Summary
ここでは、主なヒト T 細胞と抗原提示細胞の間の免疫シナプスの定性・定量分析の完全なワークフローをについて説明します。メソッドは、取得および時間の比較的短い期間内に数千の細胞像の評価イメージング cytometry 流れに基づいています。
Abstract
免疫シナプスは、T 細胞と抗原提示細胞 (Apc) の間の領域です。T 細胞では、表面の受容器および安定したバインディングを保証し交換を知らせる免疫シナプスに向かって蛋白質を分極しなさい。クラシック共、全反射、または超解像顕微鏡は、免疫シナプスを研究に使用されています。これらの方法は、マニュアルの画像の獲得および時間のかかる数量を必要とするので、稀なでき事のイメージングは困難です。ここでは、セルの数万人の形態素解析を可能にするワークフローについて述べる。による免疫シナプスは、Apc として汎白血球の準備で主な T 細胞や黄色ブドウ球菌エンテロトキシン B SEB ロードらじお細胞間。画像取り込みは、フローサイトメトリー、流れの cytometer と蛍光顕微鏡の機能を組み合わせたフローで顕微鏡とも呼ばれますをイメージングで実行されます。T 細胞/APC カップルを特定して免疫シナプスを分析するための完全なゲート戦略を提供しています。このワークフローにより、免疫の解析は unpurified 汎白血球準備でシナプスし、故に血の量が少なく、必要として (すなわち, 1 mL)、それは患者からのサンプルに適用することができます。重要なは、いくつかのサンプル準備、測定、および分析できる並行。
Introduction
T 細胞は適応免疫システムの主要なレギュレータ、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) のコンテキストで提示される抗原ペプチドで活性化します。完全な T 細胞活性化は、2 つの信号を必要とする抗原特異的 T 細胞受容体 (TCR) を介して能力信号/CD3 複合体とアクセサリーの受容体を介した共刺激シグナル。両方の信号の生成は T 細胞抗原提示との直接相互作用を通じて細胞 (APCs)。成熟した Apc はペプチッド MHC 複合体を介して T 細胞活性化の能力の信号を提供し、彼らの共刺激リガンドを発現 (例, CD80 や CD86) T 細胞活性化1の進行を保証します。共刺激が引き起こすの 1 つの重要な機能は、アクチン細胞骨格2,3,4の再配置です。皮質の F-アクチンは T 細胞の休息で比較的静的です。T 細胞刺激抗原軸受 Apc によるアクチン細胞骨格の深遠な転位につながる.アクチン ・ ダイナミクス (すなわち,高速アクチン重合・脱重合円) は、たとえばタンパク質や細胞小器官の輸送に使用される力を作成する T 細胞を有効にします。また、アクチン細胞骨格は、T 細胞と Apc は、免疫シナプスと呼ばれる特別な接触領域を開発するため重要です。免疫シナプスにアクチン細胞骨格の重要性、原因は、T 細胞5,6,7,8のアクチン細胞骨格の変化を定量化する手法の開発に不可欠になっています,9。
アクチン細胞骨格の援助による表面受容体とシグナル伝達タンパク質は、免疫シナプス内の分子活性化クラスター (図形) で分離されます。アクチン細胞骨格の弾力性を高める F アクチン束に受容体の結合によって免疫シナプスの安定性が保証されます。免疫シナプス形成は適応免疫応答の生成に重要であること示されています。生体内で不完全な免疫シナプス形成の有害な影響は最初からウィスコットアルドリッチ オールドリッチ症候群 (WAS) で、どのアクチン重合の病を患っている患者で実現した、免疫シナプス形成を邪魔する付随して、10.された患者さんは、アトピー性皮膚炎、重症の再発性感染症、自己免疫疾患、黒色腫に苦しむことができます。この見つけることにもかかわらず、それは現在知られていない免疫シナプス形成が健常者および免疫の欠陥や自己免疫疾患患者の T 細胞の異なるかどうか。
超解像顕微鏡や全反射、蛍光顕微鏡、共焦点を含む免疫シナプス11,12,13,14のアーキテクチャを明らかにする使用されました。これらのシステムの高解像度と住セルイメージ投射を行う可能性は、アクチン細胞骨格の表面や細胞内タンパク質免疫シナプスの正確な時空についてのコレクションをできます。ただし、多くの結果は T 細胞の数の分析に基づいて作成します。また、蛍光顕微鏡のこれらのタイプの T 細胞は浄化されなければなりません。多くの研究の質問の unpurified セルではなく、可能な限り最高の解像度の使用は、最も重要であります。これは献血された血液の量が限られ、並列で多くのサンプルを処理する必要がある可能性がありますので、患者の T 細胞を分析する場合。
私たちは、人間システム15,16,17免疫シナプスのアクチン細胞骨格の分析を許可する顕微鏡の方法を確立しました。これらのメソッドは、フローサイトメトリー、フローで顕微鏡18とも呼ばれますをイメージングに基づいています。マルチ スペクトル流れフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡との間のハイブリッド、フローサイトメトリーをイメージングは形態学的パラメーターとから汎白血球などの異種細胞集団におけるタンパク質局在の分析に強み、末梢血。時間がかかり、高価な精製手順17を必要とせず、全血のサンプルからの人間の T 細胞の T 細胞/APC 抱合体のアクチンを定量化することを可能にする方法論を紹介しました。ここで紹介しているテクニックは、免疫シナプスの F-アクチンの定量化への血液サンプルから、ワークフロー全体を構成されています。
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Protocol
1. 汎白血球の準備
- ヘパリンの注射器、健康なドナー (または患者) から末梢血 1 mL を描画します。献血活動に責任がある倫理委員会の承認を持っていることを確認します。
- ひと末梢のミックス 1 mL と 30 mL 50 mL のチューブで ACK 換散バッファー (150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3、および 0.1 ミリメートルの EDTA、pH 7.0) の血し、室温で 8 分間インキュベートします。
- PBS と 6 分吸引清 300 × gで遠心管を埋めるし、ACK 換散バッファーの 30 mL にペレットを再懸濁します。
- 上清がクリアされるまでは、1.2 と 1.3 の手順を繰り返します。最後に、300 × gで遠心する常温で 6 分間、PBS のセルを洗浄し、培養液 (RPMI1640 + 10 %fcs) 2 mL で細胞ペレットを再懸濁します。37 ° C, 60 分で細胞を孵化させなさい。
2. らじおの読み込みは seb 細胞します。
- 1.5 x 10 と 2 つの 15 mL ファルコン管チューブあたり6らじおセルを準備します。スピン ・ ダウン (300 x g室温で 6 分の) 細胞と上澄みを廃棄します。
- 残留培地で細胞を再懸濁します (約 50-100 μ L)、1.9 μ L (1.9 μ G) を追加、SEB と 15 分追加 5 mL の培地では室温で孵化させなさい、スピン ・ ダウン (300 x g室温で 6 分間)、細胞と培地 (RPMI でペレットを再懸濁します1640 + 10 %fcs) 1 x 106セル/ml の密度で。
3. 誘導免疫シナプスとのプロトコルを汚す
- FACS チューブに SEB ロードらじお細胞の調製と別の FACS の管に荷を下されたらじお細胞の調製の 500 μ L の 500 μ L をピペットします。汎白血球の 650 μ L を各チューブとスピン ・ ダウン (室温で 10 分間 300 g x) のセルに追加します。上澄みを廃棄し、150 μ L の培養液 (RPMI1640 + 10 %fcs) でペレットを再懸濁します。(通常の 45 分) 37 ° C で孵化させなさい。
- 優しく渦セル (10 1,000 rpm で s) とセルを修正する渦の中にパラホルムアルデヒド (1.5%) 1.5 mL を加えます。1 mL の PBS + 1 %bsa を追加することによって、固定を停止します。餌の細胞 (300 x g常温、再懸濁細胞ペレットを 1 mL の PBS + 1 %bsa を 10 分間室温でインキュベート後 10 分。
- ペレット (300 × g 10 分室温で) および 100 μ L の PBS + 1 %bsa + 室温で 15 分間 0.1% サポニン セルを permeabilize の細胞を再懸濁します (96 ウェル プレート、U 字)。
- 遠心分離 (300 × g 10 分室温で) と 0.1% サポニン + 1% BSA PBS のセルを洗浄し、50 μ L の PBS + 1 %bsa + 蛍光標識抗体または化合物 (CD3-PE TxRed (1:30) を含む 0.1% サポニンで細胞ペレットを再懸濁しますPhalloidin-AF647 (1: 150)、DAPI (1:3, 000))。
- 孵化 30 分洗浄、暗所に室温でセル セル 3 回 PBS + 1 %bsa + 0.1% サポニンの 1 mL を追加することによって。室温で 10 分間 300 × gで遠心分離機します。イメージングのフローサイトメトリー用 60 μ L の PBS のセルを再再懸濁します。
4. 画像集録フローサイト
注:次のイメージ取得手順とデータ分析は、フローサイトメトリー imagestream (IS100)、インスパイアとアイデアなどのソフトウェアを使用して画像に基づいています。ただし、他の流れの cytometers および解析ソフトウェアの使用もできます。
- イメージングの流れの cytometer と初期化流体計測器メニューをクリックしてに接続されるコンピューターで解析ソフトウェアを開きます。これを行うが表示されたら右側のポートにビーズを適用します。
- /セットアップを実行をクリックして、[ファイル] メニューから既定のテンプレートを読み込みます。ビーズを表示ドロップ ダウン メニューから選択します。
- 指示値が 200 以下の場合、強度の設定をクリックしてには、明視野照明を調整します。
- キャリブレーションを実行し、すべて開始をクリックすると [アシスト] タブでルーチンをテストします。
- フラッシュ/ロック/負荷をクリックしてこれを行うが表示されたら左側のポートのサンプルを適用します。流れの cytometer 細胞をロードした後細胞分類を開くし、次のように値を調整: チャネル、ピーク強度下限 50、チャンネル 2 (DAPI) およびチャネル 5 (CD3 Pe TxR) エリアの 50 で下限の 1,022 でピーク強度の上限値チャネル 1 (側方散乱) と 1,500 を上限。
- 405 に励起レーザーのパワーを変更 nm (15 mW)、488 nm (200 mW)、647 nm (90 mW) 設定タブの。
- 細胞分類とレーザー パワーの調整を評価するセルとビーズの間表示ドロップ ダウン メニューを切り替えます。
注:すべてのセルとセルのカップルがセル表示を見つけるし、細胞塊、破片、および飽和ピクセルの画像は、細胞分類子および励起レーザー力の変更によって破片ビューで発見されてことを確認します。 - 取り込みを開始する/セットアップを実行をクリックして [セットアップ] タブでサンプルの名前と (サンプルの 15,000-25,000) と補正コントロールの 500 を取得する画像の量を定義します。
5. データの解析
- データ解析コンピューターに raw イメージ ファイル (.rif) を転送し、解析ソフトウェアを開きます。
- 補償ドロップダウンの指示に従って補償行列を生成します。補償行列を comp_Date.ctm として保存します。
- サンプル raw イメージ ファイル (.rif) を開き、補正イメージ ファイル (.cif) と既定のデータ解析ファイル (.daf) を生成するに表示されるウィンドウに comp_Date.ctm を適用します。
- 補償のイメージ ファイルを開きます。画像をカラー モードに変換し、イメージ ギャラリーのプロパティ ツールバーで最適表示色を取得するルックアップ テーブルを調整します。イメージ ギャラリーのプロパティ ツールバーの [複合] タブを使用して RGB にマージされたイメージを取得します。
-
分析] ドロップダウンからマスク マネージャーを開きます。T 細胞と免疫シナプスを次のように定義するマスクを作成します。
- T 細胞のマスクを選択:「(塗りつぶし (Threshold_Ch05、60).」バレー マスクを選択:"Valley(Ch02,3)"T 細胞シナプス マスクを選択:「T 細胞マスクとバレー (M02、Ch02、3)」
-
分析] ドロップダウンから機能マネージャーを開きます。次の機能を計算します。
- T 細胞で、合計 CD3 式の選択"Intensity_T-cells_Ch5."T 細胞におけるアクチンの合計金額、選択"Intensity_T-cells_Ch6."CD3 免疫シナプスで、式の「Intensity_T 細胞 synapse_Ch5」を選択します。免疫シナプスの F アクチン、量「Intensity_T 細胞 synapse_Ch6」を選択
- T 細胞領域を計算するには、「Area_T セル」を選択します。T 細胞免疫シナプス領域を計算するには、「Area_T 細胞シナプス」を選択
- 機能マネージャーの方程式を使用して F-アクチンおよび CD3 免疫シナプスの濃縮が決まります。
-
ヒストグラムを使用して、以下のゲーティング戦略を適用し、ドット プロット (詳細を参照してください参照 17 と 19) 分析の領域から。
- "グラデーション RMS_M2_Ch2"; ヒストグラムでプロット アウト フォーカス細胞を破棄します。15 で、しきい値を設定します。
- ドット プロットで CD3 強度対 SSC をプロットします。CD3 陽性イベントにゲートを設定します。
- M02 の「アスペクト比」のプロット (DAPI 染色) M02 部対 (Dapi 染色)。T 細胞シングレットおよびセルのゲートはそれに応じてカップルします。True セル カップル17,19を前述のようにシナプス マスクの領域を使用して修正します。
- シングレット T 細胞の T 細胞 T 細胞/APC カップルの F-アクチンの量と免疫シナプスの F-アクチンの割合を決定します。
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Representative Results
ここで説明したメソッドの主要な目的は、タンパク質濃縮の定量化 (例, F アクチン) の間の免疫シナプスの Apc (らじお細胞) と少量 (1 mL) ヒトの血液サンプルから unpurified 汎白血球の T 細胞を代理します。図 1のスクリーン ショットでは、このメソッドの重要なゲートの戦略の概要を示します。それは左と右 (図 1) の解析領域のイメージ ギャラリーを示しています。イメージ ギャラリーには、「フォーカス」ゲートが表示されます。描かれたイメージは、主に顆粒球と 2 つの T-細胞/APC カップル。F-アクチンと CD3 細胞カップル数 30272 濃縮されています。このような濃縮細胞カップルの量を定量化するゲートの戦略解析領域に表示され、プロトコルで説明されている (手順 5.8 参照) または他の17,19。最後のドット プロット解析領域で CD3 の量 (パーセントのタンパク質) が表示されます (x 軸) と F アクチン (y 軸) を免疫シナプスの。タンパク質の 30% 以上は免疫シナプス マスク内にある場合、タンパク質濃縮免疫シナプス20として考慮されました。ドット プロット含む濃縮データ (図 2 a) 典型的な最終的な結果を生成する使用されました。左の画像は、CD3 および F-アクチンの強い濃縮、右側の T 細胞/APC 抱合体が描かれているに対し免疫シナプス CD3 と F アクチンの低金額で、T 細胞/APC 抱合体のサンプル画像を示しています。免疫シナプス (% 蛋白質) で CD3 の量は、x 軸にプロットされ、免疫シナプスにおける F-アクチンの量、y 軸でプロットされます。ゲートの割合は、スーパー抗原の存在下で免疫シナプスで CD3 と F アクチンの濃縮がある T 細胞の量を表します。スーパー抗原がない場合は、T 細胞の 15% は CD3、F アクチンの免疫シナプスで濃縮を示した。スーパー抗原の存在下で 29% に増加した細胞の量。スーパー抗原の有無で CD3 濃縮 (図 2 b) または F アクチン濃縮 (図 2) の単一の数量が表示されます。これらの結果を表示、ない場合はスーパー抗原、18.3 ± 3.5% と、スーパー抗原の存在下で、細胞内アクチン総量の 34.3 ± 4.0% は免疫シナプスで蓄積されました。興味深いことに、すでにスーパー抗原 (24.6 ± 3.0 %cd3 の合計額) の添加により有意に増加したが (16.6 ± 2.1 %cd3 の合計額)、スーパー抗原の不在で CD3 の蓄積があった。このメソッドは、T 細胞と Apc の間の免疫シナプスでどのくらいのタンパク質を蓄積の定量化できます。
図 1: 汎白血球製剤の免疫シナプスの同定のための戦略をゲーティングします。ソフトウェアのスクリーン ショットを示し、SEB の存在下で Apc に共役 T 細胞の免疫シナプスの CD3 と F アクチンの栄養強化の評価のための完全な解析のワークフローが含まれています。左上のイメージ ギャラリーで画像が表示されます (Ch2 = DAPI;Ch5 = CD3-PETxR;CH6 = ファロイジン AF647;マージと Ch2、Ch5 Ch6 を含む結合されたイメージを =)。ソフトウェアは、ルックアップ テーブル、マスク表示色/グレースケールに調整する画像表示ツールバーを提供します。スクリーン ショットの右側の部分は、解析領域と分析] ツールバーを示しています。解析領域のヒストグラムが含まれているし、ドット プロット通り: 1) DAPI 染色のグラデーションの RMS の機能によるとフォーカスのセルを検索するためにヒストグラム。2) CD3 の式によると T 細胞上のゲート (Intensity_MC_Ch05、x 軸) と (Intensity_MC_Ch01、y 軸) 散布横顔。DAPI 染色 (側面 ratio_M02、y 軸) と (Intensity_MC_Ch01, x 軸) 散布横顔のアスペクト比によると潜在的な T 細胞/APC のカップルを 3) ゲーティング。4) 地域シナプス マスク (x 軸) および CD3 汚れ (y 軸) の領域によると真の T 細胞/APC カップルをゲートします。5) 濃縮によって定義される成熟した免疫シナプスのゲート (> インターフェイスで 30% 蛋白質内容) CD3 の (x 軸) と F アクチン (y 軸) を免疫シナプスの。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:免疫シナプスの CD3 と F アクチンの濃縮に流れ cytometry データをイメージングします。中心 (A) ドット プロット表示 CD3 の割合 (x 軸) と F アクチン (y 軸) を免疫シナプスの。不在 (上の部分) で成熟した免疫シナプスをもつ T 細胞/APC が抱合体やセブの存在 (下部) が描かれています。左上の画像は T 細胞/APC の CD3 と F アクチンの濃縮度の低い右側画像表示 CD3 と F アクチンの濃縮 (成熟した免疫シナプス) の高度で T 細胞/APC カップルに対しカップルします。スケール バー = 10 μ m (左下)。結果は、3 つの独立実験の代表です。(B ・ C)SEB の有無で免疫シナプスの CD3 (B) 又は (C) 由来 F アクチンはパーセントのタンパク質として表示されますを意味する (n = 3;SE)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介するワークフロー (ex vivo) 人間の T 細胞と Apc の間の免疫シナプスの定量化が可能にします。特に、赤血球によって汎白血球は不可欠である T 細胞の精製ステップを作る T 細胞ソースとして使用されました。B 細胞リンパ腫細胞株らじおは、Apc の代理として提供しています。これはそれは免疫シナプスの T 細胞側の血液ドナー間の比較を可能にするので重要な利点を負いません。さらに、自家の Dc がほとんど人間の末梢血から直接利用できます。単球由来樹状細胞 (moDCs) の生産は数日間、臨床研究への応用の挑戦を作るします。ただし、イメージング フローサイトメトリーとここで紹介する分析戦略は、他の Apc (例えば好中球, transdifferentiated)20に適用できます。また、イメージングのフローサイトメトリーを用いたマウスの ex vivo Dc9または B 細胞21と CD4 T 細胞間の免疫シナプスが評価されることが示された.したがって、このメソッドは、免疫シナプスの T 細胞側に加え APC 関数を評価するために拡大することができます。
この手法の最も重要な手順は少量で汎白血球と Apc を混合、真の免疫シナプスの損失を最小限に抑え、同時に、偽陽性のイベントを除外する正しいゲート戦略を実行します。CD3 と F アクチンの蓄積の測定について述べる、この方法はこれらの蛋白質に制限されない、LFA 117,19など、その他の表面の受容器に拡張することができます。また、T 細胞のサブグループ (例えば、, CD4, CD8, CD45RA、またはケモカインの受容体) を識別するために蛍光標識抗体添加特定免疫シナプスの表現型を表示する T 細胞の性質を探索可能になります。重要なは、このような分析に必要な血液の量は低い (最大: 1 mL)。イメージングの流れの cytometers の第一世代 (IS100)、ここで使用されるが約 100 細胞/秒、画像集録レート イメージング流れの cytometers (IsXMKII) の第三世代を可能 (最大 2,000 セル/秒の非常に高い画像取り込み速度40 × 対物を使用して)。したがって、データ分析、採血から実際のワークフローは、かなり短い期間を必要と (つまり, 1 日)。特に、提示された画像解析はイメージング フローサイトメトリーに基づいて、セルの作製と免疫シナプス (つまりワークフローの最初の部分) の誘導に適用できる他のイメージング技術の22。
フローサイトメトリーと対照をなしては、イメージングの流れ cytometry 得ドット プロットは、タンパク質発現データに加えて蛋白質のローカリゼーションに関する情報を含めます。フローサイトメトリーをイメージングの 1 つの強さは目で評価できる任意の選択したゲートのセル (またはセルのカップル)ゲートの境界は、ドットをクリックして、対応するイメージを検査によって単にそれに応じて、調整できます。実験では、30% 蛋白質濃縮濃縮興味の蛋白質を持つものとしてそれぞれのセルのカップルを考慮する信頼できる値であることがわかった。一度ゲートが最後に設定されている機能やゲートの戦略 (.ast) 別のファイルに保存され、公平な評価を保証するためにそれぞれの次のサンプルに適用することができます。
フローサイトメトリーをイメージングの弱点は解像度 (0.5 μ m 40 × 対物を使用) と、実際の制限その 1 つだけ焦点面を分析することができます。したがって、このメソッドは免疫シナプスの微細構造と発生マイクロクラ スター14の分析に適していません。免疫シナプスのような建築関連の側面を分析するよう技術を代替共焦点、全反射、または超解像顕微鏡が必要があります。イメージング フローサイトメトリーの強度は、(最大 25,000) サンプルごとに獲得できる画像の量です。とりわけ、各画像を分割すると、背景をノックアウトすること、1 つだけ孤立セルまたはセル カップル画像が通常あります。イメージング フローサイトメトリーのこれらの特徴は、単一セルのレベルの自動解析のための基礎を形成します。また、サンプルごとに分析される細胞の大量稀なでき事 (すなわち、集団または 1% 未満頻度で細胞カップル) の確実な同定を可能にします。免疫関連の病気で苦しんでいる患者から前のヴィヴォ汎白血球の T 細胞の免疫シナプス形成の研究にここに示すワークフローを適用ことができます重要なは、(,原発性免疫不全の障害など)。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
仕事で賄われていたドイツの研究議会 (DFG) 助成金で no.SFB-938-M と SA 393/3-4。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
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