Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/55345

Summary

Her beskriver vi en komplett arbeidsflyt for kvalitativ og kvantitativ analyse av immun synapser mellom primær menneskelige T-celler og antigen presentere celler. Metoden er basert på tenkelig flowcytometri, hvilke innrømmer oppkjøp og evaluering av flere tusen celle bilder i en relativt kort tidsperiode.

Abstract

Immun synapse er det kommunikasjon mellom T celler og antigen presentere celler (APCs). T celler polarize overflate reseptorer og proteiner mot immun synapse å sikre en stabil binding og signal exchange. Klassisk AC confocal, TIRF eller super-oppløsning mikroskopi har blitt brukt til å studere immun synapse. Siden disse metodene krever manuell bildeopptak og tidkrevende måling, er avbilding av sjeldne hendelser utfordrende. Her beskriver vi en arbeidsflyt som gjør morfologisk analyse av titusenvis av celler. Immun synapser er indusert mellom primær menneskelige T-celler i pan-leukocytter forberedelser og Staphylococcus aureus enterotoksin B SEB lastet Raji celler som APCs. Bildeopptak utføres med imaging flowcytometri, også kalt i flyt mikroskopi, som kombinerer funksjonene til en flyt cytometer og fluorescens mikroskop. En komplett gating strategi for å identifisere T celle/APC par og analysere de immun synapser tilbys. Som denne arbeidsflyten analyse av immun synapser i urenset pan-leukocytter forberedelser og dermed krever bare en liten mengde blod (dvs., 1 mL), den kan brukes på prøver fra pasienter. Viktigere, kan flere prøver bli forberedt, målt og analysert parallelt.

Introduction

T-celler er store regulatorer av adaptive immunsystemet og aktiveres gjennom antigen peptider som presenteres i sammenheng med store histocompatibility komplekser (MHC). Full T-celle aktivering krever to signaler, kompetanse signalet via antigen-spesifikke T-celle reseptor (TCR) / CD3 komplekse og costimulatory signalet via tilbehør reseptorer. Begge signalene blir generert gjennom direkte samspill av T-celler med antigen-presentere celler (APCs). Eldre APCs gi kompetanse signalet for T-celle aktivering gjennom MHC-peptid komplekser, og de uttrykker costimulatory ligander (f.eks, CD80 eller CD86) å sikre progresjon av T-celle aktivering1. En viktig funksjon av costimulation er omorganisering av utgangen cytoskjelett2,3,4. Den kortikale F-utgangen er forholdsvis statiske i hviler T celler. T-celle stimulering gjennom antigen-bærende APCs fører til en dyp omorganisering av utgangen cytoskeleton. Utgangen dynamics (dvs., rask begrepsordbok polymerisasjon/depolymerization sirkler) aktiverer T-celler å lage styrker som brukes til å transportere proteiner eller organeller, for eksempel. Videre er begrepsordbok cytoskeleton viktig for å utvikle en spesiell kontakt sonen mellom T celler og APCs, kalt immun synapse. På grunn av betydningen av utgangen cytoskeleton til immun synapse, har det blitt nødvendig å utvikle metoder for å kvantifisere endringer i utgangen cytoskeleton T celler5,6,7,8 , 9.

Ved utgangen cellen cytoskjelett bistand, er overflate reseptorer og signalnettverk proteiner segregerte i supramolecular aktivisering klynger (SMACs) i immun synapse. Stabiliteten av immun synapse sikres ved binding av reseptorer til F-utgangen bunter som øker elastisitet i utgangen cytoskeleton. Immun synapse dannelsen har vist seg å være kritisk for generering av adaptive immunreaksjoner. De skadelige virkningene av en defekt immun synapse formasjon i vivo var skjønte hos pasienter som lider fra Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sykdom som begrepsordbok polymerisasjon og samtidig, immun synapse formasjon er forstyrret10 . VAR pasienter kan lide av eksem, alvorlig tilbakevendende infeksjoner, autoimmune sykdommer og melanomer. Til tross for dette funnet, er det for øyeblikket ikke kjent om immun synapse formasjon er forskjellig i de T-cellene friske individer og pasienter som lider av immun defekter eller autoimmune sykdommer.

Fluorescens mikroskopi, inkludert AC confocal, TIRF og super-oppløsning mikroskopi, ble brukt til å avdekke arkitektur immun synapse11,12,13,14. Den høye oppløsningen av disse systemene og mulighet til å utføre live-celle imaging muliggjør innsamling av nøyaktig spatio-temporale informasjon om utgangen cytoskeleton og overflaten eller intracellulær proteiner i immun synapse. Mange resultater, men er basert på analyse av bare noen titalls T celler. Videre må T celler være renset for disse typer fluorescens mikroskopi. Men for mange forskning spørsmål er bruk av urenset celler i stedet for den høyest mulige oppløsningen av største betydning. Dette er relevant hvis T celler fra pasienter blir analysert, siden mengden donert blod er begrenset og det kan være behovet for mange prøver parallelt.

Vi etablert mikroskopiske metoder som tillater analyse av utgangen cytoskeleton i immun synapse i mennesket15,16,17. Disse metodene er basert på imaging flowcytometri, også kalt i flyt mikroskopi18. Som en hybrid mellom multispectral flyt cytometri og fluorescens mikroskopi, imaging flowcytometri har sin styrke i å analysere morfologiske parametere og protein lokalisering i ulike celle populasjoner, for eksempel pan-leukocytter fra den perifert blod. Vi introduserte en metode som gjør det muliggjør for oss å kvantifisere F-utgangen i T-celle/APC conjugates av menneskelige T-celler fra hele-blodprøver, uten behov for tidkrevende og kostbare rensing trinnene17. Teknikken presenteres her omfatter hele arbeidsflyten blir blodprøve for kvantifisering av F-utgangen i immun synapse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av Pan-leukocytter

  1. Trekke 1 mL av perifert blod fra en frisk donor (eller pasienten) i en heparinized sprøyte. Pass på at godkjenning av ansvarlig etikk for blod donasjon.
  2. Mix 1 mL av menneskelig perifere blod med 30 mL av ACK lyseringsbuffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3og 0,1 mM EDTA, pH 7.0) i et 50 mL rør og ruge i 8 min ved romtemperatur.
  3. Fyll rør med PBS og sentrifuge 300 x g for 6 min. leveringstanken nedbryting og resuspend pellet i 30 mL ACK lyseringsbuffer.
  4. Gjenta trinn 1.2 og 1.3 til nedbryting er klart. Til slutt, vask cellene i PBS, sentrifuge på 300 x g for 6 min i romtemperatur, og resuspend celle pellet i 2 mL kultur medium (RPMI1640 + 10% FCS). Inkuber cellene på 37 ° C for 60 min.

2. lasting av Raji celler med SEB

  1. Forberede to 15 mL Falcon rør med 1,5 x 106 Raji celler per rør. Nedspinning cellene (300 x g for 6 min ved romtemperatur) og kast nedbryting.
  2. Resuspend cellene i gjenværende medium (ca 50-100 µL), legge til 1,9 µL (1,9 µG) se, og ruge ved romtemperatur i 15 min. Legg 5 mL av kultur medium Nedspinning cellene (300 x g for 6 min ved romtemperatur) og resuspend pellet kultur medium (RPMI 1640 + 10% FCS) på en tetthet på 1 x 106 celler/mL.

3. induksjon av immun synapser og flekker protokollen

  1. Pipetter 500 µL av utarbeidelsen av SEB lastet Raji cellene i en FACS rør og 500 µL av preparatet losset Raji celler i en annen FACS rør. Legge til 650 µL av pan-leukocytter hver rør og Nedspinning cellene (300 x g i 10 min ved romtemperatur). Forkast nedbryting og resuspend pellet i 150 µL av kultur medium (RPMI1640 + 10% FCS). Ruge på 37 ° C (typisk for 45 min).
  2. Forsiktig vortex cellene (10 s på 1000 rpm) og legge til 1,5 mL paraformaldehyde (1,5%) under virvelen fikse cellene. Stopp fiksering ved å legge til 1 mL av PBS + 1% BSA. Pellets cellene (300 x g i 10 min ved romtemperatur og rørets celle pellet i 1 mL av PBS + 1% BSA etter rugende ved romtemperatur for 10 min.
  3. Pellets (300 x g i 10 min ved romtemperatur) og resuspend cellene i 100 µL av PBS + 1% BSA + 0,1% saponin i 15 min ved romtemperatur å permeabilize cellene (96-brønns plate, U-formet).
  4. Vask cellene i PBS + 1% BSA + 0,1% saponin med sentrifugering (300 x g i 10 min ved romtemperatur) og resuspend celle pellet i 50 µL av PBS + 1% BSA + 0,1% saponin som inneholder fluorophore-merket antistoffer eller forbindelser (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) og DAPI (1:3, 000)).
  5. Inkuber cellene i romtemperatur i mørket 30 min. vask cellene 3 ganger ved å legge til 1 mL av PBS + 1% BSA + 0,1% saponin. Sentrifuge på 300 x g i 10 min ved romtemperatur. Re-resuspend cellene i 60 µL av PBS for bildebehandling flowcytometri.

4. bildeopptak ved hjelp av en Flow Cytometer

Merk: Følgende bilde oppkjøpet prosedyrer og data analyse basert på imaging flowcytometri benytter programvare som imagestream (IS100), INSPIRE og ideer. Men kan andre flyt cytometers og analyse programvare også brukes.

  1. Åpne analyseprogramvare på datamaskinen koblet til tenkelig strømmen cytometer og klikk på initialisere Fluidics Instrument-menyen. Bruke perler på riktig port når bedt om å gjøre dette.
  2. Last standardmalen fra fil-menyen, og klikk på Run/oppsett. Velg perler fra Vis nedtrekksmenyen.
  3. Justere den lyse-felt illuminator ved å klikke Angi intensiteten hvis den angitte verdien er under 200.
  4. Kjør kalibrering og tester rutine i kategorien hjelpe ved å klikke på Start alle.
  5. Klikk på Flush/lås/belastning og bruke eksemplene i venstre porten når bedt om å gjøre dette. Etter lasting cellene i flyt-cytometer, åpne cellen klassifisereren og Juster verdiene som følger: topp intensitet øvre grense på 1,022 for hver kanal, topp intensitet nedre grense på 50 for kanal 2 (DAPI) og kanal 5 (CD3-Pe-TxR), området nedre grense på 50 for kanal 1 (side XY) og øvre grense på 1500.
  6. Endre eksitasjon laser makt til 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), og 647 nm (90 mW) i kategorien Oppsett.
  7. Bytte rullegardinmenyen Vis mellom celler og perler for å vurdere celle klassifiserer og laser makt justeringene.
    Merk: Kontroller at alle celler og celle par finnes visningen cellen og at cellen klumper, avfall og bilder med mettet piksler finnes i visningen rusk ved å endre celle klassifisererne og/eller eksitasjon laser krefter.
  8. Definere utvalg navnet og antall bilder å erverve (15,000-25,000 for prøver) og 500 for kompensasjon kontroller i kategorien Oppsett Klikk på Run/Setup å starte oppkjøpet.

5. analyse

  1. Overføre raw-bildefilene (.rif) data analyse datamaskinen og åpne analyseprogramvare.
  2. Produsere en kompensasjonsmatrise følge instruksjonene i kompensasjon dropdown. Lagre kompensasjonsplanen som comp_Date.ctm.
  3. Åpne en raw-bilde eksempelfil (.rif) og bruke comp_Date.ctm i vinduet kompensert bildefilene (.cif) og standard analyse datafil (.daf).
  4. Åpne kompensert bildefilen. Konverter bilder til fargemodus og justere oppslagstabeller for å få optimal synlige farger på verktøylinjen Egenskaper for bilde-galleriet. Få et RGB-sammenslått bilde ved hjelp av kategorien sammensatt verktøylinjen Egenskaper for bilde-galleriet.
  5. Åpne maske Manager fra listen for analyse. Opprette masker for å definere T-celler og immun synapse, som følger:
    1. Velg T-celle masken: "(fyll (Threshold_Ch05, 60)." Velg dalen masken: "Valley(Ch02,3)." Velg T-celle synapse masken: "T-celle maske og Valley (M02, Ch02, 3)."
  6. Åpne funksjonen Manager fra listen for analyse. Beregn følgende funksjoner:
    1. Totalt CD3 uttrykket i T-celler, velg "Intensity_T-cells_Ch5." Den totale mengden F-utgangen i T-celler, velg "Intensity_T-cells_Ch6." CD3 uttrykk i immun synapse, velg "Intensity_T-cellers synapse_Ch5." For F-utgangen i immun synapse, velg "Intensity_T-cellers synapse_Ch6."
    2. For å beregne T-celle området, velg "Area_T-celler." For å beregne T-celle immun synapse området, velg "Area_T-celle synapse."
  7. Bestemme F-utgangen og CD3 berikelse i immun synapse ved hjelp av formelen i funksjonen Manager:
    Equation
  8. Bruke følgende gating strategi ved hjelp av histogrammer og dot tomter fra analyseområdet (for flere detaljer, se referanser 17 og 19):
    1. Kast ut-av-fokus celler ved å plotte "Gradient RMS_M2_Ch2" i et histogram; Angi terskelen på 15.
    2. Tegne SSC mot CD3 intensitet i en prikk plott. Angi en port CD3-positive hendelser.
    3. Plot "Aspekt ratio" av M02 (DAPI flekk) mot området av M02 (Dapi flekk). Gate på T-celle singleter og celle par tilsvarende. Korrigere for ekte celle par bruker området synapse masken, som beskrevet tidligere17,19.
    4. Bestem hvor mye F-utgangen T-celle singleter og T celler av T-celle/APC par og prosent av F-utgangen i immun synapse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et hovedmål for metoden beskrevet her er kvantifiseringen protein berikelse (f.eks, F-utgangen) i immun synapse mellom surrogat APCs (Raji celler) og T-celler i urenset pan-leukocytter tatt fra lav-volum (1 mL) menneskelig blodprøver. Skjermbilde i figur 1 gir en oversikt over kritisk gating strategien med denne metoden. Det viser bilde-galleriet til venstre og analyseområdet til høyre (figur 1). Bildegalleriet viser "I fokus" porten. Avbildet bildene er hovedsakelig granulocytter og to T-celle/APC par. F-utgangen og CD3 er beriket i celle par nummer 30272. Gating strategien å kvantifisere mengden av cellen par med slike berikelse vises i analyseområdet og omtales i protokollen (se trinn 5,8) eller andre steder17,19. Siste dot handlingen i analyseområdet viser hvor (prosent protein) CD3 (x-aksen) og F-utgangen (y-aksen) i immun synapse. Hvis mer enn 30% av protein var lokalisert innenfor immun synapse masken, var det regnet som protein berikelse i immun synapse20. Dot tomter som inneholder berikelse data ble brukt til å produsere en typisk sluttresultatet (figur 2A). Bildene til venstre viser Bildeeksempler av T-celle/APC conjugates, med små mengder av CD3 og F-utgangen i immun synapse, mens på høyre, T-celle/APC conjugates er avbildet med en sterk anriking av CD3 og F-utgangen. Mengden av CD3 på immun synapse (prosent protein) tegnes inn på x-aksen, og hvor mye F-utgangen på immun synapse vises på y-aksen. Prosenten i porten representerer mengden av T-celler som har en berikelse av CD3 og F-utgangen på immun synapse i nærvær av en superantigen. I fravær av superantigen, 15% av de T-cellene viste en berikelse på immun synapse CD3 og F-utgangen. Mengden celler til 29% i nærvær av superantigen. En enkelt kvantifisering av CD3 berikelse (figur 2B) eller F-utgangen berikelse (figur 2C) vises i tilstedeværelse og fravær av superantigen. Disse resultatene viser at i fravær superantigen, 18.3 ± 3,5%, og i nærvær av superantigen, 34.3 ± 4,0% av totalbeløpet F-utgangen i cellene var samlet på immun synapse. Interessant, var det allerede CD3 opphopning i fravær av superantigen (16,6 ± 2,1% av totalbeløpet CD3), som var betydelig økt med tillegg av superantigen (24,6 ± 3.0% av totalbeløpet CD3). Denne metoden tillater kvantifisering av hvor mye protein er akkumuleres på immun synapse mellom T celler og pansrede.

Figure 1
Figur 1: Gating strategi for identifikasjon av immun synapser i pan-leukocytter preparater. Figuren viser et skjermbilde av programvare og inneholder en fullstendig analyse arbeidsflyt for vurdering av CD3 og F-utgangen berikelse i immun synapse av T-celler konjugert til APCs i nærvær av SEB. Bilder vises i bilde-galleriet til venstre (Ch2 = DAPI; Ch5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; og flette = kombinert bilde inneholder Ch2, Ch5 og Ch6). Programvaren gir en vise bildeverktøylinjen til å justere for oppslagstabeller, maske displayet og farge/Gråtone-modus. Høyre del av skjermbildet viser området og analyseverktøylinjen. Analyseområdet inneholder histogrammer og dot tomter som følger: 1) histogrammet finne celler i fokus etter funksjonen for gradient RMS i den DAPI flekker. 2) gating på T-celler etter uttrykket av CD3 (Intensity_MC_Ch05, x-aksen) og siden scatter profilen (Intensity_MC_Ch01, y-aksen). 3) Gating på potensielle T-celle/APC par ifølge størrelsesforholdet DAPI flekken (del ratio_M02, y) og siden scatter profilen (Intensity_MC_Ch01, x-aksen). 4) gating på sant T-celle/APC par området synapse masken (x-aksen) og området CD3 flekken (y-aksen). 5) gating på modne immunsystemet synapser definert av berikelse (> 30% proteininnhold i grensesnittet) av CD3 (x-aksen) og F-utgangen (y-aksen) i immun synapse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Imaging flyt cytometri data på CD3 og F-utgangen berikelse i immun synapse. (A) dot tomter i midten viser prosentandelen av CD3 (x-aksen) og F-utgangen (y-aksen) i immun synapse. T-celle/APC conjugates med en eldre immun synapse i fravær (overdel) eller tilstedeværelse (nederst) av SEB er avbildet. Bildene på venstre showet T-celle/APC par med lav CD3 og F-utgangen berikelse, mens bildene til høyre viser T-celle/APC par med en høy grad av CD3 og F-utgangen berikelse (modne immunsystemet synapse). Skala bar = 10 µm (nede til venstre). Resultatet er representant for tre uavhengige eksperimenter. (ABC) Mener CD3 (B) eller F-utgangen (C) berikelse i immun synapse i tilstedeværelse eller fravær av SEB vises som prosent protein (n = 3; SE). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Arbeidsflyten presenteres her gjør det mulig for kvantifisering av immun synapser mellom menneskelige T-celler (ex vivo) og pansrede. Spesielt ble røde blodlegemer-lysed pan-leukocytter brukt som T-celle kilder, gjør T-celle rensing trinnene unnværlig. B-celle lymfom celle linjen Raji servert som surrogat APCs. Dette bærer betydelige fordeler, siden det gjør sammenligninger mellom blodgivere av T-celle siden av immun synapse. Videre er autologous DCs neppe tilgjengelig direkte fra eksterne menneskeblod. Produksjonen av monocytt-avledet dendrittiske celler (moDCs) tar flere dager, noe som gjør programmet til kliniske studier utfordrende. Imidlertid kan tenkelig flowcytometri og analyse strategy presentert her brukes til andre APCs (f.eks, transdifferentiated nøytrofile)20. Videre ble det vist at immun synapse mellom CD4 T celler og ex vivo DCs9 eller B celler21 kan vurderes for mus benytter tenkelig flowcytometri. Denne metoden kan dermed være utvidet til å vurdere APC funksjon i tillegg til T-celle siden av immun synapse.

De viktigste trinnene i denne metoden er blande pan-leukocytter og APCs i små og utføre gating strategien å utelate falske positive hendelser samtidig minimere tap av ekte immun synapser. Mens vi beskrive måling av CD3 og F-utgangen akkumulering, denne metoden er ikke begrenset til disse proteinene og kan utvides til andre overflate reseptorer, som LFA-117,19. Videre ville tillegg av fluorophore-merket antistoffer til å identifisere T-celle undergrupper (f.eks, CD4, CD8, CD45RA eller chemokine reseptorer) tillate for utforskning av natur T celler viser en viss immun synapse fenotypen. Viktigere, mengden av blod som er nødvendig for slik analyse er lav (maksimalt: 1 mL). Mens den første generasjonen av tenkelig flyt cytometers, som brukes her (IS100), har gir en bilde oppkjøpet hastighet på ca 100 celler/s, tredje generasjon av imaging flyt cytometers (IsXMKII) mye høyere image oppkjøpet priser (opptil 2000 celler/s bruker en 40 x-målet). Dermed faktisk arbeidsflyten fra tegning blod data analyse, krever en betydelig kort periode (dvs., en dag). Spesielt mens presentert bilde analysen er basert på tenkelig flowcytometri, kan celle forberedelse og induksjon av immun synapser (dvs. den første delen av arbeidsflyten) brukes til andre imaging teknikker22.

I motsetning til flowcytometri inneholder bildebehandling flyt cytometri-innhentet dot tomter informasjon om protein lokalisering i tillegg protein uttrykk dataene. En styrke Imaging flowcytometri er at cellene (eller cellen par) av alle valgte port kan bli vurdert av øyet; gate grensene kan bli justert tilsvarende, ved å klikke på prikkene og inspisere tilsvarende bildet. I vår eksperimenter fant vi at 30% protein berikelse er en pålitelig verdi å vurdere de respektive celle par som protein rundt beriket. Når portene er endelig satt, funksjoner og gating strategi lagres i en egen fil (.ast) og kan brukes på hver følgende prøve å sikre en upartisk evaluering.

Svakhetene i imaging flowcytometri er begrensning i oppløsning (0,5 µm ved hjelp av en 40 x-målet) og faktum eneste fokus flyet kan analyseres. Derfor, denne metoden er ikke egnet til å analysere fine oppbygning immun synapse og forekomsten av microclusters14. Analysere slike arkitektur-relaterte aspekter av immun synapse, alternative teknikker, som AC confocal, TIRF, eller super-oppløsning mikroskopi, er nødvendig. Styrken på tenkelig flowcytometri er antall bilder som kan erverves per prøve (opptil 25.000). Spesielt, hvert bilde er segmentert, som betyr at bakgrunnen er slått ut, og det er vanligvis bare en enslig celle eller cellen par per bilde. Disse egenskapene til tenkelig flowcytometri danner grunnlaget for automatisk analyse på encellede nivå. Videre, det høye antallet celler som analyseres per prøve gir pålitelig identifikasjon av sjeldne hendelser (dvs. subpopulasjoner eller cellen par med frekvens under 1%). Viktigere, arbeidsflyten presenteres her kan brukes til studiet av immunsystemet synapse formasjon i ex vivo T-celler i pan-leukocytter fra pasienter som lider av immun-relaterte sykdommer (f.eks, primær immunsvikt lidelser).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble finansiert av tyske council (DFG) med tilskudd. SFB-938-M og SA 393/3-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
>Multifuge 3 SR Heraeus
RPMI 1640 LifeTechnologies #11875085 500 mL
FCS Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube Falcon #352054 5 mL
Kulturflasche Thermo Scientific #178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8662
Bovine Serum Albumin Roth #8076.3
Saponin Sigma S7900
Paraformaldehyde Sigma Aldrich #16005
FACS Wash Saponin PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB Sarstedt 72.699.002 0.5 mL
Speed Bead Amnis #400041
Minishaker MS1 IKA Works  MS1
Mikrotiterplatte Greiner Bio One #650101 96U
Enterotoxin SEB Sigma Aldrich S4881
DAPI Sigma Aldrich D9542 1:3000
CD3-PeTxR Invitrogen MHCD0317 1:30
Phalloidin-AF647 Molecular Probes A22287 1:150
IS100 Amnis Imaging flow cytometer
IDEAS Amnis Software
INSPIRE Amnis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 143 immun synapse flyt cytometer Iimaging flowcytometri T-celler begrepsordbok cytoskjelett menneskelig adaptive immunsystem
Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wabnitz, G., Kirchgessner, H.,More

Wabnitz, G., Kirchgessner, H., Samstag, Y. Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e55345, doi:10.3791/55345 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter