Summary
Her beskriver vi et komplet arbejdsgang for den kvalitative og kvantitative analyser af immun synapser mellem primære humane T celler og antigen-præsenterer celler. Metoden er baseret på imaging flowcytometri, som giver mulighed for erhvervelse og evaluering af flere tusinde celle billeder inden for en relativt kort periode.
Abstract
Den immun synapse er inden for kommunikation mellem T-celler og antigen-præsentere celler (PMV'er). T-celler polarisere overflade receptorer og proteiner mod den immun synapse til at sikre en stabil bindende og signalere exchange. Klassisk Konfokal, JOHANNAS eller Super-resolution mikroskopi er blevet brugt til at studere den immun synapse. Da disse metoder kræver manuel billede erhvervelse og tidskrævende kvantificering, er billeddannelse af sjældne begivenheder udfordrende. Her, beskriver vi en arbejdsproces, som gør det muligt for den morfologisk analyse af titusinder af celler. Immun synapser er induceret mellem primære human T-celler i pan-leukocyt præparater og Staphylococcus aureus enterotoksin B SEB-loaded Raji celler som pansrede mandskabsvogne. Billede erhvervelse er udført med imaging flowcytometri, også kaldet In-Flow mikroskopi, som kombinerer funktionerne af et flow forskellige og et fluorescens mikroskop. Der tilbydes en komplet gating strategi til at identificere T-celle/APC par og analysere de immun synapser. Da denne arbejdsproces giver mulighed for analyse af immun synapser i urenset pan-leukocyt præparater og dermed kræver kun en lille mængde blod (dvs., 1 mL), det kan anvendes på prøver fra patienter. Vigtigere, kan flere prøver være forberedt, målt og analyseret i parallel.
Introduction
T-celler er store regulatorer af den adaptive immunsystem og er aktiveret gennem antigene peptider, der præsenteres i forbindelse med store histocompatibility komplekser (MHC). Fuld T-celle aktivering kræver to signaler, det kompetence signal via antigen-specifikke T-celle receptoren (TCR) / CD3 komplekset og den costimulatory signal via tilbehør receptorer. Begge signaler der genereres gennem direkte samspillet mellem T-celler og antigen-præsentere celler (PMV'er). Modne PMV'er give kompetence signal for T-celle aktivering via MHC-peptid komplekser, og de udtrykker costimulatory ligander (f.eks., CD80 eller CD86) til at sikre progression af T-celle aktivering1. En vigtig funktion af costimulation er omlejring af actin cytoskeleton2,3,4. Den kortikale F-actin er relativt statiske i hvile T-celler. T-celle stimulering gennem antigen-bærende PMV'er fører til en gennemgribende omlægning af actin cytoskelet. Aktin dynamics (dvs., hurtig actin polymerisering/depolymerization kredse) aktiverer T-celler til at oprette kræfter, der bruges til at transportere proteiner eller organeller, f.eks. Derudover er actin cytoskelettet vigtigt for at udvikle en særlig kontakt zone mellem T-celler og pansrede mandskabsvogne, kaldet immun synapse. På grund af betydningen af actin cytoskelettet til immun synapse, er det blevet vigtigt at udvikle metoder til at kvantificere ændringer i actin cytoskelettet T celler5,6,7,8 , 9.
Ved hjælp af actin cytoskeletal støtte, er overflade receptorer og signalering proteiner adskilles i Supramolekylær aktivering klynger (SMACs) inden for den immun synapse. Stabiliteten i den immun synapse er sikret ved binding af receptorer til F-actin bundter, at øger elasticiteten i actin cytoskelet. Immun synapse dannelse har vist sig at være afgørende for generation af de adaptive immunrespons. De skadelige effekter af en defekt immun synapse formation in vivo blev først realiseret i patienter, der lider fra Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sygdom i hvilken actin polymerisation og samtidig, immun synapse dannelse er forstyrret10 . VAR patienter kan lider af eksem, alvorlige tilbagevendende infektioner, autoimmune sygdomme og melanomer. Trods denne konstatering, er det i øjeblikket ikke kendt om immun synapse dannelse afviger i T-celler af raske personer og patienter med immun-defekter eller autoimmune sygdomme.
Fluorescens mikroskopi, herunder Konfokal, JOHANNAS og super-resolution mikroskopi, blev brugt til at afdække arkitekturen i immun synapse11,12,13,14. Den høje opløsning af disse systemer og mulighed for at udføre live-celle imaging muliggør indsamling af nøjagtige, spatio-temporale oplysninger om actin cytoskelettet og overflade eller intracellulære proteiner i immun synapse. Mange resultater, men er baseret på analyse af kun et par snese T-celler. Derudover skal T celler renses for disse typer af Fluorescens mikroskopi. Men for mange forskningsspørgsmål, brugen af urenset celler i stedet for den højest mulige opløsning er af allerstørste betydning. Dette er relevant, hvis T-celler fra patienter er analyseret, da mængden af donorblod er begrænset og der kan være behov for at behandle mange prøver parallelt.
Vi etablerede mikroskopiske metoder, der giver mulighed for analyse af actin cytoskelettet i immun synapse i menneskelige system15,16,17. Disse metoder er baseret på imaging flowcytometri, også kaldet In-Flow mikroskopi18. Som en hybrid mellem multispektrale flow flowcytometri og Fluorescens mikroskopi, imaging flowcytometri har sine styrker i analyse af morfologiske parametre og protein lokalisering i heterogene cellepopulationer, såsom pan-leukocytter fra den perifert blod. Vi indførte en metode, der gør det muligt at kvantificere F-actin i T-celle/APC konjugater af humane T celler fra fuldblod prøver, uden behovet for tidskrævende og dyrt rensning trin17. Teknikken præsenteret her omfatter den hele arbejdsproces fra at få blodprøve til kvantificering af F-actin i immun synapse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af Pan-leukocytter
- Trække 1 mL af perifert blod fra en sund donor (eller patienten) i en heparinized sprøjte. Sørg for at have godkendelse fra den ansvarlige etiske komité for blood donation.
- Mix 1 mL af human perifere blod med 30 mL af ACK lysisbuffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3og 0,1 mM EDTA, pH 7,0) i en 50 mL tube og Inkuber i 8 min ved stuetemperatur.
- Fylde rørene med PBS og centrifugeres ved 300 x g i 6 min. aspirat supernatanten og resuspenderes i 30 mL af ACK lysisbuffer.
- Gentag trin 1.2 og 1.3, indtil supernatanten er klart. Endelig, vaske cellerne i PBS, centrifugeres ved 300 x g i 6 min. ved stuetemperatur, og celle resuspenderes i 2 mL af næringssubstratet (RPMI1640 + 10% FCS). Inkuber celler ved 37 ° C i 60 min.
2. læsning af Raji-celler med SEB
- Forbered to 15 mL Falcon rør med 1,5 x 106 Raji celler pr. rør. Spin ned celler (300 x g for 6 min. ved stuetemperatur) og supernatanten.
- Resuspend celler på resterende medium (ca 50-100 µL), tilføje 1.9 µL (1,9 µG) SEB, og der inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. Tilføj 5 mL af næringssubstratet, spin ned celler (300 x g for 6 min. ved stuetemperatur) og resuspenderes i substratet (RPMI 1640 + 10% FCS) med en tæthed på 1 x 106 celler/mL.
3. induktion af immun synapser og farvning protokol
- Tilsæt 500 µL af forberedelsen af SEB-loaded Raji celler ind i en FACS rør og 500 µL af forberedelse af losset Raji-celler ind i en anden FACS rør. Tilføje 650 µL af pan-leukocytter til hver tube og spin-ned celler (300 x g i 10 min. ved stuetemperatur). Supernatanten og resuspenderes i 150 µL af næringssubstratet (RPMI1640 + 10% FCS). Der inkuberes ved 37 ° C (typisk for 45 min).
- Forsigtigt vortex cellerne (10 s ved 1000 rpm) og tilsættes 1,5 mL PARAFORMALDEHYD (1,5%) under vortex at fastsætte cellerne. Stop optagelsen ved tilsætning af 1 mL PBS + 1% BSA. Sammenpresse cellerne (300 x g i 10 min. ved stuetemperatur og resuspension celle pellet i 1 mL PBS + 1% BSA efter inkubation ved stuetemperatur i 10 min.
- Pellet (300 x g i 10 min. ved stuetemperatur) og resuspend celler i 100 µL af PBS + 1% BSA + 0,1% saponin i 15 min. ved stuetemperatur til permeabilize celler (96-brønd plade, U-formet).
- Vaske cellerne i PBS + 1% BSA + 0,1% saponin med centrifugering (300 x g i 10 min. ved stuetemperatur) og resuspenderes celle i 50 µL af PBS + 1% BSA + 0,1% saponin indeholdende fluorophore-mærkede antistoffer eller forbindelser (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) og DAPI (1:3, 000)).
- Inkuber cellerne ved stuetemperatur i mørke i 30 min. Skyl cellerne 3 gange ved tilsætning af 1 mL PBS + 1% BSA + 0,1% saponin. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved stuetemperatur. Re-resuspend celler i 60 µL af PBS for billedbehandling flowcytometri.
4. billede erhvervelse ved hjælp af en Flow forskellige
Bemærk: Det følgende billede erhvervelse procedure og data analyse er baseret på imaging flowcytometri ved hjælp af software som imagestream (IS100), INSPIRE og ideer. Andre flow cytometers og analyse software kan dog også bruges.
- Åben analyse software på computeren tilsluttet imaging flow Flowcytometret og klik på Initialiser Fluidics af menuen Instrument. Anvende perlerne på den rigtige port når bedt om at gøre dette.
- Indlæse standardskabelon i menuen filer, og klik på Run/opsætning. Vælg perler fra dropdown menuen.
- Justere lysfelt illuminator ved at klikke på Angiv intensitet, hvis den angivne værdi er under 200.
- Køre kalibrering og teste rutine i fanen hjælpe ved at klikke på Start alle.
- Klik på Lås-Flush-belastning og anvende prøver i den venstre port når bedt om at gøre dette. Efter indlæsning af celler i flow Flowcytometret, åbne celle klassificeringen og Juster værdierne som følger: højeste intensitet øvre grænse på 1,022 for hver kanal, peak intensitet nedre grænse på 50 for kanal 2 (DAPI) og Kanal 5 (CD3-Pe-TxR) område nedre grænse på 50 for kanal 1 (side scatter) og øvre grænse på 1.500.
- Ændre excitation laser power til 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), og 647 nm (90 mW) under fanen Opsætning.
- Skifte dropdown menuen mellem celler og perler til at evaluere de celle klassificering og laser power justeringer.
Bemærk: Sørg for at alle celler og celle par findes visningen celle og at celle klumper, snavs og billeder med mættede pixels findes i visningen snavs ved at ændre celle klassificeringer og/eller excitation laser beføjelser. - Definere navnet prøve og mængden af billeder til at erhverve (15.000-25.000 prøver) og 500 for kompensation kontrolelementer under fanen Opsætning skal du klikke på Kør/opsætning at starte erhvervelse.
5. dataanalyse
- Overføre raw-billedfiler (.rif) til data analyse computer og åbne den analyse software.
- Producere en kompensationsmatrix, ifølge vejledningen i kompensation dropdown. Gem kompensationsmatrix som comp_Date.ctm.
- Åbne en prøve raw-billedfil (.rif) og anvende comp_Date.ctm i det vindue, der vises til at producere de kompenserede billedfiler (.cif) og den standard data analyse fil (.daf).
- Åbn billedfilen kompenseret. Konvertere billederne til farvetilstand og justere opslagstabeller for at opnå optimal synlige farver på værktøjslinjen billede galleri egenskaber. Opnå en RGB-fusionerede billede ved hjælp af fanen sammensat af værktøjslinjen billede galleri egenskaber.
-
Åbn maske Manager rullemenuen analyse. Skabe masker for at definere T-celler og immun synapse, som følger:
- Vælg den T-celle maske: "(fyld (Threshold_Ch05, 60)." Vælg valley maske: "Valley(Ch02,3)." Vælg T-celle synapse maske: "T-celle maske og dalen (M02, Ch02, 3)."
-
Åbn funktionen Manager rullemenuen analyse. Beregne følgende funktioner:
- For den samlede CD3 udtryk i T-celler, skal du vælge "Intensity_T-cells_Ch5." For den samlede mængde af F-actin i T-celler, skal du vælge "Intensity_T-cells_Ch6." For CD3 udtryk i den immun synapse, Vælg "Intensity_T-celle synapse_Ch5." For den mængde F-actin i immun synapse, Vælg "Intensity_T-celle synapse_Ch6."
- For at beregne området T-celle, Vælg "Area_T-cellerne." For at beregne området T-celle immun synapse, Vælg "Area_T-celle synapse."
- Bestemme F-actin og CD3 berigelse i immun synapse ved hjælp af ligningen i funktionen Manager:
-
Anvende den følgende gating strategi ved hjælp af histogrammer og dot parceller fra analyseområde (for yderligere oplysninger, se referencer 17 og 19):
- Skille sig ud-af-fokus celler ved at plotte den "Gradient RMS_M2_Ch2" i et histogram; Angiv tærsklen på 15.
- Plot SSC versus CD3 intensitet i en dot plot. Angiv en port på CD3-positive begivenheder.
- Plot "Aspect ratio" af M02 (DAPI pletten) versus område af M02 (Dapi plet). Gate på T-celle housecoats og celle par i overensstemmelse hermed. Korrigere for sande celle par ved hjælp af området i synapse maske, som tidligere beskrevet17,19.
- Bestemme mængden af F-actin i T-celle housecoats og T celler af T-celle/APC par og procent af F-actin i immun synapse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et vigtigt mål med metoden beskrevet her er kvantificering af protein berigelse (f.eks., F-actin) i den immun synapse mellem rugemor PMV'er (Raji-celler) og T-celler i urenset pan-leukocytter taget fra lav-volumen (1 mL) humant blodprøver. Skærme i figur 1 giver et overblik over den kritiske gating strategi af denne metode. Det viser, billedegalleriet til venstre og analyseområde til højre (figur 1). Billedgalleri viser "I fokus" gate. De afbillede billeder er hovedsagelig granulocytter og to par med T-celle/APC. F-actin og CD3 er beriget med celle par nummer 30272. Den gating strategi at kvantificere mængden af celle par med sådan berigelse er vist i området analyse og er beskrevet i protokollen (Se trin 5.8) eller andetsteds17,19. Den sidste prik plot i området analyse viser CD3 mængde (procent protein) (x-aksen) og F-actin (y-aksen) i den immun synapse. Hvis mere end 30% af protein var placeret inden for immun synapse maske, blev det betragtet som protein berigelse i immun synapse20. Dot observationsområder indeholdende berigelse data blev brugt til at producere en typisk endelige resultat (figur 2A). Billederne til venstre viser sample billeder af T-celle/APC konjugater, med små mængder af CD3 og F-actin i immun synapse, mens til højre, T-celle/APC konjugater er afbildet med en stærk tilsætning af CD3 og F-actin. Mængden af CD3 på den immun synapse (procent protein) er afbildet på x-aksen, og mængden af F-actin på den immun synapse er afbildet på y-aksen. Procentdelen i porten repræsenterer mængden af T-celler, der har en berigelse af CD3 og F-actin på den immun synapse i tilstedeværelse af en superantigen. I mangel af superantigen, 15% procent af T-celler viste en berigelse på den immun synapse både CD3 og F-actin. Mængden af celler steg til 29% i superantigen. En enkelt kvantificering af CD3 berigelse (figur 2B) eller F-actin berigelse (figur 2 c) er vist i tilstedeværelse og fravær af superantigen. Disse resultater viser, at i mangel af superantigen, 18,3 ± 3,5% og i overværelse af superantigen 34.3 ± 4,0% af de samlede F-actin i cellerne var akkumuleret i immun synapse. Interessant, var der allerede CD3 ophobning i mangel af superantigen (16,6 ± 2,1% af det samlede CD3), som blev væsentligt forøget ved tilsætning af superantigen (24.6 ± 3,0% af det samlede CD3). Denne metode giver mulighed for kvantificering af hvor meget protein er akkumuleret på den immun synapse mellem T-celler og pansrede mandskabsvogne.
Figur 1: Gating strategi til identifikation af immun synapser i pan-leukocyt præparater. Figuren viser et screenshot af softwaren og indeholder en komplet analyse arbejdsproces for evaluering af CD3 og F-actin berigelse i immun synapse T celler konjugeret til PMV'er i overværelse af SEB. Billeder vises i Billedgalleri til venstre (Ch2 = DAPI; Ch5 = CD3-PETxR; CH6 = Phalloidin AF647; og flette = kombinerede billede, der indeholder Ch2, Ch5 og Ch6). Softwaren giver en billede display toolbar til at justere for opslagstabeller, maske og tilstanden Farve/gråtoneskala. Den højre del af skærmbilledet viser analyseområde og analyse værktøj. Analyse området indeholder histogrammer og dot grunde som følger: 1) Histogram at finde celler i fokus efter funktionen gradient RMS i DAPI farvning. 2) gating på T celler efter udtryk af CD3 (Intensity_MC_Ch05, x-aksen) og side scatter profil (Intensity_MC_Ch01, y-aksen). 3) Gating på potentielle T-celle/APC par ifølge formatforholdet af DAPI pletten (aspekt ratio_M02, y-aksen) og side scatter profil (Intensity_MC_Ch01, x-aksen). 4) gating på ægte T-celle/APC par område synapse maske (x-aksen) og området af CD3 pletten (y-aksen). 5) gating på modne immun synapser defineret af berigelse (> 30% proteinindhold i brugergrænsefladen) af CD3 (x-aksen) og F-actin (y-aksen) i den immun synapse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Imaging flow flowcytometri data på CD3 og F-actin berigelse i immun synapse. (A) dot parceller i midten viser procentdelen af CD3 (x-aksen) og F-actin (y-aksen) i den immun synapse. T-celle/APC konjugater med en moden immun synapse i fravær (øverste del) eller tilstedeværelse (nederste del) af SEB er afbildet. Billeder på venstre viser T-celle/APC par med en lav grad af CD3 og F-actin berigelse, der henviser til, at billederne til højre viser T-celle/APC par med en høj grad af CD3 og F-actin berigelse (modne immun synapse). Skalalinjen = 10 µm (nederst til venstre). Resultatet er repræsentant for tre uafhængige forsøg. (B-C) Betyde CD3 (B) eller F-actin (C) berigelse i immun synapse i tilstedeværelse eller fravær af SEB er vist som procent protein (n = 3; SE). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbejdsprocessen præsenteres her giver mulighed for kvantificering af immun synapser mellem human T-celler (ex vivo) og pansrede mandskabsvogne. Navnlig blev erytrocyt-mængden pan-leukocytter brugt som T-celle kilder, hvilket gør T-celle rensning trin undværes. B-celle lymfom cellelinie Raji fungerede som surrogat pansrede mandskabsvogne. Dette bærer betydelige fordele, da det giver mulighed for sammenligninger mellem bloddonorer af T-celle side af den immun synapse. Derudover er autolog DCs næppe tilgængelige direkte fra perifert blod. Produktionen af monocyt-afledte dendritiske celler (moDCs) tager flere dage, at gøre overførelse at kliniske undersøgelser udfordrende. Men billedbehandling flowcytometri og analyse strategien præsenteret her kan anvendes på andre PMV'er (f.eks., transdifferentiated neutrofiler)20. Derudover blev det påvist at immun synapse mellem CD4 T-celler og ex vivo DCs9 eller B celler21 kan vurderes for mus ved hjælp af billedbehandling flowcytometri. Denne metode kan således udvides til at vurdere APC funktion ud over T-celle side af den immun synapse.
De mest kritiske trin af denne metode blanding af pan-leukocytter og pansrede mandskabsvogne i en lille mængde og udførelse af korrekt gating strategi for udelukke falsk positive begivenheder mens på samme tid minimere tabet af sande immun synapser. Mens vi beskrive måling af CD3 og F-actin ophobning, denne metode er ikke begrænset til disse proteiner og kan udvides til andre overflade receptorer som LFA-117,19. Derudover tilsætning af fluorophore-mærkede antistoffer til at identificere T-celle undergrupper (f.eks., CD4, CD8, CD45RA eller chemokine receptorer) ville give mulighed for udforskning af karakteren af T-celler viser en bestemt immun synapse fænotype. Vigtigere, mængden af blod, der er nødvendige for en sådan analyse er lav (maksimal: 1 mL). Mens den første generation af imaging flow cytometers, som bruges her (IS100), har giver et billede erhvervelse sats på omkring 100 celler/s, den tredje generation af imaging flow cytometers (IsXMKII) langt højere billede erhvervelse priser (op til 2.000 celler/s bruger en 40 x mål). Således, den faktiske workflow fra tegning blodet til dataanalyse, kræver en meget kort periode (dvs., en dag). Navnlig, mens præsenteres billedanalyse er baseret på imaging flowcytometri, kan celle forberedelse og induktion af immun synapser (dvs, den første del af arbejdsprocessen) anvendes til andre billeddiagnostiske teknikker22.
I modsætning til flowcytometri indeholder imaging flow flowcytometri-opnået dot parceller oplysninger om protein lokalisering ud over protein udtryk data. En styrke af imaging flowcytometri er at celler (eller celle par) af enhver valgte gate kan vurderes med det blotte øje; gate grænser kan justeres i overensstemmelse hermed, ved blot at klikke på prikkerne og inspicere det tilsvarende billede. I vores forsøg fandt vi, at 30% protein berigelse er en pålidelig værdi til at overveje de respektive celle par som havende protein af interesse beriget. Når dørene er endelig fastsat, funktioner og gating strategi gemmes i en separat fil (.ast) og kan anvendes på hver følgende prøve at sikre en objektiv evaluering.
Svaghederne i imaging flowcytometri er begrænsning i opløsning (0,5 µm ved hjælp af en 40 x mål) og kendsgerning, at kun ét fokus flyet kan analyseres. Denne metode er derfor ikke egnet til at analysere finstrukturen af immun synapser og forekomsten af microclusters14. For at analysere sådanne arkitektur-relaterede aspekter af den immun synapse, alternative teknikker, såsom Konfokal, JOHANNAS, eller Super-resolution mikroskopi, er nødvendige. Styrken af imaging flowcytometri er mængden af billeder, der kan erhverves pr. sample (op til 25.000). Navnlig, hvert billede er segmenteret, hvilket betyder, at baggrunden er slået ud, og der er normalt kun én ensomme celle eller celle par pr. billede. Disse karakteristika af imaging flowcytometri danner grundlag for automatiseret analyse på én celle-niveau. Desuden, det høje antal celler, der er analyseret pr. sample mulighed for pålidelig identifikation af sjældne hændelser (dvs. delpopulationer eller celle par med en hyppighed under 1%). Vigtigere, arbejdsprocessen præsenteres her kan anvendes til studiet af immun synapse dannelse i ex vivo T-celler i pan-leukocytter fra patienter med immun-relaterede sygdomme (f.eks., primær immundefekt sygdomme).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejdet blev finansieret af den tyske Forskningsråd (DFG) med tilskud. SFB-938-M og SA 393/3-4.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
