Abstract
肠道显示由不同类型的上皮细胞，含有免疫细胞薄层propia，和基质的重复隐窝结构的架构。所有这些异构细胞有助于肠道内环境稳定，参与抗菌宿主防御。因此，确定了在体外环境研究免疫反应和肠的抗微生物活性的替代模型是极具挑战性。 体外研究使用永生化肠上皮细胞系或甚至小学隐窝化培养并不代表正常的肠道和微环境的确切生理学。在这里，我们在培养皿以及如何体外器官培养系统可以在与抗微生物宿主防御反应的研究来实现讨论培养小鼠结肠组织的方法。在代表的实验中，我们发现，在器官培养冒号表达RESP抗菌肽ONSE外源性的IL-1β和IL-18。此外，通过在器官培养的结肠组织中产生抗菌效应分子有效地杀灭体外大肠杆菌 。这种方法，因此，可以利用解剖在调节肠道先天免疫反应和抗微生物宿主防御反应的病原体和危险相关的分子模式和它们的细胞受体的作用。
Introduction
肠道代表充当共生微生物屏障的动态系统，地对抗入侵的病原体，并调节微生物组成1。肠上皮细胞，包括肠，杯状细胞，帕内特细胞和肠内分泌细胞，是主要的细胞群提供对抗肠道微生物的宿主防御反应。杯状细胞产生上创建上皮层2的顶部上的非军事区的粘蛋白。的帕内特细胞和肠上皮产生的抗微生物肽，细胞因子，和构成抗微生物宿主防御反应和有助于形成肠道微生物组合物3,4活性氧和氮物种。除了上皮细胞，免疫细胞，包括巨噬细胞，树突细胞，嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞，淋巴细胞和茵 7 -固有层和粘膜下层德淋巴样细胞通过产生细胞因子，趋化因子和其他介质5发挥肠道抗菌宿主防御反应的关键作用。为了了解粘膜免疫系统如何监管和微生物提供了对微生物感染的保护，应考虑肠道的异质细胞群的复杂的相互作用是非常重要的。但是，包括所有的肠的功能的体外模型是不可用的。因此，在肠道内的宿主 - 病原体相互作用的分子研究是极具挑战性的。
在过去的几年中，模仿肠粘膜的各方面的几个模型系统已被开发用于研究参与炎症性肠疾病（IBD）和其它胃肠道病症8的病理生理过程-=“外部参照”> 14。永生化肠上皮细胞系通常用于研究上皮细胞特异性应答。然而，由于差异基因表达和永生化细胞的功能，从利用这些细胞不经常匹配与那些在体内研究观察到的获得的数据。肠隐窝化培养最近出现作为评估的肠上皮细胞对不同刺激13的反应的潜在工具。在这个系统中，隐窝干细胞被允许生长和发展三维类器官结构。而类器官培养系统是用于研究肠上皮的许多方面非常有用的，它不模仿免疫细胞，上皮细胞和微生物产品的复杂的相互作用。肠组织的体外培养提供体内宿主防御反应的一个更好的代表性。在该方法中，小肠的部分是在一个细胞培养板机智培养ħ适当的媒体，允许不同类型的肠细胞群是代谢活性为至少48小时。因此，器官的离体培养，可以用于测量抗微生物的基因的表达和肠道的特定刺激宿主防御反应。
调查人员一直在使用体外器官培养系统来研究肠道对15微生物感染的宿主防御反应- 21。我们最近通过了器官培养系统研究抗菌宿主防御反应的炎性体在小鼠结肠22的作用。炎性为胱天蛋白酶-1的激活，这是需要用于生产成熟的IL-1β和IL-18的分子的平台。我们发现，IL-1β和IL-18诱导的抗微生物肽，有效地杀死共生pathobionts诸如大肠杆菌 22增加大肠杆菌的负担是一致的。该系统因此可以被用来研究如炎性肠病（IBD）和结肠直肠癌（CRC）的模式识别受体（的PRRs）等天然免疫分子在肠道抗菌宿主防御反应肠道疾病中的作用，以及发病。有超过200的IBD易感性基因，突变在许多这些基因与在肠道中改变的微生物组合物相关联。这是重要的临床意义，以确定通过其IBD易感基因调节肠道菌群的确切机制。该方法的总体目标是引进体外结肠器官培养的基本协议并展示如何此培养方法可用于研究肠的抗微生物宿主防御反应。
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Protocol
此处描述的所有实验使用维持在无特定病原体（SPF）在动物资源中心（ARC），德克萨斯大学西南医学中心设施6-8周龄雄性野生型（C57BL6 / J）的小鼠中进行。所有研究机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照IACUC的指导方针和健康指南实验动物的护理和使用国家研究院进行的。
1.收集和科隆的制备
- 安乐死用CO 2窒息颈椎脱位的小鼠。
- 喷雾用70％乙醇和小鼠四肢钉到钉板保持鼠标背面向下在黑板上。
- 使用预先灭菌的解剖剪刀和镊子，使得一个中线切口在腹部的腹膜内。通过折叠钳腹膜打开腹部。
- 从腹腔无线除去肠日解剖镊子和剪刀。通过在盲肠的底部，并在直肠的另一端切割分离从小肠结肠。
- 放置在含有冰冷的PBS的无菌培养皿结肠。冲洗用冰 - 冷PBS结肠的腔的用20毫升的注射器保持20G的针或口服灌胃针直至结肠管腔内的大便被完全去除的内容。
- 用剪刀剪纵向结肠。通过在无菌培养皿中冰冷的PBS剧烈摇动洗结肠。
- 切结肠组织成片长大约1厘米长用无菌手术刀或剪刀。
- 记录结肠件的重量。
注：在第1节的所有步骤都可以内部或生物安全柜外进行。一旦冒号准备好培养，所有的步骤必须在生物安全柜内进行，以保持无菌。
2.结肠组织一个文化
- 放置细胞过滤网（100微米）上的6孔细胞培养板。转让所有从一个鼠标收集到的细胞过滤结肠件。
- 添加含5％FBS，青霉素 - 链霉素（1×），和庆大霉素（20微克/毫升）5毫升DMEM / F12培养基。完全覆盖结肠件与媒体。
- 在5％的CO 2和95％空气的培养箱孵育2小时，在37℃。
- 提起细胞过滤器和吸媒体。
- 放置在细胞过滤回井，加入5毫升的新鲜媒体无任何抗生素。提起细胞过滤器和吸媒体。
- 重复上述洗涤步骤（步骤2.5）两次（总共3次）以除去所有的残留抗生素。
- 传送从单细胞过滤结肠件到无菌的12孔细胞培养板的单个孔。
- 添加含5％FBS（没有任何抗生素）的DMEM / F12培养基。调整培养基的体积与weig结肠件HT， 例如 ，100 mg组织1毫升网上平台。在注射5％CO 2和95％空气的培养箱孵育12小时，在37℃。
- 收集培养物上清液在一个无菌1.5毫升管中。
- 离心机在4℃下12000×g离心5分钟。分离上清液到新的1.5毫升试管中的细菌使用杀伤实验和/或其它免疫测定法。上清液可以储存在-80℃直到测定。
- 收集在用于RNA分离的管结肠件。
3. 大肠杆菌的杀灭试验
- 接种大肠杆菌在5mL的Luria-BERTANI（LB）肉汤中15毫升管中并在37℃以200rpm振荡过夜孵育。保持文化管帽略显宽松。
- 离心细菌培养管中，在1200 xg离心在4℃下10分钟。除去上清液和重悬细菌沉淀到5毫升冰冷的PBS。
- 转移1毫升BACT的erial悬挂成600nm的比色皿和测量OD。使用PBS作为空白。
- 计算使用预定标准曲线的菌落形成单位（CFU）。这里，假设1 OD = 2×10 9 CFU /毫升（约）。
- 稀释细菌悬浮液，使纸浆悬浮液1×10 5个/毫升。
- 转移结肠器官培养上清液（500微升/孔）收集在第2.10节到24孔细胞培养板的两个孔。
- 添加10μL的大肠杆菌培养物（1,000 CFU）成一个孔含有500微升结肠器官培养上清液。离开其它公没有任何大肠杆菌接种，以确认该结肠器官培养上清液中不包含任何污染。
- 孵育培养基（DMEM / F12加上5％FBS）中的相同数量的细菌（1,000 CFU）而没有任何抗生素作为对照。
- 孵育在37℃下1小时。
- 将每个样本下拉式无线的50微升SE在麦康凯琼脂平板上。在37℃下孵育MacConkey琼脂平板过夜。
- 计数菌落数并计算CFU /毫升。
4.外在和内在因素对结肠抗菌宿主防御反应的影响
注：抗微生物杀灭试验如这里所描述，可以通过检查的病原相关分子模式（PAMP）和细胞因子对器官培养物上清液的杀菌活性的影响。用IL-1β和IL-18这样的实验的一个例子如下所述。
- 如第1节收集小鼠冒号。
- 放置在无菌纸巾结肠。纵向切开结肠成使用剪刀（ 图2）三个部分。
- 如在第1节中所述洗冰冷PBS结肠的每个部分。
- 切大肠切成小块的每一个部分和无菌权衡。传输各部分的片的结肠成放置在三口井6孔细胞培养板（ 图2）三个独立的细胞过滤器（100微米）。
- 加入2毫升含5％FBS，青霉素 - 链霉素（1×），和庆大霉素（20微克/毫升）的DMEM / F12培养基。
- 在注射5％CO 2和95％空气的培养箱孵育2小时，在37℃。
- 如在2.4-2.6描述洗结肠件。传输单个细胞过滤的结肠件到无菌的12孔细胞培养板的单个孔。含有从单个小鼠的结肠的三个部分的三个孔应被指定为未处理，IL-1β和IL-18（ 图2）。
- 添加含5％FBS（没有任何抗生素）的DMEM / F12培养基。调整培养基的体积与重量的结肠件， 例如 ，用于100 mg组织的1毫升介质。
- 刺激用IL-1β（20毫微克/毫升）或IL-18（20毫微克/毫升）的结肠器官培养12小时。未处理的冒号器官培养作为对照。
- 在注射5％CO 2和95％空气培养箱中在37℃12小时培养后，收集培养物上清液中的无菌1.5mL管中。
- 转移500μL培养上清于24孔板的一式两份孔中。
- 接种大肠杆菌在结肠癌器官培养物上清液的大肠杆菌 （1,000 CFU）如第3.对于每个条件描述的，接种大肠杆菌在单个井。无大肠杆菌另一孔含有相同的器官培养物上清液将作为细菌污染的控制。
- 孵化培养基中的细菌相同量没有任何抗生素作为对照。
- 孵育在37℃下1小时。
- 将每个样品滴在麦康凯琼脂平板50微升。孵育MacConkey琼脂平板过夜，在37℃。
- 计数菌落数并计算CFU /毫升（ 图4）。
- 结肠器官培养的过夜培养（12小时）后，如在第2和4所描述，用2ml冰冷的PBS（2×）洗结肠件。
- 收集结肠片成2毫升RNA酶/ DNA酶无螺丝帽筒。放置管在冰上。
- 加入1毫升的商业Trizol试剂和裂解矩阵珠入管。
- 裂解用自动组织匀浆的组织。
- 收集组织溶解液到一个新的离心管中。
- 使用标准协议分离RNA。
- 测量RNA浓度。
- 用去离子水适当稀释的RNA，并使用500ng的RNA合成cDNA。
- 使用有针对性的抗菌基因，细胞因子，趋化因子和其他感兴趣的基因的实时RT-PCR分析的基因。
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Representative Results
在器官培养冒号的代表性图片示于图1。结肠件在培养保持代谢和生理活性。它们有效地应对加入到培养基外源刺激。结肠组织进行体外培养，并用外源性刺激的刺激， 例如 ，IL-1β和IL-18的制备的示意工作流程，示于图2。在图3中显示，在器官培养冒号表达的抗微生物肽，例如代表数据β防御2（BD2），Reg3γ，S100A8 S100A9，和iNOS响应于IL-1β和IL-18。
通过与器官培养上清培养大肠杆菌的显著降低增长就证明了结肠植入物所释放的介质具有抗菌杀伤作用（
总体而言，这里给出的数据表明， 体外结肠器官培养是一个非常有用的技术，研究在体外肠道抗菌免疫应答。
| GAPDH_F | TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC |
| GAPDH_R | AAGATGGTGATGGGCTTCCCG |
| β防御素2（BD2）_F | TGACCACTGCCACACCAATG |
| β防御素2（BD2）_R | CCTGGCAGAAGGAGGACAAA |
| Reg3γ_F | CAAGGTGAAGTTGCCAAGAA |
| Reg3γ_R | CCTCTGTTGGGTTCATAGCC |
| S100a8_F | TGTCCTCAGTTTGTGCAGAATATAAA |
| S100a8_R | TCACCATCGCAAGGAACTCC |
| S100a9_F | GGTGGAAGCACAGTTGGCA |
| S100a9_R | GTGTCCAGGTCCTCCATGATG |
| iNOS_F | TGTGACACACAGCGCTACAACA |
| iNOS_R | GAAACTATGGAGCACAGCCACAT |
表1：用于实时PCR的引物小鼠列表。
图1：小鼠结肠件在培养代表性图片。 （A）的上放置在6孔板细胞过滤网（100微米）结肠件孵化。结肠片浸没在补充有抗生素的2毫升培养基。 （B）按照2小时温育后，结肠片转移到含有无抗生素的培养基中一个新的12孔细胞培养板的孔中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：对结肠组织的制备和体外刺激的IL-1β和IL-18中的步骤示意图介绍。从一个鼠标结肠是隆基 tudinally分割成三个部分。每个部分被切成小片并称重。从结肠的每个部分的结肠片转移到放置在含2ml DMEM / F12培养基加5％FBS和抗生素的一个6孔板的孔中的细胞过滤器。以下一个2小时温育后，从单个细胞过滤结肠件被转移到12孔细胞培养板的单个孔。的DMEM / F12加上5％FBS（无抗生素）根据组织的重量（1毫升介质100毫克组织）加入到每个孔中并在介质的体积进行调节。结肠组织受到刺激用IL-1β（20纳克/ ml）和IL-18（20毫微克/毫升）12小时。培养物上清液进行离心，用于大肠杆菌杀伤实验和/或其它免疫测定法。结肠组织被收集到商用胰蛋白酶试剂用于RNA分离和实时PCR的抗微生物的基因表达的随后的分析。.JPG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：鼠标结肠组织细胞因子表达抗菌肽在体外培养过程中响应IL-1β或IL-18。结肠器官培养物与IL-1β（20纳克/ ml）或IL-18（20毫微克/毫升）12小时的刺激。通过实时RT-PCR（ 表1）测定BD2，Reg3γ，S100A8 S100A9，和iNOS的表达。数据表示平均值±SD; * P <0.05，** P <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：小鼠结肠器官崇拜的上清液URE具有杀菌活性。结肠片在体外培养在12小时的存在或不存在IL-1β（20毫微克/毫升）或IL-18（20毫微克/毫升）的。将500μl培养物上清液，在37℃下用大肠杆菌 （1,000 CFU）温育1小时。无大肠杆菌结肠器官培养上清液也温育作为对照。以下1小时温育后，各样品的50μL的被放置在MacConkey琼脂平板上滴加，并在37℃保温过夜。 （A）E.图片大肠杆菌在MacConkey琼脂菌落显示结肠器官培养的抗菌活性。 （B）的大肠杆菌计数表示杀死的IL-1β-和IL-18处理的结肠器官培养物上清液的效率。 MacConkey琼脂板（C）的照片表示在结肠器官培养无细菌生长而不大肠杆菌一起温育。 （ 四 ）无大肠杆菌菌落结肠器官C中所确定ulture孵育无大肠杆菌 ，表明没有在样品中的任何污染的细菌。数据表示平均值±SD; ** P <0.01，*** P <0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
肠上皮细胞在它们的生长方面的要求非常敏感，因此，难以培养。用EDTA处理分离的上皮细胞不以常规的细胞培养基如DMEM 8生存。因此，使用隔离隐窝或主要上皮细胞宿主 - 病原体相互作用的研究是非常具有挑战性的。最近，Sato等人。描述的地穴化培养系统，这是非常有前途的和有用的相关肠道病理生理学研究13。而组织体代表肠隐窝的许多特征，有人担心作为对类器官细胞，这是在无菌环境中正在生长的免疫应答是否概括体内肠上皮细胞的反应。上皮干细胞和昂贵的试剂对组织体的文化需求的分离培养所需要的精确技术可以防止马采取这一制度的优势纽约实验室。而采用体外器官培养的不是化培养的替代，该系统提供了一种简单而廉价的方法来研究肠上皮细胞抗菌反应。
该技术的主要优点是，虽然在碗碟培养肠的组织结构被维持。我们观察到结肠组织对他们的培养后至少24小时的生理活性。在结肠的培养，结肠上皮细胞外源性刺激由细胞因子和抗微生物肽的表达测定响应。在完整的组织的上皮细胞的生存力可以通过在培养基中加入适当的生长因子和细胞死亡的抑制剂进一步增强。以前的报告表明，正常人结肠组织器官可以维持离体数天8 SUP>，23，24。
对小鼠结肠器官的离体培养的协议可以具有相关的肠上皮的抗微生物免疫应答的研究有许多应用。病原体和它们的的PAMP通过的PRR诸如Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRS）存在于上皮细胞和免疫细胞识别。有缺陷的表达和许多Toll样受体和NLRS的功能与易患IBD，结肠肿瘤发生和细菌感染有关。由于上皮永生细胞系并不代表肠道利基的所有功能， 体外结肠器官培养是一个非常有用的实验工具。使用该系统，我们可以检查各种的PAMP或刺激对抗菌效应分子在肠上皮细胞的诱导的影响。在代表性的实验，我们发现，细胞因子如IL-1β和IL-18触发的抗微生物肽的表达（ 图3）。我们这里还表明，结肠组织产生的抗微生物肽能有效地杀灭大肠杆菌 （ 图4）。这些技术可应用于测试脂多糖（LPS）（MDP）在肠道抗菌宿主防御反应的影响，肽聚糖（PGN），muramyldipeptide，和其它的PAMP。
我们已稍加修改如前面12，16，20，25中描述的结肠器官培养协议。我们在两个阶段培养的结肠。起初，我们培养在含有培养基2小时抗生素的结肠组织。然后，我们用冒号件接着保温用抗生素自由媒体反复冲洗去除抗生素。因此，从过夜的培养物中获得的培养物上清液结肠展品只有当大肠杆菌培养分泌抗菌肽的效果。这种方法可以用于上看到的任何感兴趣的细菌结肠或肠衍生的抗微生物肽的杀菌效果。合适的选择性琼脂培养基应该用于培养细菌。
像大多数技术，有体外器官培养系统的局限性。首先，与细胞培养物或类器官培养，器官不生长和增殖，因此不能进行扩展。第二，肠上皮细胞是非常敏感的，它们相对快地死无额外的生长因子和细胞凋亡抑制剂，其用于隐窝类器官培养。第三，从器官培养中观察到的免疫应答是不同种类的细胞群的集体反应。因此，在抗微生物和效应基因的表达个别细胞类型的作用不能进行评估。 Additionally，不像在细胞系和类器官培养，抗微生物肽和在冒号其它效应分子的表达可能会发生变化，从小鼠到相同遗传背景的小鼠。
总之，我们在这里描述用于离体结肠器官培养一个简单的协议，是研究肠抗微生物免疫应答非常有用的。这种方法可以采用通过培养来自感兴趣遗传突变小鼠冒号来测试在抗微生物肽的表达多样先天免疫基因的作用。此外，该协议可以适于在临床研究中使用通过进行结肠活组织检查样品的器官培养检查IBD患者的肠微生物的反应。
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Acknowledgments
癌症预防和得克萨斯州的研究所（CPRIT; RP160169）和德克萨斯大学西南医学中心给MHZ，这项工作是由来自克隆氏病和美国结肠炎基金会（CCFA 3711）资金支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 ml Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100 mm x 15 mm Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
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