Summary
Здесь мы описываем полный рабочий процесс для качественного и количественного анализа иммунных синапсов между основной человеческий Т-клеток и антиген представляющих клеток. Метод основан на визуализации проточной цитометрии, который позволяет приобретение и оценки нескольких тысяч клеток изображений в течение относительно короткого периода времени.
Abstract
Иммунная синапса — это область коммуникации между Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР). Т-клетки поляризовывайте поверхности рецепторы и белков к иммунной СИНАПС для обеспечения стабильного привязки и сигнал обмен. Классическая конфокальный, TIRF или суперразрешением микроскопии были использованы для изучения иммунной синапсе. Поскольку эти методы требуют ручной изображения приобретение и длительным количественной оценки, изображений редких событий является сложной задачей. Здесь мы описываем рабочий процесс, который позволяет морфологический анализ десятки тысяч клеток. Иммунные синапсы наведены между первичной клетки человека T в Пан лейкоцита препаратов и золотистый стафилококк энтеротоксинов B SEB-загружен Раджи клетки как БТР. Получение изображения производится с изображений проточной цитометрии, также называется микроскопии в поток, который сочетает в себе черты проточный цитометр и флуоресцентным микроскопом. Предоставляется полный стробирования стратегию для выявления клеток T/APC пары и анализа иммунной синапсы. Как этот рабочий процесс позволяет анализ иммунной синапсов в подготовке неочищенную Пан лейкоцитов и поэтому требует лишь небольшого количества крови (т.е., 1 мл), он может применяться для образцов от пациентов. Важно отметить, что несколько образцов можно подготовлен, измеряется и проанализированы параллельно.
Introduction
Т-клетки являются основными регуляторами адаптивной иммунной системы и активируются через антигенные пептиды, которые представлены в контексте комплексов гистосовместимости (MHC). Полная активация Т-клеток требует двух сигналов, компетенции сигнал через антиген специфические Т-клеточных рецепторов (TCR) / CD3 комплекса и костимуляторных сигнала через аксессуар рецепторов. Обе сигналы генерируются путем непосредственного взаимодействия Т-клеток с антиген представляющих клеток (БТР). Зрелые БТР обеспечивают компетенции сигнал для активации Т-клеток через MHC-пептидных комплексов, и они выражают костимуляторных лигандами (например, CD80 или CD86) заверить прогрессирование Т-клеток активации1. Одной из важных функций костимуляции является перераспределение актина цитоскелета2,3,4. Корковых F-актина относительно статичной в отдыхая Т-клеток. Т-клеточная стимуляция через антиген подшипник БТР приводит к глубокой перестройки Цитоскелет актина. Актина динамика (т.е., быстро актина полимеризации/деполимеризации круги) позволяют Т-клетки для создания сил, которые используются для перевозки белки или органеллы, например. Кроме того Цитоскелет актина имеет важное значение для разработки специальной контактной зоны между Т-клеток и БТР, называется иммунной синапсе. Ввиду важности Цитоскелет актина в иммунной синапса стало необходимо разработать методы количественной оценки изменений в Цитоскелет актина T клетки5,6,,78 , 9.
С помощью актина цитоскелета помощи поверхности рецепторы и сигнализации белки подвергаются сегрегации в супрамолекулярные активации кластерах (SMACs) в пределах иммунной синапса. Стабильность иммунной синапса обеспечивается путем связывания рецепторов к F-актина расслоений, которые повышают эластичность Цитоскелет актина. Было показано, что формирование иммунной синапса иметь решающее значение для поколения адаптивного иммунного ответа. Пагубные последствия формирования дефектных иммунной синапсов в естественных условиях были впервые реализованы в пациентов, страдающих от синдром Вискотта-Олдрича синдром (WAS), заболевание в котором актина полимеризации и сопутствующе обстоятельств, нарушается формирование иммунной синапса10 . Последнее, что пациенты могут страдать от экземы, тяжелой инфекции, аутоиммунные заболевания и меланомы. Несмотря на этот вывод, в настоящее время не известно, отличается ли формирование иммунной синапсов в Т-клетки здоровых лиц и пациентов, страдающих от иммунные дефекты или аутоиммунных заболеваний.
Микроскопии флуоресцирования, включая конфокальный, TIRF и микроскопии суперразрешением, были использованы для раскрыть архитектура иммунной синапса11,12,,1314. Высокое разрешение этих систем и возможность выполнения клеток позволяет коллекции точно, пространственно временной информации о Цитоскелет актина и поверхности или внутриклеточных белков в иммунной синапсе. Многие результаты, однако, основаны на анализе лишь несколько десятков Т-клеток. Кроме того Т-клетки должны быть очищены для этих типов микроскопии флуоресцирования. Однако для многих исследований вопросов, неочищенную клетки, вместо того, чтобы резолюции максимально используется исключительно важное значение. Это актуально, если анализируются Т-клетки от пациентов, поскольку объем донорской крови, ограничен и может быть необходимость обработки множества образцов параллельно.
Мы создали микроскопические методы, которые позволяют проводить анализ Цитоскелет актина в синапсе иммунной системы человека15,16,17. Эти методы основаны на визуализации проточной цитометрии, также называется в поток микроскопии18. Как гибрид между многоспектральных потока цитометрии и флуоресцентной микроскопии, визуализации проточной цитометрии имеет свои сильные стороны в анализе морфологических параметров и локализация протеина в гетерогенных клеточных популяций, как Пан лейкоцитов из периферической крови. Мы ввели методологии, которая позволяет нам дать количественную оценку F-актина в T-клеток/APC конъюгатов человеческих клеток T пробах цельной крови, без необходимости длительной и дорогостоящей очистки шагов17. Техника, представленная здесь включает в себя весь рабочий процесс, от получения образца крови для количественной оценки F-актина в иммунной синапсе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Пан лейкоциты
- Нарисуйте 1 мл периферической крови здоровых доноров (или пациента) гепаринизированным шприца. Убедитесь в том иметь одобрение Комитетом ответственных этики донорства крови.
- Смешайте 1 мл человека периферической крови с 30 мл буфера lysis ACK (150 мм NH4Cl, 1 мм KHCO3и 0,1 мм ЭДТА, рН 7,0) в 50 мл трубки и Инкубируйте 8 мин при комнатной температуре.
- Заполнить трубы с PBS и центрифуги на 300 x g 6 мин аспирата супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 30 мл ACK буфера lysis.
- Повторите шаги с 1.2 и 1.3, до тех пор, пока супернатант ясно. Наконец вымыть клетки в PBS, центрифуги на 300 x g 6 мин при комнатной температуре и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубируйте клетки при 37 ° C 60 мин.
2. Загрузка Раджи клетки с SEB
- Подготовьте две трубы Falcon 15 мл с 1,5 х 106 клеток Раджи на трубу. Спин вниз клетки (300 x g 6 мин при комнатной температуре) и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в остаточных среднего (около 50 — 100 мкл), 1,9 мкл (1,9 мкг) SEB и инкубации при комнатной температуре 15 мин добавить 5 мл культуры среды, спина вниз клетки (300 x g 6 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте гранулы в питательной среды (RPMI 1640 + 10% FCS) при плотности 1 х 106 клеток/мл.
3. индукция иммунной синапсов и пятнать протокол
- Пипетка 500 мкл подготовки SEB-загружен Раджи клеток в трубку СУИМ и 500 мкл подготовки выгружен Раджи клетки в другую трубу СУИМ. 650 мкл Пан лейкоциты, каждой трубки и спин вниз клетки (300 x g 10 мин при комнатной температуре). Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 150 мкл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубируйте при 37 ° C (обычно за 45 мин).
- Аккуратно водоворот клетки (10 s при 1000 об/мин) и добавить 1,5 мл параформальдегида (1,5%) во время вихря исправить клетки. Остановите запись, добавив 1 мл PBS + 1% BSA. Пелле клетки (300 x g 10 мин при комнатной температуре и ресуспендирования Пелле клеток в 1 мл PBS + 1% BSA после инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Пелле (300 x g 10 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов 15 мин при комнатной температуре для разрушения клеток (96-луночных пластины, U-образный).
- Вымыть клетки в PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов с центрифугированием (300 x g 10 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов, содержащие Флюорофор, меченного антител или соединения (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) и DAPI (1:3, 000)).
- Инкубируйте клетки при комнатной температуре в темноте для 30 минут вымыть клетки 3 раза, добавив 1 мл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов. Центрифуга на 300 x g 10 мин при комнатной температуре. Re Ресуспензируйте клетки в 60 мкл PBS для визуализации проточной цитометрии.
4. образ приобретение с помощью проточный цитометр
Примечание: Следующие изображения приобретение процедуры и анализ данных основаны на визуализации проточной цитометрии с помощью программного обеспечения таких как imagestream (IS100), ВДОХНОВЛЯТЬ и идеи. Однако может также использоваться другие потока цитофлуориметрами и анализа программного обеспечения.
- Открытое программное обеспечение анализа на компьютере, подключенном к визуализации проточный цитометр и нажмите инициализировать Fluidics меню инструмента. Примените бусинки на правильный порт, когда будет предложено сделать это.
- Загрузить шаблон по умолчанию из меню "файл" и нажмите на Run/установки. Выберите бусы из ниспадающего меню Вид.
- Настройте прожектор ярко поле, нажав на установить интенсивность, если указано значение ниже 200.
- Выполните калибровку и тестирование рутины в закладке Assist, нажав на начало все.
- Нажмите на флеш/замок/загрузить и применить образцы в левый порт, когда будет предложено сделать это. После загрузки клетки в проточный цитометр, открыть ячейку классификатора и отрегулируйте значения следующим образом: пика интенсивности верхний предел в 1 022 для каждого канала, пика интенсивности нижний предел в 50 для канала 2 (DAPI) и канал 5 (CD3-Pe-TxR), район нижнего предела в 50 для канал 1 (сторона разброс) и верхний предел в 1 500.
- Изменить мощность возбуждения лазера 405 нм (15 МВт), 488 нм (200 МВт) и 647 Нм (90 МВт) на вкладке Настройка.
- Переключение в раскрывающемся меню Вид между клетками и бусы оценить клетки классификатора и лазерной мощность корректировок.
Примечание: Убедитесь, что все клетки и клетки пары находятся клетки мнение и что скопления клеток, мусора и изображения с насыщенным Пиксели находятся в представлении мусора путем изменения ячейки классификаторы и/или полномочия лазерного возбуждения. - Определите имя образца и количество изображений для приобретения (15 000 – 25 000 образцов) и 500 для компенсации элементов управления на вкладке настройки нажмите на Run/установки для запуска приобретения.
5. анализ данных
- Передача файлов изображений в формате raw (.rif) к серверу анализа данных и откройте программное обеспечение для анализа.
- Производят матрицу компенсацию следуя инструкциям раскрывающемся списке компенсации. Сохраните матрицу компенсации как comp_Date.ctm.
- Открыть пример файла raw изображений (.rif) и применить comp_Date.ctm в окне, которое появляется для получения компенсации файлов (.cif) и анализ файла данных по умолчанию (.daf).
- Откройте файл компенсируется изображения. Преобразование изображения в цветовой режим и настроить таблицы подстановки для получения оптимального видимых цветов в панели Свойства изображения галереи. Получите изображение RGB-слияние, используя вкладку композитные панели Свойства изображения галереи.
-
Откройте диспетчер маска из раскрывающегося списка анализа. Создание маски для определения Т-клеток и иммунных синапса, следующим образом:
- Выберите маску Т-клеток: «(заливка (Threshold_Ch05, 60).» Выберите маску долина: «Valley(Ch02,3).» Выберите маску синапса Т-клеток: «T-cell маска и долина (M02, Ch02, 3).»
-
Откройте диспетчер функций в раскрывающемся списке анализа. Вычислите следующие характеристики:
- Для всего выражения CD3 в Т-клеток выберите «Intensity_T-cells_Ch5.» Общее количество F-актина в Т-клеток выберите «Intensity_T-cells_Ch6.» Для выражения CD3 в иммунной синапсе выберите «Intensity_T клеточной synapse_Ch5.» На сумму F-актина в иммунной синапсе выберите «Intensity_T клеточной synapse_Ch6.»
- Чтобы вычислить площадь Т-клеток, выберите «Area_T клетки.» Чтобы вычислить площадь Т-клеток иммунной синапса, выберите «Area_T клеток синапса.»
- Определите F-актина и CD3 обогащения в иммунной синапса с помощью уравнения в Диспетчер функций:
-
Применить следующие стробирования стратегии с помощью гистограммы и точка участки от анализа области (дальнейшие подробности см ссылки 17 и 19):
- Отменить клетки вне фокуса путем построения «Градиент RMS_M2_Ch2» в гистограмме; Установите порог в 15.
- Участок SSC против CD3 интенсивности в участке точка. Установка ворот на CD3-позитивные события.
- Участок «Пропорции» M02 (DAPI пятно) против области M02 (Dapi пятно). Ворота на Майки Т-клеток и клеток пары соответственно. Исправление для пар истинный ячеек с помощью области синапсов маски, как описано ранее,17,19.
- Определите количество F-актина в майки T-клетки и Т-клетки T-клеток/APC пар и процент F-актина в иммунной синапсе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основная цель метода, описанного здесь является количественная оценка белка обогащения (например, F-миозина) в иммунной синапса между суррогатной БТР (Раджи клетки) и T-клетки в неочищенную Пан лейкоциты, взяты из образцов человеческой крови низким объемом (1 мл). Снимок экрана на рис. 1 дает обзор критических стробирования стратегии данного метода. Это показывает галерею изображений на левом и анализ области справа (рис. 1). Галерея изображений показывает ворота «В фокусе». Изображены образы являются главным образом гранулоцитов и две пары T-клеток/APC. В ячейке пара номер 30272 обогащены F-актина и CD3. Шлюзовые стратегия подсчитать количество пар клеток с такого обогащения показан в области анализа и описано в протоколе (см. шаг 5.8) или в другом месте17,19. Последний участок точка в области анализа отображает количество CD3 (процент белка) (ось x) и F-актина (ось y) в иммунной синапсе. Если более чем на 30% белка был расположен в пределах маски иммунной синапса, было рассмотрено как белка обогащения в иммунной синапса20. Точка участков содержащие обогащения, что данные были использованы для создания типичного окончательный результат (рис. 2A). Изображения слева показывает образец изображения T-клеток/APC конъюгатов, с низкой количество CD3 и F-актина в иммунной синапсе, тогда как на правом, T-клеток/APC конъюгатов изображены с сильным обогащения CD3 и F-миозина. Количество CD3 в иммунной синапса (процент белка) строится на оси x, и количество F-актина в иммунной синапса строится на оси y. Процент в ворота представляет собой количество Т-клеток, которые имеют обогащение CD3 и F-актина в иммунной синапса присутствии Суперантиген. В отсутствие Суперантиген 15% Т-клеток показали обогащение в иммунной синапса CD3 и F-актина. Количество клеток, возросло до 29% в присутствии Суперантиген. Один количественной CD3 обогащения (рис. 2B) или F-актина обогащения (рис. 2 c) показано в присутствии и отсутствии Суперантиген. Эти результаты показывают, что, в отсутствие Суперантиген, 18,3 ± 3,5% и в присутствии Суперантиген, 34.3 ± 4,0% от общего количества F-актина в клетках были накоплены в иммунной синапсе. Интересно, что было уже CD3 накопление в отсутствие Суперантиген (16,6 ± 2,1% от общего количества CD3), который был значительно увеличен путем добавления Суперантиген (24,6 ± 3,0% от общей суммы CD3). Этот метод позволяет количественная оценка сколько белков накапливается в иммунной синапса между Т-клеток и БТР.
Рисунок 1: стробирования стратегии для идентификации иммунных синапсов в Пан лейкоцита препаратов. Рисунке показана копия экрана программного обеспечения и содержит полный анализ процесса оценки CD3 и F-актина обогащения в синапсе иммунных Т-клеток, конъюгированных БТР присутствии SEB. Изображения отображаются в галерее изображений на левой стороне (СН2 = DAPI; Ch5 = CD3-PETxR; CH6 = Фаллоидин AF647; Слияние и = совмещенное изображение, содержащее Ch2, Ch5 и Ch6). Программное обеспечение предоставляет панель отображения изображений для настройки таблиц подстановки, маска экрана и режим цвет или оттенки серого. Правая часть экрана показывает область анализ и анализ инструментов. Анализ область содержит гистограммы и точка участков следующим: 1) гистограммы найти ячейки в фокусе согласно градиента функция RMS DAPI окрашивания. 2) стробирования на Т-клеток в соответствии с выражением CD3 (Intensity_MC_Ch05, ось x) и бокового профиля точечной (Intensity_MC_Ch01, ось y). 3) Gating на потенциальных пары T-клеток/APC согласно пропорции DAPI пятно (ratio_M02 аспект, ось y) и бокового профиля точечной (Intensity_MC_Ch01, ось x). 4) стробирования на истинной пары T-клеток/APC согласно области синапсов маски (ось x) и области CD3 пятно (ось y). 5) стробирования на зрелой иммунной синапсы, определяется обогащения (> 30% содержание белка в интерфейсе) из CD3 (ось x) и F-актина (ось y) в иммунной синапсе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Визуализации данных цитометрии потока на CD3 и F-актина обогащения в иммунной синапсе. Земельные участки (A) точка в центре показывают процент CD3 (ось x) и F-актина (ось y) в иммунной синапсе. T-клеток/APC конъюгатов с зрелой иммунной синапсов в отсутствие (верхняя часть) или наличие (Нижняя часть) SEB изображены. Изображения на левой шоу Т-клеток/APC пары с низкой степенью обогащения CD3 и F-актина, тогда как изображения справа отображать T-клеток/APC пара с высокой степенью обогащения CD3 и F-актина (зрелой иммунной синапса). Шкалы бар = 10 мкм (внизу слева). Результатом является представителем трех независимых экспериментов. (B-C) Значит, CD3 (B) или F-актина (C) обогащения в иммунной синапсов в наличие или отсутствие SEB показано как процент белка (n = 3; SE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Работы, представленные здесь позволяет количественная оценка иммунной синапсы человека Т-клетки (ex vivo) и БТР. В частности эритроцитов лизированы Пан лейкоциты были использованы в качестве источников Т-клеток, делает шаги очистки Т-клеточная необязательный. Линия B-клеточной лимфомы клетки Раджи служил в качестве суррогатной БТР. Это имеет значительные преимущества, поскольку она позволяет проводить сопоставления между донорами крови стороны Т-клеток иммунной синапса. Кроме того аутологичные DCs вряд ли доступны непосредственно из периферической крови человека. Производство моноцитарных дендритных клеток (moDCs) занимает несколько дней, делая сложные приложения для клинических исследований. Однако изображений проточной цитометрии и анализ стратегии, представленные здесь может применяться к другим БТР (например, transdifferentiated нейтрофилов)20. Кроме того было продемонстрировано, что иммунные синапса между CD4 Т-клеток и ex vivo DCs9 или B клетки21 может оцениваться для мышей с использованием изображений проточной цитометрии. Таким образом этот метод может быть расширена для оценки функции APC в дополнение к стороне Т-клеток иммунной синапсе.
Наиболее важные шаги этой методологии смешивания Пан лейкоциты и БТР в небольшом объеме и выполнение стробирования правильную стратегию для исключения ложных событий в то же время свести к минимуму потери истинной иммунной синапсы. В то время как мы описываем измерения накопления CD3 и F-актина, этот метод не ограничивается эти белки и может быть расширен на другие поверхности рецепторы, такие как LFA-117,19. Кроме того добавление Флюорофор, меченного антител для выявления Т-клеток подгруппы (например, CD4, CD8, CD45RA или хемокиновых рецепторов) позволит исследованию природы Т-клеток, отображение некоторых иммунной синапса фенотип. Важно отметить, что количество крови, необходимые для такого анализа является низким (максимум: 1 мл). В то время как первое поколение визуализации потока цитофлуориметрами, как здесь (IS100), имеют показатель приобретения изображений около 100 клеток/s, третье поколение визуализации потока цитофлуориметрами (IsXMKII) позволяет намного выше цены приобретения изображений (до 2 000 ячеек в секунду Используя объектив 40 x). Таким образом, фактический рабочий процесс, от рисования крови для анализа данных, требует значительно короткий период времени (т.е., один день). В частности в то время как анализ представленных изображений на основе изображений проточной цитометрии, подготовка клетки и индукции иммунной синапсов (т.е., с первой частью рабочего процесса) может применяться для других изображений техники22.
В отличие от проточной цитометрии визуализации потока получены цитометрии точка участки содержат сведения о локализации белков помимо данных выражения протеина. Одна сила воображения проточной цитометрии является, что ячейки (или ячеек пары) любой выбранной ворот могут быть оценены глаз; Ворота границ может быть отрегулирован таким образом, просто нажав на точки и инспектирования соответствующее изображение. В наших экспериментах мы обнаружили, что 30% белка обогащения представляет собой надежный значение рассмотреть соответствующие ячейки пара как имеющий протеина интереса обогащенного. Как только ворота наконец, особенности и шлюзовые стратегия сохраняются в отдельном файле (.ast) и может быть применен к каждой следующий пример для обеспечения объективной оценки.
Недостатки изображений проточной цитометрии являются ограничения в резолюции (0,5 мкм с использованием 40 x цель) и тот факт, что только одной фокальной плоскости могут быть проанализированы. Таким образом этот метод не подходит для анализа тонкой структуры иммунной синапса и возникновение microclusters14. Для анализа таких связанных с архитектурой аспекты иммунной синапса, альтернативных методов, таких, как конфокальный, TIRF, или супер-резолюции микроскопии, необходимы. Сила визуализации проточной цитометрии является количество изображений, которые могут быть приобретены на сэмпл (до 25 000). Примечательно сегментирована каждое изображение, что означает, что нокаут фон, и там обычно только одну одиночную ячейку или ячейки пара на изображение. Эти характеристики изображений проточной цитометрии основой для автоматизированного анализа на уровне одной ячейки. Кроме того большое количество клеток, которые анализируются на сэмпл позволяют для надежной идентификации редких событий (то есть, субпопуляции или пары ячеек с частотой ниже 1%). Важно отметить, что процесс, представленные здесь могут быть применены к исследования формирования иммунной синапсов в ex vivo Т-клеток в Пан лейкоциты от пациентов, страдающих от заболеваний, связанных с иммунной (например,, первичного иммунодефицита расстройства).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа финансировалась немецкого научного Совета (DFG) с грантов нет SFB-938-M и SA 393/3-4.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
