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Bioengineering

Disección, de exploración y morfométricos microTC Los análisis de la Baculum

Published: March 19, 2017 doi: 10.3791/55342

Summary

Muchas estructuras biológicas carecen de puntos de referencia fácilmente definibles, por lo que es difícil aplicar métodos morfométricos modernas. Aquí se ilustran métodos para estudiar la baculum ratón (un hueso en el pene), incluyendo la disección y el escaneo microCT, seguido de métodos computacionales para definir semirremolques puntos de referencia que se utilizan para cuantificar el tamaño y la forma de la variación.

Abstract

morfometría moderna proporciona potentes métodos para cuantificar la variación del tamaño y forma. Un requisito básico es una lista de coordenadas que definen puntos de referencia; Sin embargo, tales coordenadas deben representar estructuras homólogas en todos los especímenes. Mientras que muchos objetos biológicos consisten en puntos de referencia de fácil identificación para satisfacer la hipótesis de homología, muchos carecen de este tipo de estructuras. Una posible solución es matemáticamente lugar semi-hitos en un objeto que representa la misma región morfológica a través de muestras. A continuación, se expone una tubería recientemente desarrollado para definir matemáticamente semi-hitos del báculo del ratón (hueso del pene). Nuestros métodos deberían ser aplicables a una amplia gama de objetos.

Introduction

El campo de la morfometría incluye una diversidad de métodos para cuantificar el tamaño y la forma de la forma biológica, un paso fundamental en la investigación científica 1, 2, 3, 4, 5, 6. Tradicionalmente, el análisis estadístico de tamaño y forma comienza con la identificación de puntos de referencia en una estructura biológica, y luego la medición de distancias lineales, ángulos y proporciones, que podrían ser analizados en un marco multivariado. Morfometría geométrica basada en el punto de referencia es un enfoque que mantiene la posición espacial de los puntos de referencia, la preservación de la información geométrica de la colección de datos a través de análisis y visualización 5. Análisis de Procrustes Generalizado (GPA) se puede aplicar para eliminar la variación en la localización, escala y rotación de las señales para producir una alineación entre los especímenes que Minimizes sus diferencias al cuadrado - lo que queda es la forma disimilitud 7.

Un concepto importante de cualquier análisis morfométricos es homología, o la idea de que uno puede identificar con fiabilidad puntos de referencia que representan características biológicamente significativas y discretos que se corresponden entre muestras o estructuras. Por ejemplo, cráneos humanos tienen procesos homólogos, agujeros, suturas y conductos que pueden permitir a los análisis morfométricos. Desafortunadamente, la identificación de puntos de referencia correspondientes es difícil a través de muchas estructuras biológicas, especialmente aquellos con superficies lisas o curvas 8, 9, 10.

Nos acercamos a este problema a continuación, utilizando la geometría computacional. El flujo de trabajo general es generar una exploración de tres dimensiones del objeto que se puede representar como una nube de puntos, y luego girar y transformar ese punto de turbidez para que todo specimens están orientadas en un sistema de coordenadas común. Luego definimos matemáticamente semi-hitos de regiones específicas del objeto. Discretas semi-hitos colocados en dichas regiones son biológicamente arbitraria 11. La realización de GPA y los análisis estadísticos posteriores puede producir efectos indeseables 8, 12 porque hitos colocados de manera arbitraria pueden no ser biológicamente homóloga. Por lo tanto, permitimos que estos puntos de referencia para semirremolques matemáticamente "slide". Este procedimiento minimiza la diferencia de potencial entre las estructuras. Como se ha argumentado en otras partes del algoritmo de deslizamiento se utiliza aquí es apropiada para cuantificar regiones anatómicas similares que carecen de puntos de referencia de fácil identificación 3, 6, 8, 10, 11, 12 correspondiente. Estos métodos tienen su limitations 13, sino que debe ser adaptable a los objetos de diferente tamaño y forma.

A continuación, se expone cómo se aplicó este método en un estudio reciente del báculo del ratón 14, un hueso en el pene que se ha perdido y ganado varias veces durante la evolución de los mamíferos independientes 15. Se discute la disección y preparación de un hueso específico, el báculo (Protocolo 1), la generación de imágenes microCT (Protocolo 2), y la conversión de estas imágenes a un formato que permite a toda la geometría computacional aguas abajo (Protocolos 3 y 4). Después de estos pasos, cada muestra está representada por ~ 100K coordenadas xyz. luego caminamos a través de una serie de transformaciones que se alinean de manera efectiva todos los especímenes en una orientación común (Protocolo 5), para definir puntos de referencia semirremolques de especímenes alineados (Protocolo 6). Protocolos 1-4 deben ser similares independientemente de que se está analizando el objeto. Protocolo 5 y 6 son spe Protocoloficamente diseñado para un báculo, pero es nuestra esperanza de que al detallar estos pasos, los investigadores pueden imaginar modificaciones que serían relevantes para su objeto de interés. Por ejemplo, se aplicaron modificaciones de estos métodos para estudiar las ballenas huesos de la pelvis y los huesos de las costillas 16.

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Protocol

Todos los procedimientos y el personal fueron aprobados por la Universidad de Instituto del Sur de California para el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), protocolo # 11394.

1. La disección y preparación Baculum

  1. La eutanasia a un ratón macho sexualmente maduros a través de dióxido de carbono durante la exposición, de acuerdo con los protocolos establecidos por el Comité Institucional Animal relevante Cuidado y Uso (IACUC).
  2. Colocar el animal en posición supina, y prolongar el pene mediante la aplicación de presión con los pulgares lateral a la apertura del prepucio.
  3. Una vez que se prolonga el pene, extender el tejido a través del prepucio medida de lo posible.
  4. Con unas tijeras, cortar los extremos proximal del cuerpo del pene para el glande del pene donde reside el báculo.
  5. Transferir el pene disecados a un tubo de 1,7 ml y añadir agua del grifo 200 l. Asegúrese de que el pene está completamente sumergido en el líquido.
  6. Incubar el tejido en agua a ~ 50 ° C durante 3-5 días.
  7. Coloque el báculo diseccionado en un nuevo tubo de microcentrífuga con la tapa abierta. Deje la tapa abierta O / N se seque hueso.

Escaneo 2. microTC

  1. Presione un soporte de escaneado cilíndrica microCT en un ladrillo de espuma de floristería para crear un cilindro de espuma de floristería.
  2. Extraer el cilindro de espuma de floristería y cortar rodajas ~ 2-5 cm de espesor.
  3. Empuje Bacula seca en la espuma de floristería, alrededor de la periferia de una división individual para minimizar la interferencia durante el escaneado. La orientación precisa de los huesos debe hacer notar que permite la correcta identificación de las muestras individuales en el Protocolo 4.
  4. Con cuidado, coloque la rebanada con los huesos incrustados en el soporte microCT.
  5. Adquirir las exploraciones microCT. En el caso de bacula ratón 14

3. Procesamiento microTC: Conversión de una pila .dcm a un archivo individual .xyz

NOTA: Cada escaneo microCT produce una pila de .dcm, o "DICOM", archivos que representan finas imágenes tomadas a través del objeto. Toda la geometría computacional aguas abajo requiere archivos .XYZ planas, que es simplemente un archivo de texto que contiene cuatro columnas - los ejes X, Y, y Z coordenadas de cada píxel, y la intensidad del píxel, que van desde -5000 (negro) a 5000 (blanco). Un umbral de píxeles por encima de 3000 generalmente funciona bien como un umbral para definir huesos.

  1. Instalar Python (www.python.org) y los módulos de Python COMANDOS, DICOM, PYLAB, SYS, y NumPy.
  2. Abrir "01_process_dicom.py "{} Figshare con cualquier editor de texto. En la sección Variables, camino de cambio, los umbrales de pixel, y de directorios según sea necesario.
  3. Ejecutar "01_process_dicom.py pitón". El progreso se imprimen en la pantalla. Dentro de cada directorio llamado en el paso 3.2, un nuevo archivo se hace nombrado; por ejemplo, directory_name.PT3000.xyz, donde PT3000 indica el umbral de pixel indica en el paso 3.2.

4. procesamiento microTC: La segmentación de salida de muestra individual .xyz Archivos

  1. Instalar R (https://www.r-project.org/) con el RGL biblioteca.
  2. Abra el archivo '02_segment_dicoms.r' {} Figshare con cualquier editor de texto. En la sección Variables, cambiar el nombre de la ruta para que apunte al archivo creado en el Protocolo .xyz 3 anterior.
  3. Desde dentro de R, ejecute la "fuente ( '02_segment_dicoms.r')" comando (sin las comillas).
  4. Después de que la imagen tridimensional del archivo .xyz creado en el Protocolo 3 aparece, introduzca la number de los especímenes en el archivo general .xyz. A continuación, etiquetar y seleccionar los puntos de cada muestra utilizando las funciones de desplazamiento y zoom.
    NOTA: En el fondo, se harán archivos .XYZ separados para cada muestra. Estos aparecen en un directorio llamado, por ejemplo, XYZ_FILES_PT3000, donde PT3000 indica el umbral de píxeles utilizado.

5. "Alineación" Espécimen .xyz Archivos para Común Coordenadas.

  1. Abra la secuencia de comandos "03_transform.py" Python {} Figshare, lo que requiere el módulo adicional mattdean_modules.py {} Figshare, así como dos aplicaciones autónomas: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) y "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) que son utilizados por esta secuencia de comandos.
  2. En la sección Variables, identificar los nombres completos de las rutas de mattdean_modules.py, rotate_path y qconvex_dir. Además, identificar la ruta completa al directorio que contiene el individuo .xyz archivos creados en el paso 4.
  3. 03_transform.py correr, lo que crea un nuevo archivo por espécimen con el sufijo .TRANSFORMED.xyz.

6. "rebana" Espécimen Alineados .XYZ archivos para identificar Semi-hitos.

  1. Abrir y ejecutar la secuencia de comandos de Python "04_identify_landmarks.py" {} Figshare. En la sección Variables, identificar los nombres de ruta completa al directorio que contiene los archivos .TRANSFORMED.xyz. Este script identifica 802 semirremolques de puntos de referencia que pueden utilizarse para cuantificar el tamaño y la forma de la estructura.

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Representative Results

Las coordenadas XYZ de los semi-hitos producidos en el Protocolo nº 6 se pueden importar directamente en cualquier análisis de morfometría geométrica basada en el hito 17. El cálculo de tuberías anteriormente se ha aplicado para estudiar bacula ratón 14, así como de la pelvis y huesos de las costillas de ballenas 16. Más detalles sobre la definición de cálculo de semi-hitos se presentan aquí, en un intento de ayudar a los investigadores a visualizar las medidas que podrían ser modificados para adaptarse a su objetivo particular de interés. El báculo contiene varias características únicas que fueron explotadas para automatizar ciertas transformaciones. Por ejemplo, después de cortar computacionalmente el hueso en dos mitades a lo largo de un eje proximal-distal, identificamos la media proximal simplemente comparando el número total de puntos (la proximal tiene más). Mientras existen características únicas tales como esto, nuestros métodos deben ser adaptables a cualquierobjeto. Además, cabe destacar que se determinó empíricamente determinados umbrales, tales como "10% proximal", que tuvo un buen desempeño en nuestros estudios Baculum, pero sin duda necesita ser reevaluado para otros objetos.

Comenzando en el Protocolo 5, el primer paso de cálculo consiste en calcular el casco convexo (el más pequeño conjunto de puntos que contiene todos los otros puntos en una muestra) para identificar los dos puntos que estén más alejadas unas de otras. Estos dos puntos (esferas de color rojo, Figura 1C) comienzan a definir un nuevo eje z (línea roja, la Figura 1C) que se ejecuta proximal-distal a través del hueso. En el caso de la baculum, la media de la nube de puntos que contiene más puntos se define como el extremo proximal.

En segundo lugar, toda la nube de puntos se transforma de modo que el punto proximal toma la x, y, z las coordenadas de 0,0,0 y el punto distal tcopos en las x, y, z las coordenadas de 0,0, + z, donde + z es un valor positivo depende del tamaño del hueso. Al final de esta etapa, un eje Z pasa a través de la longitud del hueso. Para procedimientos a continuación, se hará referencia a la longitud desde el mínimo hasta el máximo coordenadas z como Zlength.

En tercer lugar, para corregir la varianza asociada con la colocación exacta de los puntos proximal y distal identificados anteriormente, el 10% más proximal y 10% puntos más distales son muestreadas por separado (Figura 1D), sus respectivos centroides identificado (esferas de color rojo, la Figura 1E) y la nube de puntos transformada de tal manera que el centroide proximal es 0,0,0, y el centroide distal es 0,0, + z, con un nuevo eje Z que pasa por el centro de la muestra (línea roja, la Figura 1E) .

En cuarto lugar, la nube de puntos se hace girar alrededor del eje z, tomando primero un SLICe de puntos en el proximal 15 a 15,25% Zlength de la estructura (puntos azules, Figura 1E). Este trozo de puntos es aplanada en la dimensión z (es decir, las coordenadas z son simplemente ignorados), la envolvente convexa tomado, y el rectángulo delimitador mínimo (el rectángulo más pequeño que contiene todos los demás puntos) calculado. Imagine una línea que une los puntos medios de los dos lados cortos de este rectángulo delimitador mínimo. Rotamos la nube de puntos hasta que estos dos puntos medios se convierten en x, 0, z + y + x, 0, + z, respectivamente, por lo que esta línea se convierte en un nuevo eje x. Después de la transformación, la distancia entre los valores máximos y mínimos x se conocen como Xlength. Un nuevo archivo se crea a partir de specimen.xyz specimen.TRANSFORMED.xyz.

En quinto lugar, los puntos dentro del 1% Xlength del eje z se cortó a cabo (puntos azules, Figura 1F), y el único punto más proximal y distal individual más identificados a partir de este centro slhielo y etiquetada distal y proximal, respectivamente. Estas son las primeras dos semi-hitos identificados.

Sexto, 50 rebanadas uniformemente espaciados de los puntos se muestrean a lo largo del eje z (puntos rojos, la figura 1G). Cada rebanada es un espesor de 1% Zlength. Cada rebanada se aplana a continuación, en la dimensión z, y se divide en partes iguales por 7 líneas verticales (líneas rojas, la figura 1H). Puntos dentro de 2% Xlength de cada línea se mantienen (puntos rojos, figura 1H), entonces los puntos con el máximo y mínimo coordenada y se mantienen, proyectada sobre cada línea respectiva, y se marcaron ventral y dorsal, respectivamente. Además, las etiquetas contienen el número de segmento y el número de línea, por ejemplo P15_VENTRAL4 es el punto ventral muestreada de la línea vertical de la 15ª división. Es importante destacar que cada punto marcado, por ejemplo, P15_VENTRAL4, se produce una vez y sólo una vez a través de todas las muestras, conservando corresdencia. Además de los puntos ventral y dorsal de cada una de las 7 líneas (14 semi-hitos en total), los puntos con el máximo y el mínimo valor de x se toman muestras y se marcaron izquierda y derecha, respectivamente. Las coordenadas Y y Z de izquierda y derecha se suavizan utilizando la función lowess en R. Para el báculo, se definen un total de 16 puntos de referencia semirremolques por rebanada (esferas de color rojo, la Figura 1 H); con 50 rebanadas más el proximal y distal semirremolques puntos de referencia definidos anteriormente, 802 semirremolques puntos de referencia son muestreados por espécimen (esferas verdes, Figura 1I). Todos los demás puntos de la exploración microCT originales se descartan.

Cabe señalar que aunque ventral / dorsal y proximal polaridad / distal se determinó matemáticamente, todas las alineaciones de muestras se confirmaron visualmente y ajustan manualmente según sea necesario. En nuestra muestra de 369 bacula, aproximadamente 10 tuvieron que ser ajustado manualmente.


Figura 1: Representación visual del flujo de trabajo computacional (Protocolo 4-6). (A) Una captura de pantalla de la secuencia de comandos 02_segment_dicoms.r (Protocolo 4), que muestra la asignación de las nubes de puntos distintos a los especímenes individuales. (B) Vista ampliada de un báculo, representado por una nube de puntos XYZ ~ 100K. (C) Identificación de los dos puntos más alejados entre sí (esferas de color rojo), que se utiliza para definir un nuevo eje z que se ejecuta proximal-distal a través del hueso (línea roja). (D) El muestreo de la más proximal 10% y más distal 10% de los puntos (puntos rojos) proporciona un medio para ajustar la ligera variación en la colocación exacta del eje z. (E) los centroides de los (esferas de color rojo) más proximal 10% y más distal 10% se utiliza para definir un nuevo eje z (línea roja). A continuación, una rebanada de puntos que caen entre 15,00 a 15,25% de este nuevo eje z (puntos azules) se toma para calcular el rectángulo delimitador mínimo. La nube de puntos se gira hasta que el lado largo del rectángulo delimitador mínimo es paralela a un nuevo eje x. F) una rebanada de puntos corriendo a lo largo de la línea media (puntos azules) se muestrea y la más proximal y más distal punto define como un semi-hito. G) 50 rebanadas iguales de tiempo de puntos se muestrean (puntos rojos), con H) que muestra uno de esos cortes. 16 puntos (círculos rojos) se definen para capturar el contorno de cada rebanada. I) Cuando se repite entre todos los sectores, con un total de 802 puntos de referencia (semi-esferas verdes) definen la estructura y se utilizan en todas las aplicaciones morfométricos aguas abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los pasos críticos en el protocolo anterior son: 1) la disección de la Bacula, 2) la recopilación de las imágenes microCT, 3) convertir la salida microCT en un archivo plano de coordenadas XYZ, 4) la segmentación de salir del punto de enturbiamiento de cada espécimen, 5) la transformación de cada muestra a un normalizado sistema de coordenadas, y 6) la definición de semi-hitos. Estos pasos se modifican fácilmente para adaptarse a diferentes objetos.

Estos métodos probable se pueden aplicar a cualquier objeto que al menos no es esencialmente "barra en forma de", o también curvada. Los objetos que se curvan sobre sí mismas para convertirse "en forma de U" no puede ser analizado en la actualidad, debido a rebanar (Figura 1G) volvería puntos de diferentes partes del objeto. Dichos objetos pueden ser acomodados en el futuro enderezando computacionalmente el objeto antes de rebanar.

Hemos presentado un método general para matemáticamente definitorias semirremolques puntos de referencia a partir de formas que carecen de spuntos de referencia de Olid. Estos métodos generales se han modificado para estudiar la evolución de las ballenas huesos de la pelvis y las costillas 16, que tienen formas muy diferentes. Nuestros métodos computacionales para puntos de referencia que definen deberían ser aplicables a cualquier serie de coordenadas XYZ. Empleamos la exploración microCT aquí, dado el pequeño tamaño de Bacula ratón 14. Para que los huesos más grandes, como las ballenas huesos de la pelvis y las costillas, se empleó un escáner láser que reconstruye la superficie de los huesos 16. Es importante inspeccionar visualmente todos los conjuntos de puntos de referencia semirremolques para verificar la calidad del método. La principal ventaja de nuestros métodos computacionales es que precisamente cuantificar el tamaño y forma de variación, y preservar la correspondencia entre las distintas regiones del objeto.

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Acknowledgments

Tim Daley y Andrew Smith proporcionan muchas discusiones computacionales útiles durante los primeros días; Tim Daley escribió el programa necesario para rotate_translate_cylindrical Protocolo 5. Se proporcionaron recursos computacionales por el Cluster de Computación de Alto Rendimiento de la Universidad del Sur de California. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención # GM098536 (MDD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting scissors VWR 470106-338 Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved VWR 82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube VWR 87003-294
Absolute Ethanol Fisher Scientific CAS 64-17-5 To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam Wholesale Floral 6002-48-07
uCT50 scanner  Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland

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References

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Disección, de exploración y morfométricos microTC Los análisis de la Baculum
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Schultz, N. G., Otárola-Castillo, E., Dean, M. D. Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum. J. Vis. Exp. (121), e55342, doi:10.3791/55342 (2017).

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