Summary
Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.
Abstract
Bağışıklık synapse T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) arasındaki iletişimi alanıdır. T hücre yüzey reseptörlerinin ve proteinler istikrarlı bir bağlama temin ve Satım sinyal için bağışıklık synapse doğru kutuplaştırmaya. Klasik confocal, TIRF veya Süper çözünürlük mikroskobu bağışıklık synapse eğitim için kullanılmıştır. El ile resim alma ve zaman alıcı miktar bu yöntemler gerektiren bu yana, nadir olayları görüntüleme meydan okuyor. Burada, on binlerce hücre morfolojik analiz sağlayan bir iş akışı açıklanmaktadır. Bağışıklık sinapslarda pan-lökosit müstahzarları birincil insan T hücreleri ve Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-yüklü Raji hücreleri arasında ZPT indüklenen vardır. Resim alma akış sitometresi özelliklerini barındıran bir akış sitometresi ve floresan mikroskop akış denetimli mikroskobu olarak da bilinir, Imaging ile gerçekleştirilir. T hücre/APC çiftler belirlenmesi ve bağışıklık sinapslarda analiz tam bir perdeleme strateji sağlanır. Bu iş akışı bağışıklık Analizi synapses unpurified pan-lökosit hazırlıkları ve dolayısıyla kan sadece küçük bir birim gerektiriyor verdiğinden (yani, 1 mL), Bu hastalardan örnekleri için uygulanabilir. Önemlisi, çeşitli örnekleri hazır, ölçülebilir ve buna paralel olarak analiz.
Introduction
T hücreleri edinilmiş bağışıklık sisteminin ana düzenleyiciler edilir ve MHC kompleksi (MHC) kapsamında sunulan antijenik peptidler aracılığıyla etkinleştirilir. Tam T Hücre aktivasyonu gerektirir iki sinyal, antijen spesifik T-hücre reseptör (TCR) üzerinden yetkinlik sinyal / CD3 kompleksi ve costimulatory sinyal aksesuar reseptörleri üzerinden. Her iki sinyali antijen sunma ile T hücrelerinin etkileşimi doğrudan aracılığıyla oluşturulan hücreler (ZPT). Olgun ZPT yetkinlik sinyal MHC-peptid kompleksi ile T Hücre aktivasyonu için sağlamak ve costimulatory ligandlar express (örneğin, CD80 veya CD86) T-hücre harekete geçirmek1ilerlemesini sağlamak için. Bir önemli costimulation düzenlenmesi aktin sitoiskeleti2,3,4fonksiyonudur. Kortikal F-aktin T hücreleri dinlenme nispeten statiktir. T-hücre stimülasyon aracılığıyla antijen-ZPT taşıyan aktin sitoiskeleti derin bir düzenlenmesi için yol açar. Aktin dynamics (yani, hızlı aktin polimerizasyon/bozulumu daireler) proteinler veya organelleri, örneğin taşıma için kullanılan kuvvetler oluşturmak T hücreleri etkinleştirin. Ayrıca, aktin sitoiskeleti T hücreleri ve bağışıklık sinaps denilen ZPT, arasında özel bir iletişim bölge geliştirmek için önemlidir. Aktin sitoiskeleti bağışıklık synapse için önemi nedeniyle, bu aktin sitoiskeleti T hücreleri5,6,7,8 değişiklikleri ölçmek için yöntemler geliştirmek için gerekli hale geldi , 9.
Aktin hücre iskeleti yardım sayesinde, bağışıklık synapse içinde (SMACs) supramolecular harekete geçirmek kümelerdeki yüzey reseptörlerinin ve sinyal proteinleri ayrılmış. Bağışıklık synapse kararlılığını reseptörleri aktin sitoiskeleti esnekliğini artırmak F-aktin paketler için bağlama tarafından güvence altına alınmıştır. Edinilmiş bağışıklık yanıtı oluşturmak için kritik olmak bağışıklık synapse oluşumu gösterilmiştir. Arızalı bağışıklık synapse oluşumu içinde vivo zararlı etkilerini ilk Wiskott Aldrich sendromu (WAS), hangi aktin polimerizasyon hastalığında gelen acı hastalarda fark ve kullanılazlar, bağışıklık synapse oluşumu rahatsız10 . Hastalar egzama, şiddetli tekrarlayan enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve melanomlar muzdarip yapıldı. Bu bulgu rağmen Şu anda sağlıklı bireyler ve hastaların acı bağışıklık kusurları veya otoimmün hastalıklar T hücrelerinde farklı bağışıklık synapse oluşumu bilinmemektedir.
Floresans mikroskobu, confocal de dahil olmak üzere, TIRF ve süper çözünürlük mikroskobu, bağışıklık synapse11,12,13,14mimarisini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bu sistemlerin yüksek çözünürlüklü ve canlı hücre görüntüleme gerçekleştirme imkanı aktin sitoiskeleti ve bağışıklık synapse yüzey veya hücre içi proteinlerin hakkında tam ve kendisinin zamansal bilgi toplama sağlar. Fazla sonuç, ancak, yalnızca birkaç on T hücrelerinin analizine dayanır. Ayrıca, T hücreleri floresan mikroskopi bu tür için saf olmalı. Ancak, birçok araştırma soruları için mümkün en yüksek çözünürlük yerine unpurified hücreleri kullanımı son derece önemlidir. Bu hastalarda T hücreleri, bağışlanan kan miktarı sınırlıdır ve paralel olarak pek çok örnekleri işlemek için gereken olabilir analiz edilir uygundur.
İnsan sistemi15,16,17bağışıklık synapse aktin sitoiskeleti analizine izin mikroskobik yöntemleri kurduk. Bu yöntemler akış sitometresi akış denetimli mikroskobu18olarak da bilinir, Imaging üzerinde temel alır. Spektral akış sitometresi ve floresan mikroskopi arasında bir melez akış sitometresi Imaging'in morfolojik parametreleri ve pan-lökosit gibi türdeş olmayan hücre popülasyonlarının protein yerelleşme analiz onun güçlü vardır periferik kan. T-hücre/APC conjugates tam kan örneklerinden, zaman alıcı ve pahalı arıtma adımları17, gerek kalmadan insan T hücrelerinin içinde F-aktin ölçmek sağlar bir metodoloji tanıttı. Burada sunulan teknik F-aktin miktar olarak bağışıklık synapse için kan örneği almak tüm iş akışı, oluşmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pan-lökosit hazırlanması
- 1 mL periferik kan heparinized bir şırıngada bir sağlıklı donör (veya hasta) çizin. Kan bağışı için sorumlu Etik Komitesi tarafından onay emin olun.
- İnsan periferik Mix 1 mL 30 mL ACK lizis arabellek (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3ve 0,1 mM EDTA, pH 7,0) 50 mL tüp ile kan ve oda sıcaklığında 8 min için kuluçkaya.
- PBS ve 6 dk. aspiratı süpernatant 300 x g , santrifüj tüpleri doldurun ve Pelet ACK lizis arabellek 30 mL resuspend.
- Süpernatant temiz 1.2 ve 1.3 tamamlayana dek. Son olarak, PBS, oda sıcaklığında 6 min için 300 x g , santrifüj hücrelerde yıkama ve hücre Pelet kültür orta (RPMI1640 + % 10 FCS) 2 mL resuspend. 60 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
2. yükleme Raji SEB ile hücreleri
- İki 15 mL Falcon tüp 1.5 x 10 ile tüp başına6 Raji hücreleri hazırlayın. Spin aşağı hücreleri (300 x g için oda sıcaklığında 6 dk) ve süpernatant atın.
- Kalan orta hücrelerde resuspend (yaklaşık 50-100 µL), 1,9 µL (1.9 µG) eklemek SEB ve 15 dakika süreyle Ekle 5 mL kültür orta oda sıcaklığında kuluçkaya, hücreleri (300 x g için oda sıcaklığında 6 dk) aşağı spin ve Pelet kültür orta (RPMI resuspend 1640 + %10 FCS), 1 x 106 hücre/mL yoğunluğu.
3. indüksiyon bağışıklık sinapslarda ve protokol boyama
- Tüp bir FACS hücrelere Raji SEB-yüklü hazırlanması ve boş Raji hücreleri hazırlık başka bir FACS tüp içine 500 µL 500 µL pipet. Pan-lökositlerin 650 µL her tüp ve (oda sıcaklığında 10 dakika 300 x g) hücreleri aşağı spin ekleyin. Süpernatant atın ve Pelet kültür orta (RPMI1640 + % 10 FCS) 150 µL içinde resuspend. (Genellikle için 45 dk) 37 ° C'de kuluçkaya.
- Yavaşça girdap hücreleri (10 s 1000 rpm) ve paraformaldehyde (% 1.5) 1,5 mL hücreleri düzeltmek için girdap sırasında ekleyin. Fiksasyonun PBS + % 1 BSA 1 mL ekleyerek durdurmak. Cips hücreleri (300 x g için oda sıcaklığında ve resuspension hücre Pelet PBS + 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka sonra % 1 BSA 1 ml 10 dak.
- Cips (300 x g için oda sıcaklığında 10 dakika) ve PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin 15 dakika oda sıcaklığında hücreleri permeabilize için 100 µL hücrelerde resuspend (96-şey plaka, U şeklinde).
- PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin Santrifüjü (300 x g için oda sıcaklığında 10 dk) ile hücrelerde yıkama ve hücre Pelet PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin fluorophore etiketli antikorlar veya bileşikler (CD3-PE-TxRed (1:30), içeren 50 µL resuspend Phalloidin-AF647 (1:150) ve DAPI (1:3, 000)).
- Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika yıkama için karanlıkta hücreleri PBS + % 1 BSA + %0,1 saponin 1 mL ekleyerek 3 kez kuluçkaya. Vasıl 300 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Re-resuspend PBS 60 µL görüntüleme akış sitometresi için hücrelerinde.
4. akış sitometresi kullanarak resim alma
Not: Aşağıdaki görüntü edinme prosedürü ve veri analizi gibi imagestream (IS100), ilham ve fikir yazılımı kullanarak akış sitometresi Imaging üzerinde temel alır. Ancak, diğer akış cytometers ve analiz yazılım de kullanılabilir.
- Açık analiz yazılımı bilgisayarda görüntüleme akış sitometresi ve tıkırtı üstünde belgili tanımlık alet yemek listesi, akışkanlar başlatmak için bağlı. Boncuk bunu yapmak isteyip istemediğiniz sorulduğunda doğru bağlantı noktası üzerinde uygulayın.
- Dosya menüsünden varsayılan şablonunu yükleme ve çalıştırma/kurulum üzerinde tıklatın. Boncuk görünümü açılır menüden seçin.
- Belirtilen değer 200 altında ise ayarla yoğunluğu üzerinde tıklatarak alan parlak ışığı ayarlayın.
- Ve başlamak tüm üzerinde tıklatarak yardımcı sekmede rutin test kalibrasyon çalıştırabilirsiniz.
- Flush/kilit/Yükle'yi tıklatın ve bunu yapmak isteyip istemediğiniz sorulduğunda sol bağlantı noktası örneklerinde uygulayın. Akış Sitometresi hücrelerde yükleme sonra hücre Sınıflandırıcısı açın ve değerlerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 1,022 her kanal, Kanal 2 için 50 en yüksek yoğunluk alt sınırı (DAPI) ve Kanal 5 (CD3-Pe-TxR), 50 için alan alt limitte için en yüksek yoğunluk üst limitte Kanal 1 (yan dağılım) ve 1.500 üst sınırı.
- Uyarma lazer güç değiştirmek için 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) ve 647 nm (90 mW) Kur sekmesinde.
- Görünüm açılır menü hücreleri ve boncuk hücre Sınıflandırıcısı ve lazer güç ayarlamaları değerlendirmek için arasında geçiş yapar.
Not: Tüm hücreleri ve hücre çiftler hücre görünümü bulunur ve hücre kümeleri, enkaz ve doymuş pikseli olan görüntüler enkaz görünümünde hücre sınıflandırıcıları ve/veya uyarma lazer güçler değiştirerek bulduğu emin olun. - Örnek adı ve (örnekler için 15.000-25.000) ve 500 tazminat denetimler için elde etmek için çekilen fotoğraf sayısının da Kur sekmesini tıklayın satın başlatmak için Çalıştır/kurulum tanımlamak için.
5. veri analizi
- Raw resim dosyaları (.rif) veri analizi bilgisayara aktarın ve analiz yazılımı açın.
- Talimatları tazminat açılan tazminat matris üretmek. Tazminat matris comp_Date.ctm kaydedin.
- Örnek bir raw resim dosyası (.rif) açın ve telafi görüntü dosyaları (.cif) ve varsayılan veri çözümleme dosyası (.daf) üretmek için görünen penceresinde comp_Date.ctm uygulayın.
- Telafi görüntü dosyasını açın. Görüntüleri renk moduna dönüştürün ve arama tabloları resim galerisi özellikleri araç çubuğunda en iyi görünür renkler elde etmek için ayarlayın. Resim galeri özellikleri araç çubuğu bileşik sekmesini kullanarak RGB birleştirilen görüntüyü elde etmek.
-
Maske Yöneticisi Analysis açılan listeden açın. T hücreleri ve bağışıklık synapse aşağıdaki gibi tanımlamak için maskeler oluşturun:
- T-hücre maske seçin: "(dolgu (Threshold_Ch05, 60)." Vadi maske seçin: "Valley(Ch02,3)." T-hücre synapse maske seçin: "T-hücre maskesi ve Valley (M02, Ch02, 3)."
-
Özellik Yöneticisi Analysis açılan listeden açın. Aşağıdaki özellikler hesaplamak:
- T hücreleri içinde toplam CD3 ifade için seçin "Intensity_T-cells_Ch5." F-aktin T hücreleri içinde toplam tutarı için "Intensity_T-cells_Ch6." seçin CD3 ifade bağışıklık synapse için seçin "Intensity_T hücreli synapse_Ch5." F-aktin miktarı için bağışıklık synapse içinde "Intensity_T-hücre synapse_Ch6." seçin
- T-hücre alanını hesaplamak için "Area_T-hücreleri." seçin T-hücre bağışıklık synapse alanını hesaplamak için "Area_T-hücre synapse." seçin
- F-aktin ve bağışıklık synapse CD3 zenginleştirme Özellik Yöneticisi'nde denklemi kullanarak belirleyin:
-
Çubuk grafikler kullanarak aşağıdaki gating strateji uygulamak ve analiz alanı (daha fazla bilgi, bkz. başvuruları 17 ve 19 için) gelen nokta çizer:
- Bir çubuk grafik; "degrade RMS_M2_Ch2" komplo tarafından odak hücreleri sil 15, eşik ayarlayın.
- Bir nokta Arsa CD3 şiddeti karşı SSC arsa. Bir kapı CD3 pozitif olayları üzerinde ayarlayın.
- "En/boy oranı" M02 Arsa (DAPI leke) M02 alan karşı (DAPI leke). T-hücre gömlek ve hücre kapısı buna göre çiftler. Synapse maskesi alan17,19daha önce açıklandığı gibi kullanarak gerçek hücre çiftler için düzeltin.
- F-aktin T hücreli gömlek ve T hücreleri T-hücre/APC çiftlerin miktarı ve F-aktin yüzdesi olarak bağışıklık synapse belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein zenginleştirme miktar önemli hedefidir burada açıklanan yöntemi (örneğin, F-aktin) arasında bağışıklık synapse içinde ZPT (Raji hücreleri) ve T hücrelerinin unpurified pan-lökosit düşük hacimli (1 mL) insan kanı örnekleri alınan vekil. Ekran görüntüsü Şekil 1 ' deki kritik gating strateji bu yöntemin genel bir bakış verir. Sol ve sağ (Şekil 1) analiz alanı resim galerisi gösterir. Resim galerisi "Odak" kapıyı gösterir. Görülen başlıca granülosit ve iki T-hücre/APC çiftler görüntülerdir. F-aktin ve CD3 30272 numaralı hücre çift zenginleştirilmiş. Hücre çiftler böyle zenginleştirme ile miktarını ölçmek için gating stratejisi analiz alanında görüntülenir ve iletişim kuralında tanımlanır (bkz. Adım 5,8) veya başka bir yerde17,19. Analiz alanı son nokta mezarlığına CD3 (yüzde protein) miktarını görüntüler (x ekseni) ve F-aktin (y ekseni) bağışıklık synapse içinde. Fazla % 30 protein bağışıklık synapse maske içinde bulunduğu olsaydı, bağışıklık synapse20protein zenginleştirme olarak kabul edildi. Nokta içeren zenginleştirme (Şekil 2A) tipik bir nihai sonucu üretmek için kullanılan veri grafiğini çizer. Sağ tarafta, T-hücre/APC conjugates CD3 ve F-aktin güçlü bir zenginlik ile tasvir edilir ise soldaki görüntü T-hücre/APC conjugates, düşük miktarlarda bağışıklık synapse CD3 ve F-aktin ile örnek görüntüleri gösterir. CD3 tutarlarında bağışıklık synapse (yüzde protein) x ekseni üzerinde çizilen ve F-aktin tutarlarında bağışıklık synapse y ekseninde çizilir. Yüzde kapısında bir superantigen huzurunda bağışıklık sinaps, CD3 ve F-aktin bir zenginlik var T hücreleri miktarını temsil eder. Superantigen yokluğunda, T hücrelerinin % yüzde 15 CD3 ve F-aktin synapse bağışıklık bir zenginlik gösterdi. %29 superantigen varlığında artan hücre miktarı. CD3 zenginleştirme (Şekil 2B) veya F-aktin zenginleştirme (Şekil 2C) tek bir miktar superantigen de gösterilir. Bu sonuçlar superantigen, %3.5 18.3 ± ve superantigen varlığında yokluğunda, hücrelerdeki toplam F-aktin miktarın % 34,3 ± 4.0 bağışıklık synapse birikmiş, göster. İlginçtir, yokluğunda CD3 birikimi superantigen (24.6 %3.0 ± Toplam CD3 miktarın) eklenmesi tarafından önemli ölçüde artış superantigen (16,6 ± % 2.1 Toplam CD3 miktarın), zaten oldu. Bu yöntem, ne kadar protein ZPT arasındaki T hücreleri bağışıklık sinaps, birikmiş miktar sağlar.
Şekil 1: pan-lökosit müstahzarları bağışıklık sinapslarda tanımlaması için strateji geçişi. Şekil a screenshot-in belgili tanımlık bilgisayar yazılımı gösterir ve bağışıklık synapse CD3 ve F-aktin zenginleştirme ZPT SEB huzurunda Birleşik T hücrelerinin değerlendirilmesi için tam analiz iş akışı içerir. Resimleri resim galerisi solda görüntülenir (Ch2 DAPI; = CH5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; ve birleştirme Ch2, Ch5 ve Ch6 içeren kombine görüntüsü =). Yazılım arama tabloları, maske görüntüleme ve renkli/gri tonlama modu ayarlamak için bir görüntü görünen araç sağlar. Analiz alanı ve çözümleme araç ekran sağ kısmını gösterir. Analiz alanı çubuk grafikler içeren ve nokta çizer gibidir: 1) Histogram odak DAPI boyama degrade RMS özelliği göre hücreleri bulmak için. 2) CD3 ifade göre T hücreleri üzerinde geçişi (Intensity_MC_Ch05, x ekseni) ve yan dağılım profil (Intensity_MC_Ch01, y ekseni). 3) Gating potansiyel T-hücre/APC çiftler en boy oranına göre DAPI leke (boy ratio_M02, y ekseni) ve yan dağılım profil (Intensity_MC_Ch01, x ekseni) üzerinde. 4) gerçek T-hücre/APC çiftler göre alan synapse maskesi (x ekseni) ve CD3 leke (y ekseni) bölgesinin üzerinde geçişi. 5) zenginleştirme tarafından tanımlanan olgun bağışıklık sinapslarda üzerinde geçişi (> % 30 protein içeriği arabiriminde), CD3 (x ekseni) ve F-aktin (y ekseni) bağışıklık synapse içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Akış sitometresi veri üzerinde bağışıklık synapse CD3 ve F-aktin zenginleştirme Imaging. (A) nokta araziler merkezi göstermek CD3 yüzdesi (x ekseni) ve F-aktin (y ekseni) bağışıklık synapse içinde. T-hücre/APC ile olgun bir bağışıklık synapse (üst kısım) yokluğunda conjugates veya SEB (alt bölüm) varlığı tasvir. T-hücre/APC çift CD3 ve F-aktin zenginleştirme (olgun bağışıklık sinaps) yüksek derecesi ile sağdaki resimleri görüntülemek ise sol göstermek görüntülerde CD3 ve F-aktin zenginleştirme, düşük bir derece ile T-hücre/APC çiftler. Ölçek çubuğu 10 µm (sol alt) =. Sonuç üç bağımsız deneyler temsilcisidir. (B-C) CD3 (B) veya bağışıklık synapse SEB olup içinde F-aktin (C) zenginleştirme yüzde protein gösterilen demek (n = 3; SE). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan iş akışı insan T hücreleri (ex vivo) ve ZPT arasında bağışıklık sinapslarda miktar sağlar. Özellikle, eritrosit lysed pan-lökosit T hücreli arıtma adımları gereksiz yapma T-hücre kaynağı olarak kullanıldı. B hücreli lenfoma hücre kültürünü Raji ZPT vekil olarak görev yaptı. Kan bağış bağışıklık synapse T hücreli tarafı arasında karşılaştırma yapmayı sağlar beri bu önemli avantajları, ayılar. Ayrıca, otolog DCs doğrudan periferik kan grubundan pek mevcuttur. Dendritik hücreler (moDCs) monosit kaynaklı üretim klinik çalışmalar uygulamaya zorlu yapma birkaç gün sürer. Ancak, görüntüleme akış sitometresi ve burada sunulan Analizi strateji diğer ZPT (örneğin, transdifferentiated nötrofiller)20' ye uygulanabilir. Ayrıca, bağışıklık synapse CD4 T hücreler arasında ve ex vivo DCs9 veya B hücreleri21 görüntüleme akış sitometresi kullanarak fareler için değerlendirilebilir gösterilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem APC işleve ek olarak bağışıklık synapse T hücreli tarafında değerlendirmek için genişletilmesi.
Bu yöntemi en önemli adımlardan pan-lökosit ve ZPT küçük bir ses karıştırma ve yanlış pozitif olaylar aynı zamanda gerçek bağışıklık sinapslarda kaybını en aza dışlamak için doğru gating strateji gerçekleştirme. Biz CD3 ve F-aktin birikimi ölçümü tarif ederken, bu yöntem bu proteinler için sınırlı değildir ve LFA-117,19gibi diğer yüzey reseptörlerinin için genişletilebilir. Ayrıca, T-hücre alt grupları (örneğin, CD4, CD8, CD45RA veya kemokin reseptörleri) tanımlamak için antikorlar fluorophore etiketli eklenmesi T hücreleri belirli bir bağışıklık synapse fenotip görüntüleme doğası arama için izin verecek. Önemlisi, böyle bir analiz için gerekli olan kan miktarı düşüktür (en fazla: 1 mL). Görüntü akışı cytometers, birinci nesil (IS100), burada kullanıldığı şekliyle varken bir resim satın alma hızı yaklaşık 100 hücreler/s, akış cytometers (özgünümMKII) görüntüleme üçüncü nesil daha yüksek görüntü edinme oranları (2.000 hücreler/s'ye sağlar. 40 x amacı istimal). Böylece, veri analizi, kan çizim üzerinden gerçek iş akışı, oldukça kısa bir süre gerektirir (yani, bir gün). Sunulan görüntü analizi üzerinde görüntüleme akış sitometresi dayalı iken, özellikle, hücre hazırlık ve bağışıklık sinapslarda (Yani, iş akışının ilk parçası) indüksiyon diğer görüntüleme teknikleri22' ye uygulanabilir.
Akış Sitometresi aksine görüntüleme akış sitometresi elde edilen nokta araziler protein yerelleştirme yanı sıra protein ifade veri hakkında bilgi içerir. Akış Sitometresi görüntüleme bir göz tarafından seçilen herhangi bir kapı hücreleri (veya hücre çiftler) değerlendirilebilir güçtür; Kapı sınırları buna göre sadece noktalar tıklayarak ve karşılık gelen görüntü teftiş ayarlanabilir. Bizim deneylerde % 30 protein zenginleştirme zenginleştirilmiş faiz protein sahip olarak ilgili hücre çift düşünün için güvenilir bir değer olduğunu fark ettik. Gates nihayet ayarladığınızda, perdeleme strateji ve özellikleri (.ast) ayrı bir dosyada kaydedilir ve tarafsız bir değerlendirme sağlamak için aşağıdaki örnekleri için uygulanabilir.
Akış Sitometresi Imaging zayıf sınırlama çözünürlük (40 x amacı istimal 0.5 µm) ve aslında çoğu tek bir odak uçağı analiz edilebilir. Bu nedenle, bu yöntem bağışıklık synapse güzel yapısını ve microclusters14oluşumunu çözümlemek uygun değildir. Bağışıklık synapse mimarisi ile ilgili böyle yönlerini analiz etmek gibi teknikleri, alternatif confocal, TIRF, ya da süper çözünürlük mikroskobu, ihtiyaç vardır. Görüntüleme akış sitometresi (kadar 25.000) örnek başına elde edilebilir çekilen fotoğraf sayısının gücüdür. Özellikle arka elendikçe yani her görüntüyü parçalara ve genellikle tek tek hücre veya hücre çift resim başına yoktur. Bu özellikleri görüntüleme akış sitometresi tek hücre düzeyinde otomatik analiz temelini oluşturur. Ayrıca, örnek analiz hücreleri yüksek miktarda nadir Olaylar (yani, altgrupları ya da hücre çiftler ile bir frekans % 1 aşağıda) güvenilir tanımlanması için izin verir. Önemlisi, burada sunulan iş akışı bağışıklık sinaps oluşumunda ex vivo T-hücreleri pan-lökosit içinde çalışmanın bağışıklık ile ilgili hastalıklardan muzdarip hastalarda uygulanabilir (örneğin, birincil bağışıklık bozuklukları).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
İşi Alman Araştırma Konseyi (DFG) tarafından hibe ile No finanse edildi SFB-938-M ve SA 393/3-4.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
