홀더에 삽입 된 뼈 조각을 배치합니다.
- microCT 스캔을 획득. 마우스 bacula (14)의 경우,
3. MicroCT 처리 : 단일가 .xyz 파일에 .DCM 스택 변환
참고 : 각 microCT 스캔이 .DCM의 스택, 또는 "DICOM"개체를 통해 촬영 한 이미지 조각을 나타내는 파일을 생성합니다. x, y 및 각 화소의 Z 좌표와 -5,000 (검은 색)에서 5000의 범위의 화소의 강도 - 모든 다운 스트림 계산 기하학 네 개의 컬럼을 포함하는 텍스트 파일이 단순히 인 평면 .xyz 인 파일이 필요 (화이트). 3,000 위의 픽셀 임계 값은 일반적으로 뼈를 정의하기위한 임계 값으로 잘 작동합니다.
- 설치 파이썬 (www.python.org)와 파이썬 모듈 명령, DICOM, PYLAB, SYS, 그리고 NumPy와.
- 열기 "01_process_dicom.py "텍스트 편집기와 {Figshare}. 필요에 따라 변수 섹션, 변경 경로, 픽셀 임계 값 및 디렉토리 이름에서.
- "파이썬 01_process_dicom.py"를 실행합니다. 진행 화면이 출력됩니다. 단계 3.2에 지정된 각 디렉토리 내에서 새 파일의 이름은 만든되며, 예 PT3000 화소 임계치를 나타내는 directory_name.PT3000.xyz는 단계 3.2에 나타내었다.
4. MicroCT 처리 : 분단 아웃 개별 표본을 파일가 .xyz
- 라이브러리 RGL와 R을 (https://www.r-project.org/)를 설치합니다.
- 텍스트 편집기를 사용하여 파일 '02_segment_dicoms.r'{Figshare}을 엽니 다. 변수 섹션에서 위의 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일을 가리 키도록 경로 이름을 변경합니다.
- R 내에서 (따옴표없이) 명령 "소스 ( '02_segment_dicoms.r')를"실행합니다.
- 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일의 세 가지 차원 이미지 후에 나타나면 한 접점을 입력전체가 .xyz 파일에서 표본의 연구. 그런 다음 레이블과 스크롤 및 줌 기능을 사용하여 각 시편의 점을 선택합니다.
참고 : 배경에서 분리가 .xyz 파일은 각각의 시료에 대하여 설명한다. 이들은 PT3000 사용 된 픽셀 임계 값을 나타냅니다 예를 들어, XYZ_FILES_PT3000에 대해,라는 이름의 디렉토리에 나타납니다.
"정렬"5. 표본은 일반 좌표로 파일이 .xyz.
- 추가 모듈 mattdean_modules.py {Figshare}뿐만 아니라이 자립 응용 프로그램을 필요로하는 파이썬 스크립트 "03_transform.py"{Figshare}을 열고 "rotate_translate_cylindrical"(https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) 와 "qconvex"(www.qhull.org/html/qconvex.htm)이 스크립트에 의해 사용되는.
- 변수 섹션에서, rotate_path 및 qconvex_dir을 mattdean_modules.py의 전체 경로 이름을 식별합니다. 또한, 개별 xy를 들어있는 디렉토리의 전체 경로를 확인4 단계에서 만든 Z 파일.
- 접미사 .TRANSFORMED.xyz와 시편마다 새 파일을 만들어 실행 03_transform.py.
파일가 .xyz 6. "슬라이스"정렬 된 표본은 세미 랜드 마크를 확인합니다.
- 열기와 파이썬 스크립트 "04_identify_landmarks.py"를 실행 {Figshare}. 변수 섹션에서 .TRANSFORMED.xyz 파일이있는 디렉토리에 전체 경로 이름을 식별합니다. 이 스크립트는 구조의 크기 및 형상을 정량화하는데 사용될 수있다 (802) 준 최적를 식별한다.
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Representative Results
프로토콜 (6)에서 생성 된 세미 랜드 마크의 XYZ 좌표는 직접 랜드 마크 기반의 기하학적 morphometrics 분석 (17)로 가져올 수 있습니다. 연산 파이프 라인은 상기 마우스 bacula (14)뿐만 아니라 고래 골반 뼈와 리브 (16)를 연구하기 위해 적용되었다. 세미 랜드 마크의 계산 정의에 대한 자세한 내용은 연구자들이 관심을 자신의 특정 개체를 수용하기 위해 수정 될 수 있습니다 단계를 시각화하기위한 시도로, 여기에 표시됩니다. 음경 골은 특정 변환을 자동화하는 데 악용 된 몇 가지 독특한 기능이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 계산 - 근위 말단부 축을 따라 두 개의 절반으로 뼈를 절단 한 후, 우리는 단순히 총 포인트 수 (근위 더 있음)과 비교하여 근위 절반 식별. 한 이와 같은 독특한 기능이 존재하는 한, 우리의 방법은 어떤에 적용 할 수 있어야목적. 또한, 우리는 실험적 같은 우리 음경 골 연구에서 잘 수행 "10 % 기단"특정 임계 값을 결정 강조하지만 확실히 다른 목적을 위해 재평가되어야한다.
프로토콜 5부터 상기 제 1 연산 단계는 멀리 서로 떨어져있는 두 지점을 식별 볼록 선체 (샘플에서 다른 점을 포함 포인트의 최소 세트)를 계산한다. 이 두 점 (빨간 분야, 그림 1C)는 뼈를 통해 근위 - 원위부 실행하는 새로운 z 축 (빨간색 선, 그림 1C)를 정의하기 시작합니다. 음경 골의 경우에, 포인트를 더 포함하는 점 구름의 절반 기단부로 정의된다.
둘째, 전체 포인트 클라우드는 근위 점은 0,0,0의 Z 좌표와 말단 지점 t,는 x, y를 취하도록 변환+ Z는 뼈의 크기에 따라 약간의 양의 값이다 0,0, + Z의 X, Y, Z 좌표에 AKE를. 이 단계의 마지막에, Z 축 뼈의 길이를 통과한다. 이하 절차는 최대 Z 좌표에 최소의 길이 Zlength이라고한다.
셋째, 위의 확인 근위 및 원위 지점의 정확한 위치, 10 % 가장 근위 가장 먼 지점이 별도로 샘플링 10 %와 관련된 변화를 수정하기 위해 (그림 1D)는, 각각의 무게 중심 식별 (빨간색 분야를, 그림 1E) 상기 포인트 클라우드는 근위 중심은 0,0,0, 그리고 선단 중심이 시료의 중앙을 통과 새로운 Z 축으로 0,0, + Z 이도록 변화 (적색 라인,도 1E) .
넷째, 점군 먼저 SLIC을 고려하여 Z 축 중심으로 회전근위 15 15.25 %의 구조 Zlength (파란색 점, 그림 1E)의 포인트 전자. 점의이 조각은 볼록 선체 촬영 (Z 좌표가 단순히 무시됩니다 즉)은 z 차원에서 평평하고, 최소 경계 사각형 계산 (다른 모든 점을 포함하는 가장 작은 사각형). 이 최소 경계 사각형의 두 짧은면의 중간 점을 연결하는 선을 상상해보십시오. 이 두 중간 점은 -x, 0, + Z 및 + X, 0, + z는 각각, 따라서이 줄 새로운 x 축하게 될 때까지 우리는 점 구름을 돌립니다. 변환 후에는 최대 최소 X 값 사이의 거리 Xlength라고 칭한다. 새 파일이 specimen.TRANSFORMED.xyz에 specimen.xyz에서 생성됩니다.
다섯째, 내 가리키는 z 축으로이 중앙 SL에서 확인 (파란색 점, 그림 1 층), 그리고 가장 말단 가장 한 근위 및 단일 지점을 분리하는 Xlength 1 %각각 얼음과 표시 근위. 이러한 식별 처음 두 준 최적이다.
여섯째, 점 (50)은 균등하게 분할, Z 축 (적색 점,도 1G)에 따라서 샘플링된다. 각 슬라이스는 1 % Zlength의 두께이다. 각 조각은 다음 Z 차원에서 평평하고, 7 수직 라인 (레드 라인, 그림 1H)에 의해 동등하게 분할된다. 각 라인의 2 % Xlength 내 포인트 (빨간 점, 그림 1H)를 유지 한 다음 최대로 포인트를 유지 각각의 라인에 투영, 각각 복부와 지느러미를 표시하는 y 좌표 최소. 또한, 라벨 P15_VENTRAL4이 15 일 조각의 4 번째 수직선에서 샘플링 복부 점이다 예를 들어 슬라이스 번호와 행 번호가 포함되어 있습니다. 중요한 것은, 표시된 모든 지점, 예를 들어, P15_VENTRAL4는 corres을 유지, 모든 시료에서 한 번만 발생pondence. 7 라인 (14 준 최적의 전체)의 각각의 복측과 배측 점 이외에, 최대 및 최소 X 값을 가진 점을 샘플링하고, 각각 LEFT 및 RIGHT를 분류한다. 왼쪽 및 오른쪽의 y 및 z 좌표가 음경 골에 대한 R.에서 lowess 기능을 사용하여 매끄럽게, 16 세미 랜드 마크의 총 (그림 1H를 빨간색 분야)을 조각 당 정의; 50 조각 플러스 근위 위에서 정의 된 말단 세미 랜드 마크와, (802) 세미 랜드 마크 표본 당 (녹색 분야, 그림 1I)를 샘플링. 원래 microCT 스캔의 모든 다른 점은 삭제됩니다.
복부 / 지느러미와 근위 / 원위 극성 수학적 결정되었지만, 모든 시료 정렬 육안으로 확인하고, 필요에 따라 수동으로 조정한다는 것에 유의해야한다. 369 bacula의 샘플에서, 약 10 수동으로 조정해야했습니다.
그림 1 : 전산 워크 플로우 (프로토콜 4-6)의 시각적 표현. (A) 각각의 시편에 고유 한 점 구름의 할당을 보여주는 02_segment_dicoms.r 스크립트 (프로토콜 4)에서 스크린 샷. ~ 100K의 XYZ 점의 구름으로 표시 (B) 한 음경 골의 확대보기. 뼈 (레드 라인)을 통해 근위 - 원위부 실행하는 새로운 z 축을 정의하는 데 사용 멀리 떨어져 서로 (빨간 분야)에서 두 점 (C) 확인. (D)에 가장 근접 10 % 샘플링 포인트 (빨간 점)의 가장 말단의 10 %는 Z 축 정확한 위치에 약간의 편차를 조정하는 수단을 제공한다. (E) 근위 가장 10 %와 말초 - 대부분의 10 % (빨간색 분야)의 무게 중심은 새로운 z 축 (레드 라인)을 정의하는 데 사용됩니다. 그런 다음, 점의 조각 1 사이에 떨어지는이 새로운 z 축 (파란색 점)의 5.00-15.25 %는 최소 경계 사각형을 계산하기 위해 취해진 다. 점 구름은 최소 경계 사각형의 긴 변은 새로운 X 축에 평행 할 때까지 회전된다. F) 중간 선 (파란색 점을 따라 실행 점의 조각) 샘플링 및 근위 가장 원위부 가장 포인트는 세미 랜드 마크로서 정의. G) 포인트 50 균등하게 분할은 하나의 슬라이스를 나타내는 H (빨간색 점),) 샘플링. 16 점 (적색 원)의 각각의 조각의 윤곽을 포착하기 위해 정의된다. 모든 슬라이스에 걸쳐 반복되는 경우 I)이 802 준 최적 (녹색 분야의 합계)의 구조를 정의하는 모든 형태 학적 하류 어플리케이션에서 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 프로토콜의 중요한 단계는 1) bacula를 해부하고, 2) microCT 이미지를 수집, 3) XYZ의 플랫 파일에 microCT 출력을 변환, 4) 각 시편의 점 구름을 분할 좌표, 5)에 각각의 시료를 변환 표준화 좌표계, 6) 반 랜드를 형성 할 수있다. 이러한 단계는 용이하게 다른 물체를 수용하도록 수정된다.
이러한 방법은 가능성도 곡선 적어도 본질적으로 "막 대형", 또는 임의의 객체에 적용 할 수있다. 그 뒤로 그 자체에 곡선 개체 (그림 1G)를 슬라이스하는 객체의 다른 부분에서 포인트를 반환하기 때문에 "U 자형"은 현재, 분석 할 수 없습니다 될 수 있습니다. 이러한 객체는 계산 전에 슬라이스에 개체를 교정하여 미래에 수용 될 수있다.
우리의 부족 모양에서 수학적으로 정의 세미 랜드 마크에 대한 일반적인 방법을 제시올 리드 랜드 마크. 이러한 일반적인 방법은 아주 다른 모양이 고래 골반과 갈비뼈 뼈 (16)의 진화를 연구하기 위해 수정되었습니다. 정의 랜드 마크에 대한 우리의 계산 방법은 XYZ 좌표의 시리즈에 적용해야합니다. 우리는 마우스 bacula (14)의 작은 크기 지정, 여기 microCT 스캔을 사용. 이러한 고래 골반 뼈 리브와 같은 큰 뼈를 들어, 뼈 (16)의 표면을 재구성 레이저 스캐너를 이용. 이 시각에있어서의 품질을 확인하기 위해 세미 - 최적의 모든 세트를 검사하는 것이 중요하다. 우리의 계산 방법의 주요 장점은 정확한 크기를 정량화 변형을 형성하고, 대상물의 특정 영역의 대응 관계를 유지한다는 것이다.
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Acknowledgments
팀 데일리와 앤드류 스미스는 초기 일 동안 많은 유용한 계산 토론을 제공; 팀 데일리는 전산 자원이 남부 캘리포니아 대학의 고성능 컴퓨팅 클러스터가 제공 한 프로토콜 5. 필요한 프로그램 rotate_translate_cylindrical을 썼다. 이 작품은 NIH 부여 # 1 GM098536 (MDD)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissors | VWR | 470106-338 | Most sizes should work |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved | VWR | 82027-406 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | To be diluted to 70% for dissections |
| Floral Foam | Wholesale Floral | 6002-48-07 | |
| uCT50 scanner | Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland |
References
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