Summary
在这里, 我们描述了一个完整的工作流程, 用于定性和定量分析免疫突触之间的原代人类 t 细胞和抗原呈现细胞。该方法基于成像流式细胞仪, 允许在相对较短的时间内采集和评估数千张细胞图像。
Abstract
免疫突触是 t 细胞与抗原表达细胞 (apc) 之间的交流区域。t 细胞将表面受体和蛋白质向免疫突触极化, 以确保稳定的结合和信号交换。经典共聚焦、tirf 或超分辨显微镜已被用于研究免疫突触。由于这些方法需要手动图像采集和耗时的量化, 因此对罕见事件的成像具有挑战性。在这里, 我们描述了一个工作流, 它可以对数万个单元格进行形态分析。泛白细胞制剂中的原代人 t 细胞与负载为 apc的金黄色葡萄球菌肠毒素 b (seb) 之间诱导免疫突触。图像采集是通过成像流式细胞仪 (也称为流内显微镜) 进行的, 它结合了流式细胞仪和荧光显微镜的特征。为识别 t 细胞 apc 夫妇和分析免疫突触提供了一种完整的门控策略。由于此工作流程允许分析未纯化的泛白细胞制剂中的免疫突触, 因此只需要少量血液 (即1毫升),因此它可以应用于患者的样本。重要的是, 可以同时制备、测量和分析多个样品。
Introduction
t 细胞是自适应免疫系统的主要调节剂, 并通过抗原肽激活, 这些肽是在主要组织相容性复合物 (mhc) 的背景下出现的。全 t 细胞激活需要两个信号, 即通过抗原特异性 t 细胞受体 (TCR)/CD3 复合体的能力信号和通过辅助受体的共刺激信号。这两个信号都是通过 t 细胞与抗原呈现细胞 (apc) 的直接相互作用产生的。成熟的 apc 通过 mhc-肽复合物提供 t 细胞活化的能力信号, 它们表达共刺激配体 (如 cd80 或 cd86), 以确保 t 细胞活化1的进展.共刺激的一个重要功能是重新排列肌动蛋白细胞骨架2,3,4。在静止 t 细胞中, 皮质 f-肌动蛋白相对静态。通过抗原性 apc 刺激 t 细胞导致肌动蛋白细胞骨架的深刻重排。肌动蛋白动力学 (即快速活性蛋白聚合/解聚合圈) 使 t 细胞产生的力量, 用于运输蛋白质或细胞器, 例如。此外, 肌动蛋白细胞骨架是重要的发展一个特殊的接触区之间的 t 细胞和 apc, 称为免疫突触。由于肌动蛋白细胞骨架对免疫突触的重要性, 因此有必要开发一些方法来量化 t 细胞 5、6、7、8的肌动蛋白细胞骨架的变化,9个。
通过肌动蛋白细胞骨架辅助, 表面受体和信号蛋白在免疫突触内的超分子激活簇 (smac) 中分离。免疫突触的稳定性是由受体结合到 f-肌动蛋白束, 增加肌动蛋白细胞骨架的弹性。免疫突触的形成已经被证明是产生适应性免疫反应的关键。在患有 wiskott aldrich 综合征 (was) 的患者中, 首次意识到体内免疫突触形成有缺陷的有害影响, 在这种疾病中, 肌动蛋白聚合和同时免疫突触的形成受到干扰.was 患者可能患有湿疹、严重的反复感染、自身免疫性疾病和黑色素瘤。尽管有这一发现, 但目前尚不清楚免疫突触的形成在患有免疫缺陷或自身免疫性疾病的健康个体和患者的 t 细胞中是否不同。
荧光显微镜, 包括共聚焦、tirf 和超分辨率显微镜, 被用来揭示免疫突触 11,12,13,14的结构。这些系统的高分辨率和进行活细胞成像的可能性使得能够收集关于免疫突触中的肌动蛋白细胞骨架和表面或细胞内蛋白质的精确时空信息。然而, 许多结果是基于对几十种 t 细胞的分析。此外, 对于这些类型的荧光显微镜, t 细胞必须纯化。然而, 对于许多研究问题来说, 使用未纯化的细胞而不是尽可能高的分辨率至关重要。如果对患者的 t 细胞进行分析, 这一点是相关的, 因为捐献的血液数量有限, 可能需要同时处理许多样本。
我们建立了微观方法, 可以分析人类系统免疫突触中的肌动蛋白细胞骨架 15、16、17。这些方法是基于成像流式细胞仪, 也称为流内显微镜18。作为多光谱流式细胞仪和荧光显微镜的混合体, 成像流式细胞仪在分析非均质细胞群 (如泛白细胞) 的形态参数和蛋白质定位方面具有优势。外周血。我们引入了一种方法, 使我们能够量化从全血样本的人 t 细胞的 t-cele® apc 结合中的 f-肌动蛋白, 而不需要耗时和昂贵的纯化步骤17。这里介绍的技术包括整个工作流程, 从获得血液样本到免疫突触中 f-肌动蛋白的定量。
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Protocol
1. 泛白细胞的制备
- 在肝素化注射器中从健康捐献者 (或患者) 中提取1毫升外周血。确保献血得到负责伦理委员会的批准。
- 将人外周血的1毫升与30毫升的 ack 裂解缓冲液 (150 mm nh4 cl,1 mm khco3和 0.1 mm edta, ph 7.0) 混合在一个 50 ml 管中, 在室温下孵育8分钟。
- 在 300 x g的情况下将管道和离心机灌满 6分钟, 吸收上清液, 并将颗粒重新悬浮在30ml 的 ack 裂解缓冲液中。
- 重复步骤1.2 和 1.3, 直到上清液清除。最后, 在 pbs 中清洗细胞, 在室温下以 300 x g 离心器 6分钟, 并在培养基 (rpmi1640 + 10% fcs) 中重新悬浮细胞颗粒。在37°c 下将细胞培养60分钟。
2. 用 seb 装载 raji 电池
- 准备两个15毫升猎鹰管与 1.5 x10 6 raji 细胞每管。向下旋转细胞 (300 x克,室温下 6分钟), 并丢弃上清液。
- 将细胞重新悬浮在残留介质中 (约 50–100μl), 加入 1.9μl (1.9μg) seb, 在室温下孵育 15分钟, 加入5毫升培养基, 将细胞旋转 (300 x g , 室温下 6分钟), 并在培养基中重新悬浮颗粒 (rpmi)1640 + 10% fcs), 密度为 1 x10 6 cells/mL l。
3. 免疫突触和染色协议的诱导
- 移液器500μl 的制备 sb 加载 raji 细胞到一个流式细胞仪管和500μl 的制备卸载 raji 细胞到另一个流式细胞仪管。在每个管中加入650微克的泛白细胞, 然后向下旋转细胞 (在室温下 300 x 克 10分钟)。丢弃上清液, 在150μl 培养基 (rpmi1640 + 10% fcs) 中重新悬浮颗粒。在37°c 下孵化 (通常为 45分钟)。
- 轻轻旋涡细胞 (10秒1000转/分), 并在涡旋期间添加1.5 毫升的甲醛 (1.5%) 来固定细胞。通过添加1毫升的 pbs + 1% bsa 来停止固定。将细胞颗粒 (300 x g , 室温 10分钟, 在室温下重新悬浮细胞颗粒1毫升 pbs + 1% bsa 后, 在室温下孵育10分钟。
- 颗粒 (300 x g , 室温 10分钟), 并在 100μl pbs + 1% bsa + 0.1% 皂甙中重新悬浮细胞 15分钟, 使细胞渗透 (96 孔板, u 形)。
- 用离心剂清洗 pbs + 1% bsa + 0.1% 皂甙中的细胞 (300 x g , 室温 10分钟), 并在50μl 的 pbs + 1% bsa 中重新悬浮细胞颗粒, 将含有氟氯能标记的抗体或化合物的1% 皂甙 (cd3-pe-txred (1:30),phooidin-af647 (1:150) 和 dapi (1:3000)。
- 在室温下在黑暗中将细胞加氢 30分钟, 加入1毫升的 pbs + 1% bsa + 0.1% 皂甙, 将细胞清洗3次。在室温下以 300 x g 离心10分钟。在60μl 的 pbs 中重新悬浮细胞, 用于成像流式细胞术。
4. 使用流式细胞仪采集图像
请注意:下面的图像采集过程和数据分析基于成像流式细胞仪, 使用的软件, 如图像流 (is100), 灵感和 ideas。但是, 也可以使用其他流式细胞仪和分析软件。
- 打开连接到成像流细胞仪的计算机上的分析软件, 然后单击 "仪器" 菜单的 "初始化流体"。当系统提示时, 请将珠子应用于右侧端口。
- 从 "文件" 菜单加载默认模板, 然后单击 "运行设置"。从 "查看" 下拉菜单中选择 "珠子"。
- 如果指示的值低于 200, 请单击 "设置强度" 来调整亮域照明器。
- 通过单击 "全部启动", 在 "辅助" 选项卡中运行校准和测试例程。
- 单击 flush/lok®加载, 并在系统提示时应用左侧端口中的示例。在流式细胞仪中加载单元后, 打开单元分类器并调整值, 如下所示: 每个通道在 1, 022 时的峰值强度上限, 通道 2 (dapi) 的峰值强度下限为 50, 通道 5 (cd3-pe-txr), 区域下限为50通道 1 (侧向散射), 上限为 1, 500。
- 将激发激光功率更改为 "设置" 选项卡中的 405 nm (15 mw)、405 nm (200 mw) 和 647 nm (90 mw)。
- 切换 "单元格" 和 "珠子" 之间的 "查看" 下拉菜单, 以评估单元分类器和激光功率调整。
请注意:通过更改单元分类器和/或激发激光功率, 确保所有单元格和细胞对都被找到, 并且在碎片视图中找到具有饱和像素的单元格、碎片和图像。 - 在 "设置" 选项卡中定义示例名称和要获取的图像量 (样本为 15000–25, 500 用于补偿控制). 单击 run/安装程序开始获取。
5. 数据分析
- 将原始图像文件 (. rif) 传输到数据分析计算机并打开分析软件。
- 按照 "补偿" 下拉列表的指示生成补偿矩阵。将补偿矩阵另存为 comp _ date. ctm。
- 打开原始图像文件示例 (. rif), 并在窗口中应用 comp _ date. ctm, 该窗口似乎会生成补偿图像文件 (. cif) 和默认数据分析文件 (. daf)。
- 打开补偿图像文件。将图像转换为颜色模式, 并调整查找表, 以在 "图像库属性" 工具栏中获得最佳可见颜色。使用 "图像库属性" 工具栏的 "复合" 选项卡获取 rgb 合并图像。
-
从 "分析" 下拉列表中打开蒙版管理器。创建掩码来定义 t 细胞和免疫突触, 如下所示:
- 选择 t 单元掩码: "(Fill(Threshold_Ch05, 60)"。选择山谷面罩: "Valley(Ch02,3)。选择 t 细胞突触掩码: "t 细胞掩码和 Valley(M02,Ch02, 3)。
-
从 "分析" 下拉列表中打开功能管理器。计算以下功能:
- 对于 t 细胞中的 cd3 表达式, 请选择 "强度 _ t-cells_Ch5"。对于 t 细胞中的 f 肌动蛋白总量, 请选择 "强度 _ t-cells_Ch6"。对于免疫突触中的 cd3 表达, 选择 "强度 _ t 细胞 synapse_Ch5"。对于免疫突触中的 f 肌动蛋白含量, 选择 "强度 _ t 细胞 synapse_Ch6"。
- 若要计算 t 细胞区域, 请选择 "区域 _ t 细胞"。要计算 t 细胞免疫突触区域, 请选择 "面积 _ t 细胞突触"。
- 使用功能管理器中的公式确定免疫突触中的 f-ac动 n 和 cd3 富集:
-
使用 "分析" 区域中的直方图和点图应用以下门控策略 (有关详细信息, 请参阅参考17和 19):
- 通过绘制直方图中的 "渐变 RMS_M2_Ch2" 来丢弃焦点外单元格;将阈值设置为15。
- 绘制一个点图中的 ssc 与 cd3 强度。在 cd3 阳性事件上设置一个门。
- 绘制 m02 (dapi 染色) 的 "纵横比" 与 m02 (dapi 染色) 面积的对比。t 细胞单片上的门和细胞对相应地对。正确的真正细胞对使用突触面具的区域, 如前面所述的 17,19。
- 确定 t-clsp乐 apc 对 t 细胞单件和 t 细胞中 f-肌动蛋白的含量以及 f 肌动蛋白在免疫突触中的百分比。
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Representative Results
这里描述的方法的一个主要目标是量化蛋白质丰富 (例如, f-肌动蛋白) 在免疫突触之间的代理 apc (raji 细胞) 和 t 细胞在未纯化的泛白细胞从低体积 (1 毫升) 人体血液样本中提取。图 1中的屏幕截图概述了此方法的关键门控策略。它在左侧显示图像库, 在右侧显示分析区域 (图 1)。图片库显示 "聚焦" 门。所描绘的图像主要是粒细胞和两对 t-clepc 夫妇。f-肌动蛋白和 cd3 在细胞对30272丰富。量化这种丰富的细胞对数量的门控策略显示在分析领域, 并在议定书 (见步骤 5.8) 或其他地方第17、19 中描述。分析区域中的最后一个点图显示免疫突触中 cd3 (x 轴) 和 f-肌动蛋白 (y 轴) 的含量 (百分比)。如果超过30% 的蛋白质位于免疫突触面膜内, 则在免疫突触 20中被认为是蛋白质丰富。包含浓缩数据的点图被用来产生典型的最终结果 (图 2a)。左边的图像显示 t-cele/apc 共轭的样本图像, 免疫突触中的 cd3 和 f-肌动蛋白含量较低, 而右侧则是 t-cele/apc 共轭, 具有强大的 cd3 和 f-肌动蛋白的丰富性。免疫突触处的 cd3 量 (蛋白质百分比) 绘制在 x 轴上, 免疫突触处的 f-肌动蛋白量绘制在 y 轴上。门中的百分比表示在存在超抗原的情况下, 在免疫突触处有 cd3 和 f 肌动蛋白富集的 t 细胞的数量。在没有超抗原的情况下, 15% 的 t 细胞在 cd3 和 f-肌动蛋白的免疫突触处表现出丰富。在超抗原存在的情况下, 细胞数量增加到29%。在存在和不存在超抗原的情况下, 对 cd3 富集 (图 2b) 或 f-acmin 富集 (图 2c) 进行了一次定量。结果表明, 在没有超抗原的情况下, 在没有超抗原的情况下, 在超抗原的存在下, 在免疫突触处积累了细胞总 f 肌动蛋白量的34.3±4.0%。有趣的是, 在没有超抗原的情况下, cd3 已经积累 (占 cd3 总量的 16.6±2.1%), 这显著增加了超抗原的加入 (24.6±3.0% 的总 cd3 量)。这种方法可以量化多少蛋白质是在 t 细胞和 apc 之间的免疫突触积累。
图 1: 识别泛白细胞制剂中免疫突触的门法策略.该图显示了该软件的屏幕截图, 并包含一个完整的分析工作流程, 用于评估 cd3 和 f-肌动蛋白在 seb 存在的情况下与 apc 结合的 t 细胞的免疫突触中的富集。图像显示在左侧的图片库中 (ch2 = dapi;ch5 = cd3-petxr;ch6 = phalloidin af647;和合并 = 包含 ch2、ch5 和 ch6 的组合图像)。该软件提供了一个图像显示工具栏, 用于调整查找表、掩码显示和彩色/灰度模式。屏幕截图的右侧显示分析区域和分析工具栏。分析区域包含直方图和点图如下: 1) 直方图, 根据 dapi 染色的梯度 rms 特征查找聚焦细胞。2) 根据 cd3 (Intensity_MC_Ch05、x 轴) 和侧向散射轮廓 (Intensity_MC_Ch01, y 轴) 的表达在 t 细胞上进行门胶。3) 根据 dapi 染色 (纵横 ratio_M02、y 轴) 和侧面散射轮廓 (Intensity_MC_Ch01、x 轴) 的长宽比, 在潜在的 t-clepc 对上进行粘附。4) 根据区域突触面膜 (x 轴) 和 cd3 染色面积 (y 轴), 在真正的 t-cleclic/apc 对上进行粘附。5) 在免疫突触中 cd3 (x 轴) 和 f-肌动蛋白 (y 轴) 的富集 (和界面中 gt;30% 蛋白质含量) 定义的成熟免疫突触上进行交联。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:免疫突触中 cd3 和 f-肌动蛋白富集的成像流式细胞仪数据.(a) 中心的点图显示免疫突触中 cd3 (x 轴) 和 f-肌动蛋白 (y 轴) 的百分比。t-celmse/apc 在 seb 的缺失 (上半部分) 或存在 (下半部分) 时与成熟的免疫突触结合在一起。左侧的图像显示 t-clepl 对 cd3 和 f-肌动蛋白的富集程度较低, 而右侧的图像显示 t-clepl 对具有高度的 cd3 和 f-肌动蛋白富集 (成熟的免疫突触)。刻度杆 = 10μm (左下角)。研究结果代表了三个独立的实验。(B-C)平均 cd3 (b) 或 f-肌动蛋白 (c) 在存在或不存在 seb 的情况下, 免疫突触中的富集显示为百分比蛋白 (n = 3;se)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这里介绍的工作流程使人的 t 细胞 (体外) 和 apc 之间的免疫突触能够进行量化。值得注意的是, 红细胞裂解泛白细胞被用作 t 细胞源, 使 t 细胞纯化步骤成为可有可无的。b 细胞淋巴瘤细胞系拉吉作为代理 apc。这具有显著的优势, 因为它允许免疫突触 t 细胞侧的献血者进行比较。此外, 自体 dc 很难直接从人体外周血中获得。单核细胞衍生树突状细胞 (modc) 的产生需要几天时间, 这使得其在临床研究中的应用具有挑战性。然而, 成像流式细胞仪和这里介绍的分析策略可以应用于其他 apc (例如,跨分化中性粒细胞)20。此外, 还证明 cd4 t 细胞与体外 ds9 或 b 细胞21之间的免疫突触可以用成像流式细胞仪对小鼠进行评估.因此, 除了免疫突触的 t 细胞侧之外, 这种方法还可以扩大到评估 apc 功能。
这种方法最关键的步骤是将泛白细胞和 apc 混合在一个小体积中, 并执行正确的门控策略, 以排除假阳性事件, 同时最大限度地减少真正的免疫突触的损失。虽然我们描述了 cd3 和 f-肌动蛋白积累的测量, 这种方法并不局限于这些蛋白质, 可以扩展到其他表面受体, 如脂肪-117,19。此外, 添加荧光标记的抗体来识别 t 细胞亚群 (例如 cd4、cd8、cd45ra 或趋化因子受体), 可以探索显示某种免疫突触表型的 t 细胞的性质.重要的是, 这种分析所需的血液量很低 (最大: 1 毫升)。虽然这里使用的第一代成像流细胞仪 (is100) 的图像采集速率约为100细胞, 但第三代成像流细胞仪 (isxmkii) 允许更高的图像采集速率 (高达 2, 000 细胞)使用40x 目标)。因此, 实际的工作流程, 从抽血到数据分析, 需要相当短的时间 (即一天) 。值得注意的是, 虽然所提供的图像分析是基于成像流式细胞术, 细胞准备和诱导免疫突触 (即工作流程的第一部分) 可以应用于其他成像技术22。
与流式细胞术不同的是, 成像流式细胞识别获得的点图除了包含蛋白质表达数据外, 还包含有关蛋白质定位的信息。成像流式细胞术的一个强度是任何选定的门的细胞 (或细胞对) 可以通过眼睛来评估;只需点击点并检查相应的图像, 就可以相应地调整闸门边界。在我们的实验中, 我们发现30% 的蛋白质浓缩是一个可靠的价值, 认为各自的细胞对具有丰富的感兴趣的蛋白质。一旦门最终设置好, 功能和门控策略就会保存在一个单独的文件 (. ast) 中, 并可应用于下面的每个示例, 以确保无偏见的评估。
成像流式细胞术的弱点是分辨率的限制 (使用40x 目标0.5 微米) 和只能分析一个聚焦平面的事实。因此, 该方法不适合分析免疫突触的精细结构和微簇的发生。为了分析免疫突触的这些与体系结构相关的方面, 需要替代技术, 如共聚焦、tirf 或超分辨率显微镜。成像流式细胞仪的强度是每个样本可获得的图像量 (最多 25, 000 张)。值得注意的是, 每张图片都是分段的, 这意味着背景被击倒, 每个图像通常只有一个单独的细胞或细胞夫妇。成像流式细胞仪的这些特性构成了单细胞级自动分析的基础。此外, 每个样本分析的大量细胞可以可靠地识别罕见的事件 (即频率低于1% 的亚群或细胞对)。重要的是, 这里介绍的工作流程可用于研究免疫相关疾病 (如原发性免疫缺陷障碍) 患者的泛白细胞体外 t 细胞中的免疫突触形成 。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由德国研究委员会 (dfg) 提供资金, 并提供第1号赠款。sfb-938-m 和 sa 393-4。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
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